本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，涉及葡萄組織瞬時轉(zhuǎn)化
技術領域：
，具體涉及一種快速高效地在葡萄中瞬時轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)化方法。
背景技術：
：葡萄是多年生藤本落葉植物，生長期長且高度雜合，品質(zhì)優(yōu)良的葡萄品種主要依靠無性方式進行繁殖，而且一些品種攜帶有害等位基因易出現(xiàn)近交衰退，且相關品質(zhì)性狀遺傳方式尚不清楚、雜交后代分子標記輔助篩選困難，使得利用傳統(tǒng)方法選育優(yōu)質(zhì)抗病葡萄品種時周期長且操作困難。而一些重要的性狀是由單一基因顯性遺傳，因此葡萄分子生物學相關研究為葡萄有利基因的挖掘和隨之而來的品質(zhì)改良開辟了新的途徑。利用分子生物學進行有利基因的挖掘是建立在對有利基因功能鑒定的基礎之上的，而基因功能的鑒定又離不開正反向遺傳學中利用遺傳轉(zhuǎn)化進行相應基因功能的鑒定。但是葡萄的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術手段目前極不成熟，周期很長，因此相對較容易實現(xiàn)的葡萄瞬時轉(zhuǎn)化技術在葡萄分子生物學和遺傳育種學的研究其基因功能有重要應用價值。目前用于植物組織的瞬時轉(zhuǎn)化方法主要包括基因槍法和農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒法?；驑尫ㄓ址Q粒子轟擊等，將直徑4um的鎢粉或金粉在供體DNA中浸泡，然后用基因槍將這些粒子打入細胞、組織或器官中，具有一次處理多個細胞的優(yōu)點，但轉(zhuǎn)化效率較低，成本較高，穩(wěn)定性差，易出現(xiàn)沉默現(xiàn)象等。農(nóng)桿菌介導的方法是將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移和整合。農(nóng)桿菌介導法的轉(zhuǎn)化效率較高，可以導入的DNA片段較大，表達效果較好，方法和使用的儀器簡單，費用較低。不管是基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化都面臨一個轉(zhuǎn)化成功率的問題?；蜣D(zhuǎn)化的成功率受很多因素的調(diào)控。對農(nóng)桿菌介導的瞬時遺傳轉(zhuǎn)化主要受轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌菌株，目標植物的基因型，植物受侵染的部位，農(nóng)桿菌侵染濃度和時間，侵染后共培養(yǎng)的溫度、濕度、PH值等因素的影響，因而過程非常復雜。除了上述因素以外，農(nóng)桿菌介導的瞬時轉(zhuǎn)化還受到一些誘導物和抑制物質(zhì)的影響。如p19基因是一個非常特殊的抑制因子，它分離于番茄叢矮病毒(Tomatobushystuntvirus，TBSV)，編碼一個19kD的多功能蛋白質(zhì)。在瞬時表達實驗中，p19則可以對RNA沉默起抑制作用，因而極大了提高了瞬時轉(zhuǎn)化的效率。在瞬時轉(zhuǎn)化過程中，農(nóng)桿菌如何進入細胞也是一個很重要的問題。到目前為止，一般采用高壓的方法將農(nóng)桿菌浸入細胞。根據(jù)目標植物組織覆蓋蠟質(zhì)的量和角質(zhì)層的厚度，采用不同的方法進行高壓浸入。如對含蠟質(zhì)較少的煙草葉片，采用無針頭針管注入的方式；對含蠟質(zhì)較多的組織，則一般采用高壓真空泵抽氣輔助農(nóng)桿菌菌液進入細胞中。但總的來說，高壓處理是在破壞細胞膜的情況下將農(nóng)桿菌菌液浸入植物細胞。長時間的高壓處理可以導致植物膜結(jié)構大規(guī)模的破壞，最終使植物細胞死亡，遺傳轉(zhuǎn)化失敗。因而高壓處理的方式也對葡萄瞬時轉(zhuǎn)化的效率起著至關重要的作用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種快速高效地在葡萄中瞬時轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)化方法，本發(fā)明的技術方案可以縮短轉(zhuǎn)化操作的時間，提高轉(zhuǎn)化的效率，可以解決葡萄分子生物學研究中存在的難以在同源生物體中驗證基因功能，以及由于葡萄轉(zhuǎn)基因技術不成熟而導致的成功率低、操作復雜和耗時等問題。為達到解決上述技術問題的目的，本發(fā)明采用以下技術方案予以實現(xiàn)：本發(fā)明提供了一種快速高效地在葡萄中瞬時轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)化方法，所述轉(zhuǎn)化方法包括以下步驟：（1）葡萄組培苗的培養(yǎng)：剝?nèi)∑咸训那o尖生長點，置于組培苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)5周獲得5周齡的葡萄組培苗；（2）侵染菌液的制備：將農(nóng)桿菌菌株和p19菌株分別置于含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中進行恢復培養(yǎng)；將恢復培養(yǎng)后的菌液轉(zhuǎn)移至含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)；將擴培的菌液離心，去除上清液；將沉淀以懸浮液懸浮并培養(yǎng)菌液；然后將獲得的農(nóng)桿菌菌液與p19菌液等體積混勻后，搖勻得到混合菌液備用；（3）農(nóng)桿菌對葡萄組培苗組織的侵染：從所述5周齡的葡萄組培苗中選擇葉片，將葉片表面扎若干小孔，置于裝有所述混合菌液的注射器中；封注射器口，迅速拉至最大刻度處，反復抽拉直至菌液完全浸入葉片，侵染后的葉子呈半透明狀態(tài)；（4）農(nóng)桿菌侵染后的培養(yǎng)：拭去葡萄葉片上殘留的菌液，置于濕潤的雙層脫脂棉中，密封保持濕度，并扎小孔透氣；經(jīng)過培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因材料。進一步的：所述步驟（2）中農(nóng)桿菌菌株為含35S::GFP質(zhì)粒的GV3101菌株。進一步的：所述步驟（2）中恢復培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)的條件為在28℃，250轉(zhuǎn)/分鐘的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進一步的：所述步驟（2）中農(nóng)桿菌的懸浮液配方為：pH5.6的10mMMES，10mMMgCl2，質(zhì)量體積比為2％的蔗糖，150μM乙酰丁香酮。進一步的：所述步驟（2）中將以懸浮液懸浮后獲得的菌液培養(yǎng)至600nm波長下光密度值達到0.6。進一步的：所述步驟（3）中選擇處于第3、4葉位的葉片。進一步的：所述步驟（3）中注射器的容量為50ml。進一步的：所述步驟（4）中經(jīng)過黑暗培養(yǎng)12h和光照培養(yǎng)4-5d獲得轉(zhuǎn)基因材料。進一步的：所述步驟（4）中光照培養(yǎng)的條件為：26℃，2000Lux光照14h/黑暗10h。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：1、本發(fā)明將含35S::GFP質(zhì)粒的GV3101農(nóng)桿菌菌液與P19菌液等體積混合后進行植物組織侵染。有效地利用了p19對RNA沉默的抑制作用，極大了提高了葡萄組培葉片瞬時轉(zhuǎn)化的效率。2、本發(fā)明采用50ml注射器，利用抽拉注射器制造高壓，促進菌液進入植物細胞。比傳統(tǒng)的高壓真空泵抽氣制造高壓，操作起來簡單易行，效果明顯，造價低廉。3、本發(fā)明選擇5周齡的葡萄組培苗中處于第3、4葉位的葉片，將葉片表面扎若干小孔后，再進行菌液侵染。這種葉位的葡萄組培苗葉片既生長到了一定的面積，足夠進行轉(zhuǎn)基因工作完成后的后續(xù)鑒定和下游基因表達量的鑒定。同時這個葉位的葉片又不至于過于成熟，以致積累過多的蠟質(zhì)，導致農(nóng)桿菌菌液浸入困難。4、在構建重組載體時，選擇含有35S::GFP的質(zhì)粒，便于后期進行轉(zhuǎn)基因效果的鑒定。附圖說明圖1是本發(fā)明中5周齡的葡萄“左優(yōu)紅”組培苗。圖2是本發(fā)明中注射器法無法實現(xiàn)對葡萄組培苗根部組織的侵染。圖3是本發(fā)明中注射器法無法實現(xiàn)對葡萄組培苗莖的侵染。圖4是本發(fā)明中注射器法處理葡萄組培苗組織的演示圖。圖5是本發(fā)明中采用注射器法處理的葡萄組培苗葉片。圖6是本發(fā)明中采用真空泵法處理的葡萄組培苗葉片。圖7是本發(fā)明中真空泵法和注射器法處理葡萄組培葉片后的效果對比。圖8是本發(fā)明中農(nóng)桿菌侵染后，培養(yǎng)狀態(tài)下的葡萄組培苗葉片。圖9是本發(fā)明中培養(yǎng)4天后的葡萄葉片瞬時轉(zhuǎn)化效果的PCR鑒定。圖10是本發(fā)明中培養(yǎng)5天后的葡萄葉片瞬時轉(zhuǎn)化效果的PCR鑒定。圖11是本發(fā)明中五周齡的葡萄“赤霞珠”組培苗。圖12是本發(fā)明中農(nóng)桿菌侵染后，培養(yǎng)了3-5天后的葡萄組培苗葉片。圖13是本發(fā)明中以重組載體中的GFP為標簽，用PCR對培養(yǎng)4天的葡萄葉片瞬時轉(zhuǎn)化效果的驗證。其中陽性對照是含35S::GFP的空質(zhì)粒，陰性對照是用H2O代替DNA的擴增樣品。具體實施方式以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步的說明。實施例1本發(fā)明所述快速高效地在葡萄中瞬時轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)化方法具體包括如下步驟：1、葡萄組培苗的培養(yǎng)：將市售葡萄品種“左優(yōu)紅”的幼嫩組織從大田取回，消毒水處理后，在超凈工作臺上剝?nèi)∏o尖生長點，進行組織培養(yǎng)。葡萄組培苗培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基，配方為：NH4NO333000mg/L、KNO338000mg/L、CaCl2?2H2O8800mg/L、MgSO4?7H2O7400mg/L、KH2PO43400mg/L、KI166mg/L、H3BO31240mg/L、MnSO4?4H2O4460mg/L、ZnSO4?7H2O1720mg/L、Na2MoO4?2H2O50mg/L、CuSO4?5H2O5mg/L、CoCl2?6H2O5mg/L、FeSO4?7H2O5560mg/L、Na2-EDTA?2H2O7460mg/L、肌醇20000mg/L、煙酸100mg/L、鹽酸吡哆醇（維生素B6）100mg/L、鹽酸硫胺素（維生素B1）20mg/L、甘氨酸400mg/L。培養(yǎng)5周后，待用。五周齡的葡萄“左優(yōu)紅”組培苗如圖1所示。2、侵染菌液的制備：（1）將保存于-80℃的含35S::GFP質(zhì)粒的GV3101農(nóng)桿菌菌株和p19菌株（購自生物工程公司）于3毫升含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，在28℃，250轉(zhuǎn)/分鐘下的振蕩培養(yǎng)箱中恢復培養(yǎng)10-12個小時。培養(yǎng)農(nóng)桿菌所用的YEB液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物1g/L，蔗糖5g/L，MgSO4?7H2O0.5g/L，pH7.0。分裝后121℃高壓滅菌20min，待冷卻至室溫后加入50mg/L過濾滅菌的卡那霉素和利福平。（2）恢復培養(yǎng)后，將它們轉(zhuǎn)移至50毫升含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，置于28℃，250轉(zhuǎn)/分鐘的振蕩培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)10小時。（3）擴搖的菌液于離心機中在5000轉(zhuǎn)/分鐘的速度下離心15分鐘，去除上清液。（4）將沉淀以懸浮液懸浮，置于28℃、250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)菌液至600nm波長下光密度值達到0.6。將含有重組質(zhì)粒的GV3101菌液與經(jīng)過同等情況處理（將p19菌株經(jīng)過如上述農(nóng)桿菌菌株同樣的操作）的P19菌液等體積混勻后，置于28℃搖床輕搖20分鐘備用。農(nóng)桿菌的懸浮液配方為：10mMMES（pH5.6），10mMMgCl2，2％(w/v)蔗糖，150μM乙酰丁香酮。3、農(nóng)桿菌對葡萄組培苗組織的侵染：從培養(yǎng)5周齡的葡萄組培苗中選擇處于第3、4葉位的葉片。除葉片外的其他組織（如根和莖）用此種技術則難以實現(xiàn)菌液的浸入，如圖2、圖3和表1所示。將葉片表面扎若干小孔后，置入裝有30ml混合菌液的50ml注射器中，如圖4所示。封注射器口，迅速拉至最大刻度處。反復3-5次，直至菌液完全進入。當菌液完全浸入葉片后，侵染后的葉子呈半透明狀態(tài)。在這個過程中，除了注射器法還可以用真空泵法如圖5和圖6所示，但用注射器法達到的效果要遠優(yōu)于真空泵法，如圖7和表2所示。表1相同濃度的菌液對不同葡萄組織處理后的效果對比不同器官葉片莖根陽性率80%00表2采用真空泵法和注射器法處理葡萄組培葉片的效果對比抽真空方式真空泵注射器陽性率080%4、農(nóng)桿菌侵染后的培養(yǎng)：（1）如圖8所示，用滅過菌的濾紙拭去植物組織上殘留的菌液，并置于濕潤的雙層脫脂棉中，用保鮮膜封住瓷盤，以保持濕度，并扎小孔透氣。（2）將瓷盤置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)12h之后，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-5d，光照培養(yǎng)箱條件設置為：26℃，2000Lux光照14h/黑暗10h。（3）培養(yǎng)4-5天后將轉(zhuǎn)基因材料用液氮冷凍后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用重組質(zhì)粒中帶有的GFP為標簽進行PCR驗證，不同培養(yǎng)天數(shù)葉片的轉(zhuǎn)基因效果分別如圖9和圖10所示。實施例2本發(fā)明所述基因快速高效地在葡萄中瞬時轉(zhuǎn)化的方法具體包括如下步驟：1、葡萄組培苗的培養(yǎng)：將市售葡萄品“赤霞珠”的幼嫩組織從大田取回，消毒水處理后，在超凈工作臺上剝?nèi)∏o尖生長點，進行組織培養(yǎng)。葡萄組培苗培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基，配方為：NH4NO333000mg/L、KNO338000mg/L、CaCl2?2H2O8800mg/L、MgSO4?7H2O7400mg/L、KH2PO43400mg/L、KI166mg/L、H3BO31240mg/L、MnSO4?4H2O4460mg/L、ZnSO4?7H2O1720mg/L、Na2MoO4?2H2O50mg/L、CuSO4?5H2O5mg/L、CoCl2?6H2O5mg/L、FeSO4?7H2O5560mg/L、Na2-EDTA?2H2O7460mg/L、肌醇20000mg/L、煙酸100mg/L、鹽酸吡哆醇（維生素B6）100mg/L、鹽酸硫胺素（維生素B1）20mg/L、甘氨酸400mg/L。培養(yǎng)5周后，待用。五周齡的葡萄“赤霞珠”組培苗如圖11所示。2、侵染菌液的制備：（1）將保存于-80℃的含35S::GFP質(zhì)粒的GV3101農(nóng)桿菌菌株和p19菌株于3毫升含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，在28℃，250轉(zhuǎn)/分鐘下的振蕩培養(yǎng)箱中恢復培養(yǎng)10-12個小時。實驗中p19菌株對葡萄組培苗葉片轉(zhuǎn)化效果的影響如表3所示。培養(yǎng)農(nóng)桿菌所用的YEB液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物1g/L，蔗糖5g/L，MgSO4?7H2O0.5g/L，pH7.0。分裝后121℃高壓滅菌20min，待冷卻至室溫后加入50mg/L過濾滅菌的卡那霉素和利福平。表3實驗中p19菌株對葡萄組培苗葉片轉(zhuǎn)化效果的影響是否加p19菌株否是陽性率080%（2）恢復培養(yǎng)后，將他們轉(zhuǎn)移至50毫升含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，置于28℃，250轉(zhuǎn)/分鐘的振蕩培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)10小時。（3）擴搖的菌液于離心機中在5000轉(zhuǎn)/分鐘的速度下離心15分鐘，去除上清液。（4）將沉淀以懸浮液懸浮，置于28℃、250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)菌液至600nm波長下光密度值達到0.6。不同菌液濃度處理葡萄組培葉片后的效果對比如表4所示。將含有重組質(zhì)粒的GV3101菌液與經(jīng)過同等情況處理的P19菌液等體積混勻后，置于28℃搖床輕搖20分鐘備用。農(nóng)桿菌的懸浮液配方為：10mMMES（pH5.6），10mMMgCl2，2％(w/v)蔗糖，150μM乙酰丁香酮。表4不同菌液濃度處理葡萄組培葉片后的效果對比菌液濃度（OD600）0.50.6陽性率40%80%3、農(nóng)桿菌對葡萄組培苗組織的侵染：（1）從培養(yǎng)5周齡的葡萄組培苗中選擇處于第3、4葉位的葉片，將葉片表面扎若干小孔后，置入裝有30ml混合菌液的50ml注射器中。（2）封注射器口，迅速拉至最大刻度處。反復3-5次，直至菌液完全進入。當菌液完全進入后，葉子呈半透明狀態(tài)。4、農(nóng)桿菌侵染后的培養(yǎng)：（1）用滅過菌的濾紙拭去植物組織上殘留的菌液，并置于濕潤的雙層脫脂棉中，用保鮮膜封住瓷盤，以保持濕度，并扎小孔透氣。（2）如圖12所示，將瓷盤置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)12小時之后，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5天，光照培養(yǎng)箱條件設置為：26℃，2000Lux光照14小時/黑暗10小時。（3）培養(yǎng)3-5天后將轉(zhuǎn)基因材料用液氮冷凍后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。不同培養(yǎng)天數(shù)對瞬時轉(zhuǎn)化效果的影響如表5所示。采用重組質(zhì)粒中帶有的GFP為標簽進行PCR驗證。如圖13所示，進行PCR驗證時以含35S::GFP的空質(zhì)粒作為陽性；用H2O代替DNA的擴增樣品作為陰性對照。表5不同培養(yǎng)天數(shù)對瞬時轉(zhuǎn)化效果的影響培養(yǎng)時間（d）345陽性率14%80%60%以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術方案的精神和范圍。當前第1頁1 2 3