本發(fā)明涉及一種化合物及其分離純化方法。
背景技術(shù)：
：半夏為天南星科半夏屬植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit的干燥塊莖?；⒄茷樘炷闲强瓢胂膶僦参锘⒄芇inelliaePedatisectaSchott的干燥塊莖。半夏的偽品較多，主要有天南星科的虎掌、天南星、水半夏等，藥材經(jīng)加工處理后，外觀與半夏極為相似，鑒別難度大，不法商販常在半夏中添加這幾種藥材，非法謀取利益，嚴(yán)重?fù)p害半夏種植戶、半夏飲片生產(chǎn)企業(yè)利益，同時(shí)也嚴(yán)重影響半夏藥材質(zhì)量、療效及用藥安全。目前，虎掌是半夏中常見的摻偽品，半夏與虎掌藥材的鑒別方法主要是性狀鑒別，但鑒別難度非常大。半夏與虎掌屬同科同屬植物，虎掌因有較多小塊莖，形似“虎掌”而得名。不乏商販為了謀取利益，將虎掌加工后經(jīng)過篩選、打磨，原有的子塊莖特征不明顯，與半夏非常相似，難以鑒別；如果炮制成飲片，幾乎無法通過性狀進(jìn)行鑒別。目前在半夏與虎掌的性狀鑒別方面，仍然存在很多問題，傳統(tǒng)認(rèn)為半夏是球形或橢圓形，一般沒有子塊莖的，但栽培半夏存在栽培變異，一些栽培半夏藥材是具有子塊莖的，這就造成了通過子塊莖的有無來鑒別半夏與虎掌，存在鑒別不準(zhǔn)確的問題，有些通過子塊莖的個(gè)數(shù)來判斷半夏與虎掌(多于3個(gè)判定為虎掌)，這樣的方法依然不夠嚴(yán)謹(jǐn)。目前沒有水麥冬酸的提取分離方法的報(bào)道，僅有文獻(xiàn)報(bào)道水麥冬的花中存在水麥冬苷，通過水解可以得到水麥冬酸，但并未公開有水麥冬酸標(biāo)準(zhǔn)品以及提取分離純化方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服上述問題，發(fā)明人首次在虎掌中發(fā)現(xiàn)了水麥冬酸，并將其用于半夏和虎掌的鑒別。本發(fā)明提供了一種從虎掌中分離純化水麥冬酸方法，它包括如下步驟：a、取虎掌藥材，粉碎，加水混勻，超聲提?。籦、提取液濾過，濾液加磷酸，用乙酸乙酯萃??；c、取乙酸乙酯層加壓濃縮至干，加水稀釋過濾得水溶液；d、將水液上C18制備柱，流動(dòng)相采用3-5％乙腈加0.2％磷酸進(jìn)行洗脫，流速：140ml/min，210nm監(jiān)測(cè)，分段收集洗脫液；e、將洗脫液濃縮；f、將濃縮液繼續(xù)上C18制備柱，流動(dòng)相采用3-5％乙腈加0.1％甲酸進(jìn)行洗脫，流速：140ml/min，210nm監(jiān)測(cè)，收集洗脫液；冷凍干燥，得到白色固體，即為本發(fā)明化合物。進(jìn)一步優(yōu)選地，它包括如下步驟：a、取虎掌藥材100g，粉碎，加水1000ml混勻，超聲提取3次，每次1h；b、合并提取液，濾過，濾液加磷酸30ml，用乙酸乙酯萃取3次；c、乙酸乙酯層加壓濃縮至干，加水稀釋過濾得水溶液；d、將水液上C18制備柱，流動(dòng)相采用3-5％乙腈(加0.2％磷酸)進(jìn)行洗脫，流速：140ml/min，210nm監(jiān)測(cè)，分段收集洗脫液；e、將洗脫液濃縮；f、將濃縮液繼續(xù)上C18制備柱，流動(dòng)相采用3-5％乙腈(加0.1％甲酸)進(jìn)行洗脫，流速：140ml/min，210nm監(jiān)測(cè)，收集洗脫液；冷凍干燥，得到白色固體，即得本發(fā)明化合物。其中，所述的C18柱的規(guī)格為：XB-C18，80*250mm，10μm。其中，步驟d中所述的流動(dòng)相采用5％乙腈(加0.2％磷酸)，收集出峰時(shí)間19～23min的洗脫液。其中，步驟d中所述的流動(dòng)相采用3％乙腈(加0.2％磷酸)，收集出峰時(shí)間大于30min的洗脫液。其中，步驟f中流動(dòng)相采用5％乙腈(0.1％甲酸)，收集出峰時(shí)間17～21min的洗脫液。其中，步驟f中流動(dòng)相采用3％乙腈(加0.1％甲酸)，收集出峰時(shí)間大于30min的洗脫液。本發(fā)明從虎掌中提取分離水麥冬酸的方法，步驟簡(jiǎn)單，制備得到的水麥冬酸純度較高；水麥冬酸用于鑒別半夏中是否有虎掌摻偽，若含有水麥冬酸則含有虎掌摻偽。鑒別過程簡(jiǎn)單快捷有效，可用于虎掌的鑒別，以及半夏中摻偽虎掌的鑒別，虎掌經(jīng)炮制后依舊可以鑒別，方法穩(wěn)定可靠。附圖說明圖1本發(fā)明化合物1H-NMR圖圖2本發(fā)明化合物13C-NMR圖圖3本發(fā)明化合物HPLC圖譜圖4全波長(zhǎng)掃描圖圖5水麥冬酸對(duì)照品HPLC圖譜圖610份不同來源半夏樣品HPLC圖譜圖7不同來源虎掌樣品HPLC圖譜具體實(shí)施方式試驗(yàn)例1本發(fā)明化合物提取分離方法1、取虎掌藥材，粉碎，加水混勻，超聲提取3次；2、合并提取液，濾過，濾液加酸，用乙酸乙酯萃取3次；3、乙酸乙酯層加壓濃縮至干，加水稀釋過濾得水溶液；4、將水液上C18制備柱，流動(dòng)相采用5％乙腈(加0.2％磷酸)進(jìn)行洗脫，流速：140ml/min，波長(zhǎng)210nm監(jiān)視，收集洗脫液；5、將洗脫液濃縮；6、將濃縮液繼續(xù)上C18制備柱，流動(dòng)相采用5％乙腈(加0.1％磷酸)進(jìn)行洗脫，流速：140ml/min，波長(zhǎng)210nm監(jiān)視，收集洗脫液，冷凍干燥，得到白色固體。其中，流動(dòng)相和洗脫液的選擇如下：本品為白色粉末，經(jīng)分析其分子式為C7H8O6，1H-NMR(見圖1)13C-NMR(見圖2)經(jīng)NMR分析，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定該化合物為水麥冬酸。純度分析：對(duì)制備的水麥冬酸純度進(jìn)行分析，條件為：儀器：漢邦HPLC色譜儀；色譜柱：AgilentEclipsePlus-C18，4.6*250mm，5μm；流動(dòng)相：乙腈-0.2％磷酸水溶液(5：95)；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測(cè)器：UV-210nm；配制濃度：1.0mg/ml經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，本發(fā)明方法制備的水麥冬酸的純度達(dá)到了98％以上。(見圖3)實(shí)施例2本發(fā)明半夏、虎掌的鑒別方法1、對(duì)照品溶液的制備取水麥冬酸對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，制成濃度為0.05mg/ml的溶液。2、供試品溶液的制備取半夏或虎掌藥材粉末1g，加水20ml，超聲提取30min以上，濾過或離心，取澄清提取液10ml，加磷酸0.1ml，乙酸乙酯萃取4次，每次20～30ml，回收乙酸乙酯，殘?jiān)?ml流動(dòng)相溶解，過微孔濾膜，即得。3、色譜條件流動(dòng)相：A(乙腈)-B(0.1％磷酸)(3:97)色譜柱：AgilentZORBAXEclipsePlusC18液相色譜柱(4.6×250mm，5μm)流速：0.8ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm柱溫：40℃進(jìn)樣量：20ul4、結(jié)果半夏HPLC圖譜中不含有水麥冬酸，虎掌HPLC圖譜中含有水麥冬酸。實(shí)施例3本發(fā)明提取方法條件篩選試驗(yàn)1、提取方法考察(1)提取溶劑用量稱取虎掌樣品1g，分別加水20ml、30ml、40ml，超聲提取，分別取10ml澄清提取液，加酸0.1ml，乙酸乙酯萃取，回收溶劑，用5ml流動(dòng)相溶液溶解，過微孔濾膜，高效液相色譜儀檢測(cè)。表3提取溶劑用量考察水用量20ml30ml40ml水麥冬酸峰面積16210270換算峰面積162153140水體積為20ml時(shí)峰面積最高，提取效果最好。(2)提取時(shí)間的考察稱取虎掌樣品1g，加水20ml，超聲提取，提取時(shí)間分別為30min、45min、60min，分別取10ml澄清提取液，加酸0.1ml，乙酸乙酯萃取，回收溶劑，用5ml流動(dòng)相溶液溶解，過微孔濾膜，高效液相色譜儀檢測(cè)。表4提取時(shí)間考察提取時(shí)間30min45min60min水麥冬酸峰面積86.410191以超聲提取45min峰面積最大，提取效果最好。(3)酸的選擇稱取虎掌樣品1g，加水20ml，超聲提取，取10ml澄清提取液，分別加甲酸、鹽酸、磷酸0.1ml，乙酸乙酯萃取，回收溶劑，用5ml流動(dòng)相溶液溶解，過微孔濾膜，高效液相色譜儀檢測(cè)。表5酸的選擇酸的種類甲酸鹽酸磷酸水麥冬酸峰面積150162168加磷酸后峰面積最大。(4)磷酸用量的考察稱取虎掌樣品1g，加水20ml，超聲提取，取10ml澄清提取液，分別加磷酸0.1ml、0.2ml、0.5ml，乙酸乙酯萃取，回收溶劑，用5ml流動(dòng)相溶液溶解，過微孔濾膜，高效液相色譜儀檢測(cè)。表6磷酸用量的選擇磷酸用量0.1ml0.2ml0.5ml水麥冬酸峰面積140147143考察的3種磷酸用量之間無顯著差異，故加磷酸0.1ml。(5)萃取次數(shù)考察稱取虎掌樣品1g，加水20ml，超聲提取，取10ml澄清提取液，加酸0.1ml，用乙酸乙酯分別萃取1、2、3、4、5次，每次20ml，合并乙酸乙酯，回收溶劑，殘?jiān)?ml流動(dòng)相溶液溶解，過微孔濾膜，高效液相色譜儀檢測(cè)。表7萃取次數(shù)考察萃取次數(shù)12345水麥冬酸峰面積73116142158154萃取4次后，基本可以萃取完全。2、色譜條件的考察(1)檢測(cè)波長(zhǎng)經(jīng)全波長(zhǎng)掃描，水麥冬酸最大吸收波長(zhǎng)為210nm，故檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為210nm(見圖4)。(2)流動(dòng)相考察考察了乙腈-磷酸鹽系統(tǒng)(3:97)、乙腈-磷酸系統(tǒng)(3:97)、乙腈-甲酸系統(tǒng)(3:97)。乙腈-甲酸系統(tǒng)色譜峰峰形較差，基線不平穩(wěn)；乙腈-磷酸鹽系統(tǒng)及乙腈-磷酸系統(tǒng)均可以較好實(shí)現(xiàn)水麥冬酸的鑒別。(3)柱溫的考察分別考察25℃、30℃、35℃、40℃。表8柱溫考察柱溫25℃30℃35℃40℃水麥冬酸峰面積143142144140峰高5.46.37.48.1峰寬0.400.350.300.26對(duì)稱因子0.750.750.750.75柱溫越高，峰高越大，峰寬越窄，而峰面積及對(duì)稱因子無顯著差異，故柱溫選擇40℃。(4)進(jìn)樣量的考察分別考察進(jìn)樣量為5、10、15、20、25ul。表9進(jìn)樣量的考察進(jìn)樣量(ul)510152025水麥冬酸峰面積3772104141174峰高2.14.76.48.110.4進(jìn)樣量越大，峰面積越大，峰高越大。進(jìn)樣量考慮到峰面積、色譜柱的耐用性，選擇了常規(guī)進(jìn)樣量20ul。(5)重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品1.0g，共取5份，精密稱定，制定5份供試品溶液，分別測(cè)定。表10重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性實(shí)驗(yàn)12345RSD％水麥冬酸峰面積140.5145.0141.7143.9146.91.78(6)穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液于不同時(shí)間，分別進(jìn)樣20ul，測(cè)定。表11穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果3、鑒別結(jié)果(1)水麥冬酸對(duì)照品HPLC圖譜(見圖5)(2)10份不同來源半夏樣品HPLC圖譜，半夏中不含有水麥冬酸。(見圖6)(3)不同來源虎掌樣品HPLC圖譜，虎掌中含有水麥冬酸。(見圖7)(3)炮制品的鑒別參照中國(guó)藥典2015年版，將虎掌生品按照與半夏各種炮制品(清半夏、姜半夏、法半夏)相同的炮制方法進(jìn)行處理，得到清半夏、姜半夏、法半夏的偽品炮制品。鑒定結(jié)果同生品一致，偽品炮制品依然含有水麥冬酸。通過以上鑒別，找到了虎掌區(qū)別于半夏的特征成分水麥冬酸，可有效的用于虎掌鑒別，也可用于半夏生品或炮制品中摻偽虎掌的情況。當(dāng)前第1頁1 2 3