本發(fā)明涉及一種a-酮戊二酸的分離純化方法，具體涉及一種針對(duì)L-谷氨酸經(jīng)過(guò)L-谷氨酸氧化酶的轉(zhuǎn)化制備a-酮戊二酸時(shí)，對(duì)a-酮戊二酸的分離純化方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
L-谷氨酸氧化酶（EC 1.4.3.11，L-glutamate oxidase，GLOD）是以黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）為輔酶的一種L-氨基酸氧化酶，是80年代初開(kāi)始發(fā)現(xiàn)的一種新酶，最早從蛇的毒液、鼠的腎臟、無(wú)脊椎動(dòng)物和微生物等生物體中分離純化得到。L-谷氨酸氧化酶能在不添加外源性輔助因子的條件下氧化L-谷氨酸脫氨，生成α-酮戊二酸和過(guò)氧化氫。GLOD 對(duì)催化反應(yīng)底物有高度的立體異構(gòu)選擇性，催化效率高，反應(yīng)條件溫和，已被廣泛用于食品、輕工、化工、醫(yī)藥、環(huán)保、能源和科研等各個(gè)領(lǐng)域。該酶自 20 世紀(jì) 80 年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直是工具酶研究的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)階段酶的主要研究集中在，一是借由現(xiàn)代的觀察及測(cè)定手段研究酶的結(jié)構(gòu)以及作用機(jī)制，二是利用酶的特性以及工程學(xué)的方法研究如何利用酶來(lái)服務(wù)于人類的生產(chǎn)、生活。
近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家先后分別從土壤中分離到能產(chǎn)生 GLOD 的鏈霉菌、放線菌，并建立了較完善的液體發(fā)酵產(chǎn)酶體系，制備了 GLOD 粗品，通過(guò)對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，純化得到的該酶都具有以下特性： 能專一性地催化L-谷氨酸生成過(guò)氧化氫、氨和a-酮戊二酸。目前，GLOD 發(fā)酵生產(chǎn)距工業(yè)化生產(chǎn)還有很大距離，這在很大程度上限制了其應(yīng)用。因此需要進(jìn)一步研究其發(fā)酵工藝，通過(guò)工藝優(yōu)化，改進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，創(chuàng)造適合菌體生長(zhǎng)和生物代謝的最佳條件，充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力，顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量。
L-谷氨酸氧化酶一方面可以應(yīng)用到測(cè)定 L-谷氨酸及其偶聯(lián)反應(yīng)；另一方面則可以用于a-酮戊二酸的制備，進(jìn)而制備L-谷氨酸-a-酮戊二酸。國(guó)內(nèi)目前為止還沒(méi)有廠家對(duì)其進(jìn)行生產(chǎn)，國(guó)外也只有一家生產(chǎn)重組于大腸桿菌的 L-谷氨酸氧化酶。價(jià)格的昂貴、來(lái)源的單一，嚴(yán)重制約著 L-谷氨酸氧化酶的應(yīng)用和發(fā)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種a-酮戊二酸的分離純化方法，具體涉及一種針對(duì)L-谷氨酸經(jīng)過(guò)L-谷氨酸氧化酶的轉(zhuǎn)化制備a-酮戊二酸，對(duì)含有a-酮戊二酸轉(zhuǎn)化液的分離純化方法。本發(fā)明采用膜分離、納濾脫色、膜濃縮等先進(jìn)處理工藝節(jié)省了能耗，節(jié)省了活性炭的用量，減少了對(duì)環(huán)境的污染，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種a-酮戊二酸的分離純化方法，具體步驟如下：
離子交換：將轉(zhuǎn)化液經(jīng)D301大孔弱堿性陰樹(shù)脂吸附后用水反洗樹(shù)脂至流出液清澈，用0.25N鹽酸溶液洗脫，洗脫收率達(dá)到95%；
納濾：采用600-800分子量納濾膜過(guò)濾a-酮戊二酸洗脫液純化液得到a-酮戊二酸納濾清液，用3倍濃縮液體積的去離子水分3次清洗濃縮液后，棄去濃縮液，收集含瓜氨酸產(chǎn)品的納濾透析液，該步驟收率達(dá)到97%；
活性炭脫色：pH 3.0，用活性炭進(jìn)行脫色，活性炭的用量為a-酮戊二酸納濾清液的1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），脫色溫度為50℃，脫色時(shí)間為30min，用0.22μm濾膜過(guò)濾得脫色液，脫色液透光率≥99%，脫色收率達(dá)到99%；
反滲透濃縮：將a-酮戊二酸脫色液經(jīng)反滲透膜濃縮至原體積一半得到a-酮戊二酸預(yù)濃縮液，反滲透收率達(dá)到99%；
濃縮結(jié)晶：將預(yù)濃縮液在真空度≥0.095，蒸發(fā)溫度50℃條件下濃縮至含量≥80%的濃縮液，將濃縮液攪拌冷卻至20℃結(jié)晶5h。
干燥：結(jié)晶結(jié)束后，抽濾獲得晶體，將結(jié)晶晶體50℃真空干燥，得到a-酮戊二酸成品。
本發(fā)明通過(guò)微生物酶法生產(chǎn)a-酮戊二酸，具體為L(zhǎng)-谷氨酸經(jīng)過(guò)L-谷氨酸氧化酶的轉(zhuǎn)化制備a-酮戊二酸。本發(fā)明采用一步酶促反應(yīng)，轉(zhuǎn)化液中添加過(guò)氧化氫酶，避免了轉(zhuǎn)化過(guò)程過(guò)氧化氫對(duì)L-谷氨酸氧化酶的抑制作用，從而影響a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化合成，使a-酮戊二酸可以積累到較高的濃度。
具體步驟如下：
（1）粗酶液的制備：將L-谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液先經(jīng)過(guò)陶瓷膜過(guò)濾，去除菌體，上清液再經(jīng)過(guò)反滲透膜濃縮50倍即為酶轉(zhuǎn)化使用的L-谷氨酸氧化酶的粗酶液。
（2）轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：在pH為8.5的磷酸緩沖液中，添加L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L(fēng)-谷氨酸鈉，37℃，200r/min 轉(zhuǎn)化 24 h，即得含a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化液；磷酸緩沖液的終濃度為50mmol，L-谷氨酸氧化酶的終濃度為15U/ml, H2O2酶的終濃度為20U/ml、MnCl2的終濃度為5mmol，L-谷氨酸鈉的終濃度為10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。
利用菌株 MQO-160 制備L-谷氨酸氧化酶的方法，步驟如下：
（1）斜面培養(yǎng)：將菌株 MQO-160 在無(wú)菌條件下接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h；
斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g ，瓊脂20g，加純凈水至 1L，用 NaOH 調(diào) pH 至7.4-7.6，滅菌溫度115℃，15min。
（2）種子擴(kuò)大培養(yǎng)：從步驟（1）的斜面培養(yǎng)基上挑取菌落，加水稀釋獲得菌體溶液，將菌體溶液接種到種子培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接種量為 10%（v/v），擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為 28℃，搖床轉(zhuǎn)速 120r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12h；
種子培養(yǎng)基：蔗糖30g、酵母浸膏6g、(NH4)2SO46g、CaCO3 30g、CaCl2 3g、MgCl2·6H2O 1g、KCl 1g，加純凈水至 1L，用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0，滅菌溫度 115℃，15min。
（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌體接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，接種量為10%（v/v），擴(kuò)大培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵周期36h。
發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g，玉米漿干粉20g，蔗糖30g，酵母膏 1g， (NH4)2SO410g，谷氨酸鈉 10g，MgCl2 0.5g，KCl 0.5g，NaH2PO40.5g，用自來(lái)水配成 1L 溶液，用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0，滅菌溫度 121℃，滅菌時(shí)間 20min。
（4）30L 發(fā)酵罐培養(yǎng)：將步驟（3）中發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液接種到 30L
發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%（v/v），控制罐壓強(qiáng)為0.05MPa，在28℃條件下培養(yǎng) 48 小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，風(fēng)量為10 L/min，發(fā)酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液。
本發(fā)明經(jīng)過(guò)對(duì)Streptomyces sp.206（土壤分離）進(jìn)行紫外誘變和化學(xué)誘變，篩選到一株谷氨酸酶活性較高的菌株，經(jīng)分離純化后獲得菌株MQO-160，其保藏編號(hào)為：CGMCC No.12892；保藏單位為：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏日期為：2016 年8月22日；保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1 號(hào)院3 號(hào)。
菌株 MQO-160 的生物特性為：該菌株基內(nèi)和氣生菌絲均為乳白色，菌絲有較多的隔膜，氣生菌絲有較多的枝狀分支，部分菌絲處于旺盛的生長(zhǎng)期，有芽狀結(jié)構(gòu)，該菌株產(chǎn)生金黃色或紫紅色可溶性色素。該菌株孢子卵圓形、球形或柱形，表面光滑，孢子絲呈螺旋狀。菌株MQO-160分類命名為鏈霉菌Streptomyces sp.。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
（1）篩選到了一株MQO-160，解決了酶轉(zhuǎn)化工藝酶來(lái)源和酶成本高的限制；
（2）采用L-谷氨酸發(fā)酵純化液作為轉(zhuǎn)化原料，克服了L-谷氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)a-酮戊二酸的瓶頸，價(jià)格低廉易得，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高；
（3）采用膜分離、納濾脫色、膜濃縮等先進(jìn)處理工藝節(jié)省了能耗，節(jié)省了活性炭的用量，減少了對(duì)環(huán)境的污染，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
（4）本發(fā)明L-谷氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)a-酮戊二酸中底物轉(zhuǎn)化率87%，轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物濃度可達(dá)105g/L，a-酮戊二酸的一次性提取收率50%。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
菌株MQO-160，其保藏編號(hào)為：CGMCC No.12892；保藏單位為：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏日期為：2016 年8月22日；保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1 號(hào)院3 號(hào)。
實(shí)施例1 菌株 MQO-160 的生物特性
菌株 MQO-160的基內(nèi)和氣生菌絲均為乳白色，菌絲有較多的隔膜，氣生菌絲有較多的枝狀分支，部分菌絲處于旺盛的生長(zhǎng)期，有芽狀結(jié)構(gòu)，該菌株產(chǎn)生金黃色或紫紅色可溶性色素。該菌株孢子卵圓形、球形或柱形，表面光滑，孢子絲呈螺旋狀。菌株MQO-160分類命名為鏈霉菌Streptomyces sp.。
實(shí)施例2 一種a-酮戊二酸的分離純化方法，具體步驟如下：
離子交換：將轉(zhuǎn)化液經(jīng)D301大孔弱堿性陰樹(shù)脂吸附后用水反洗樹(shù)脂至流出液清澈，用0.25N鹽酸l溶液洗脫，洗脫收率達(dá)到95%；
納濾：采用600-800分子量納濾膜過(guò)濾a-酮戊二酸洗脫液純化液得到a-酮戊二酸納濾清液，用3倍濃縮液體積的去離子水分3次清洗濃縮液后，棄去濃縮液，收集含瓜氨酸產(chǎn)品的納濾透析液，該步驟收率達(dá)到97%；
活性炭脫色：pH 3.0，用活性炭進(jìn)行脫色，活性炭的用量為a-酮戊二酸納濾清液的1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），脫色溫度為50℃，脫色時(shí)間為30min，用0.22μm濾膜過(guò)濾得脫色液，脫色液透光率≥99%，脫色收率達(dá)到99%；
反滲透濃縮：將a-酮戊二酸脫色液經(jīng)反滲透膜濃縮至原體積一半得到a-酮戊二酸預(yù)濃縮液，反滲透收率達(dá)到99%；
濃縮結(jié)晶：將預(yù)濃縮液在真空度≥0.095，蒸發(fā)溫度50℃條件下濃縮至含量≥80%的濃縮液，將濃縮液攪拌冷卻至20℃結(jié)晶5h。
干燥：結(jié)晶結(jié)束后，抽濾獲得晶體，將結(jié)晶晶體50℃真空干燥，得到a-酮戊二酸成品。
實(shí)施例3 利用菌株 MQO-160 制備L-谷氨酸氧化酶的方法，步驟如下：
（1）斜面培養(yǎng)：將菌株 MQO-160 在無(wú)菌條件下接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h；
斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g ，瓊脂20g，加純凈水至 1L，用 NaOH 調(diào) pH 至7.4-7.6，滅菌溫度115℃，15min。
（2）種子擴(kuò)大培養(yǎng)：從步驟（1）的斜面培養(yǎng)基上挑取菌落，加水稀釋獲得菌體溶液，將菌體溶液接種到種子培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接種量為 10%（v/v），擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為 28℃，搖床轉(zhuǎn)速 120r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12h。
種子培養(yǎng)基：蔗糖30g、酵母浸膏6g、(NH4)2SO46g、CaCO3 30g、CaCl2 3g、MgCl2·6H2O 1g、KCl 1g，加純凈水至 1L，用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0，滅菌溫度 115℃，15min。
（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌體接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，接種量為10%（v/v），擴(kuò)大培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵周期36h。
發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g，玉米漿干粉20g，蔗糖30g，酵母膏 1g， (NH4)2SO410g，谷氨酸鈉 10g，MgCl2 0.5g，KCl 0.5g，NaH2PO40.5g，用自來(lái)水配成 1L 溶液，用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0，滅菌溫度 121℃，滅菌時(shí)間 20min。
（4）30L 發(fā)酵罐培養(yǎng)：將步驟（3）中發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液接種到 30L
發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%（v/v），控制罐壓強(qiáng)為0.05MPa，在28℃條件下培養(yǎng) 48 小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，風(fēng)量為10 L/min，發(fā)酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液。
實(shí)施例4 L-谷氨酸經(jīng)過(guò)L-谷氨酸氧化酶的轉(zhuǎn)化制備a-酮戊二酸的方法
具體步驟如下：
（1）粗酶液的制備：將L-谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液先經(jīng)過(guò)陶瓷膜過(guò)濾，去除菌體，上清液再經(jīng)過(guò)反滲透膜濃縮50倍即為酶轉(zhuǎn)化使用的L-谷氨酸氧化酶的粗酶液。
（2）轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：在pH為8.5的磷酸緩沖液中，添加L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L(fēng)-谷氨酸鈉，37℃，200r/min 轉(zhuǎn)化 24 h，即得含a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化液；磷酸緩沖液的終濃度為50mmol，L-谷氨酸氧化酶的終濃度為15U/ml, H2O2酶的終濃度為20U/ml、MnCl2的終濃度為5mmol，L-谷氨酸鈉的終濃度為10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。
試驗(yàn)例1 a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化條件的確定
（1）反應(yīng)溫度的確定 反應(yīng)溫度對(duì)a-酮戊二酸產(chǎn)量的影響，在25℃-42℃范圍內(nèi)的不同溫度下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)l0h的情況，溫度越高a-酮戊二酸產(chǎn)率越高，37℃達(dá)到最高，超過(guò)37℃則產(chǎn)率下降。
（2）pH的確定 pH對(duì)a-酮戊二酸產(chǎn)量的影響，配制不同pH條件下的底物溶液(pH6.0-10.0)，在37℃下反應(yīng)10h，考察pH對(duì)酶活(產(chǎn)物量)的影響，pH為8.5時(shí)目的產(chǎn)物濃度最高，即相對(duì)酶活最高。
（3）轉(zhuǎn)速的確定 轉(zhuǎn)速對(duì)a-酮戊二酸產(chǎn)量的影響，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200r/min時(shí)a-酮戊二酸產(chǎn)量最大。
（4）底物濃度和反應(yīng)時(shí)間的確定底物濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)a-酮戊二酸產(chǎn)量的影響，隨著L-谷氨酸濃度的增大，a-酮戊二酸濃度達(dá)到最大所需要的時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。當(dāng)L-谷氨酸濃度為10%時(shí)，轉(zhuǎn)化24h a-酮戊二酸濃度達(dá)到最大，延長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)物濃度不再增加而趨于穩(wěn)定；當(dāng)L-谷氨酸濃度繼續(xù)增加時(shí)，產(chǎn)物a-酮戊二酸的產(chǎn)量不再增加而趨于穩(wěn)定，此時(shí)增加底物濃度已沒(méi)有意義，故而選擇底物L(fēng)-谷氨酸濃度為10%，轉(zhuǎn)化時(shí)間為24h。
試驗(yàn)例2 a-酮戊二酸摩爾轉(zhuǎn)化率的測(cè)定
將菌體接種到50mL 液體培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的含有谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液4 ℃下4000 r/min 離心30min，去除菌體，上清液再經(jīng)過(guò)反旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮50倍即為酶轉(zhuǎn)化使用的L-谷氨酸氧化酶的粗酶液。在pH為8.5的磷酸緩沖液中，添加L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L(fēng)-谷氨酸鈉，37℃，200r/min 轉(zhuǎn)化 24 h，即得含a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化液；磷酸緩沖液的終濃度為50mmol，L-谷氨酸氧化酶的終濃度為15U/ml, H2O2酶的終濃度為20U/ml、MnCl2的終濃度為5mmol，L-谷氨酸鈉的終濃度為10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。6000 r/ min 離心10 min， 測(cè)定上清液中的a-酮戊二酸濃度， 并計(jì)算底物谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率y，以此表示谷氨酸氧化酶的活力。本發(fā)明測(cè)得谷氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為87%。
y=nA/nB
其中nA為轉(zhuǎn)化液中a-酮戊二酸的物質(zhì)的量（mol）；nB為轉(zhuǎn)化液中原始的谷氨酸的物質(zhì)的量（mol）。