本發(fā)明涉及一種環(huán)戊烯酮類化合物，尤其是涉及一種用海洋真菌制備環(huán)戊烯酮類化合物的方法以及該類化合物在制備治療阿爾茨海默氏病藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著世界人口平均壽命的逐年增加，全球正在逐步邁入老齡化社會(huì)，因此有關(guān)老年性疾病及其藥物治療的研究備受關(guān)注。阿爾茨海默氏?。╝lzheimerdisease，簡(jiǎn)稱ad）是發(fā)生于老年和老年前期以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損壞為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病伴有性格改變及行為改變。統(tǒng)計(jì)表明，ad患者的存活期預(yù)計(jì)可達(dá)到20年，但大多數(shù)病例在確診后僅能存活8~10年，它已經(jīng)成為人類的第四號(hào)殺手。

在ad的治療中，藥物治療占有重要的地位。在合成化學(xué)類抗ad藥物中絕大多數(shù)都以天然抗ad活性成分為先導(dǎo)化合物，以天然產(chǎn)物為來(lái)源的抗腫瘤藥物具有活性顯著、結(jié)構(gòu)獨(dú)特、作用機(jī)制不同于一般的小分子化學(xué)治療藥物的優(yōu)勢(shì)。據(jù)報(bào)道，臨床使用的抗ad藥物中超過(guò)60％來(lái)源于天然，包括植物、海洋生物、微生物。由此可見(jiàn)，天然產(chǎn)物是結(jié)構(gòu)新穎和作用獨(dú)特的抗ad化合物的重要來(lái)源。海洋真菌因其代謝途徑復(fù)雜、代謝產(chǎn)物種類豐富而日益受到研究者的重視。已報(bào)道的海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量呈快速上升的趨勢(shì)，其中許多代謝產(chǎn)物具有很強(qiáng)的抗氧化，抗aβ原纖化特性和神經(jīng)保護(hù)作用。本發(fā)明人研究得知，海洋真菌trichodermasp.（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為：cgmccno.12969）液體發(fā)酵的乙酸乙酯提取物有較好的抗氧化和抗神經(jīng)毒活性，遂對(duì)其活性成分進(jìn)行了研究。目前尚未見(jiàn)該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其抗氧化和抗神經(jīng)毒活性的報(bào)道，因此市場(chǎng)上也尚未見(jiàn)有與此相關(guān)的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種強(qiáng)有力的抗氧化，抗aβ原纖化、寡聚化特性和神經(jīng)保護(hù)作用的環(huán)戊烯酮類化合物及其制備方法和用途。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種環(huán)戊烯酮類化合物，該環(huán)戊烯酮類化合物的結(jié)構(gòu)式如ⅰ所示，

式ⅰ。

上述環(huán)戊烯酮類化合物的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）發(fā)酵生產(chǎn)

將保藏號(hào)為12969的木霉（trichodermasp.）劃線復(fù)活，接種到pda固體培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后；將pda固體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的菌落接種到pdb液體培養(yǎng)基中，于25℃，125rpm，搖床發(fā)酵培養(yǎng)14天得到發(fā)酵液；

（2）浸膏的獲得

將發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，取萃取液減壓濃縮除去乙酸乙酯，獲得菌液粗浸膏；將萃余物菌體用甲醇浸泡3次，而后濃縮蒸干，用一定的水復(fù)溶，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，取萃取液減壓濃縮除去乙酸乙酯，獲得菌體粗浸膏，將菌液粗浸膏與菌體粗浸膏合并，得到總浸膏；

（3）化合物的分離精制

將總浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶劑溶解后，加200-300目硅膠拌樣，以石油醚/乙酸乙酯以體積比5:1梯度為洗脫劑梯度洗脫，對(duì)粗浸膏進(jìn)行減壓硅膠柱層析，收集洗脫組分，再經(jīng)過(guò)半制備反相高效液相色譜得到環(huán)戊烯酮類化合物，其結(jié)構(gòu)如式i所示：

式ⅰ。

所述的pda固體培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯提取物8.0g，葡萄糖20g，蒸餾水1l，海水晶35g，瓊脂20g；所述的pdb液體培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯提取物8.0g，葡萄糖20g，蒸餾水1l，海水晶35g。

所述的半制備反相高效液相色譜的洗脫液為甲醇和水按體積比7：3混合而成。

上述環(huán)戊烯酮類化合物的應(yīng)用，所述的環(huán)戊烯酮類化合物在制備治療阿爾茨海默氏病藥物方面的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明一種環(huán)戊烯酮類化合物及其制備方法和用途，通過(guò)微生物發(fā)酵培養(yǎng)來(lái)獲取含新環(huán)戊烯酮類化合物的發(fā)酵液，然后將菌體用甲醇浸泡、乙酸乙酯萃取，得菌體粗浸膏，將菌液用乙酸乙酯萃取，得菌液粗浸膏，將菌體粗浸膏和菌液粗浸膏合并得到總粗浸膏，將該總粗浸膏經(jīng)減壓正相硅膠柱層析和反相半制備高效液相色譜分離純化得到，該環(huán)戊烯酮類化合物具有強(qiáng)有力的抗氧化，抗aβ原纖化特性和神經(jīng)保護(hù)作用，可以作為阿爾茨海默氏病的新藥物成分或先導(dǎo)化合物。

上述木霉（trichodermasp.），該菌為hpqj34菌株，保藏編號(hào)為cgmccno.12969，于2016年10月13日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

附圖說(shuō)明

圖1為化合物ⅰ以濃度依賴性方式清除dpph自由基?；衔铫』蚓S生素c（vitc）以指定濃度加入到0.2mmdpph溶液中20分鐘，通過(guò)評(píng)價(jià)517nm處的吸光度來(lái)測(cè)量dpph自由基的含量，數(shù)據(jù)表示三次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±sem;相對(duì)于對(duì)照組**p<0.01（anova和duncet試驗(yàn)）；

圖2為化合物ⅰ顯著降低aβ1-42原纖維的形成。用硫代黃素t（tht）測(cè)定法測(cè)量aβ原纖維，相對(duì)于單獨(dú)aβ1-42組**p<0.01（anova和duncet試驗(yàn)）；

圖3為化合物ⅰ阻止aβ1-42寡聚化。10μm化合物ⅰ加入到10μmaβ1-42單體溶液液中，震蕩48小時(shí)，醋酸鈾染色后透射電鏡觀察形態(tài)；

圖4為化合物ⅰ在sh-sy5y細(xì)胞中以濃度依賴性方式保護(hù)h2o2誘導(dǎo)的神經(jīng)元不死。（a）用指定濃度的化合物ⅰ處理sh-sy5y細(xì)胞。2小時(shí)后，將細(xì)胞暴露于200μmh2o2中。mtt測(cè)定用于測(cè)量細(xì)胞在h2o2中暴露24小時(shí)的細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)表示對(duì)照組的百分比，表示三次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±sem;與對(duì)照組相比^##p<0.01，與h2o2實(shí)驗(yàn)組相比*p<0.05和**p<0.01（anova和tukey檢驗(yàn)）；

圖5化合物ⅰ在sh-sy5y細(xì)胞中以濃度依賴性方式保護(hù)h2o2誘導(dǎo)的神經(jīng)元不死。給予sh-sy5y細(xì)胞化合物ⅰ2小時(shí)，暴露于200μmh2o2中。24小時(shí)后，用fda/pi雙染色檢查細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

一種環(huán)戊烯酮類化合物結(jié)構(gòu)式如ⅰ所示，

式ⅰ。

實(shí)施例2

如i式所示的環(huán)戊烯酮類化合物的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）發(fā)酵生產(chǎn)

將保藏號(hào)為12969的木霉（trichodermasp.）劃線復(fù)活，接種到pda固體培養(yǎng)基(馬鈴薯提取物8.0g，葡萄糖20g，蒸餾水1l，海水晶35g，瓊脂20g）上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后；將pda固體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的菌落接種到pdb液體培養(yǎng)基（馬鈴薯提取物8.0g，葡萄糖20g，蒸餾水1l，海水晶35g）的1000ml錐形瓶中，共接種270瓶，于25℃，125rpm，搖床發(fā)酵培養(yǎng)14天得到發(fā)酵液；

（2）浸膏的獲得

將發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，取萃取液減壓濃縮除去乙酸乙酯，獲得菌液粗浸膏；將萃余物菌體用甲醇浸泡3次，而后濃縮蒸干，用一定的水復(fù)溶，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，取萃取液減壓濃縮除去乙酸乙酯，獲得菌體粗浸膏，將菌液粗浸膏與菌體粗浸膏合并，得到總浸膏50g；

（3）化合物的分離精制

將總浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶劑溶解后，加200-300目硅膠拌樣，以石油醚/乙酸乙酯以體積比5:1梯度為洗脫劑梯度洗脫，對(duì)粗浸膏進(jìn)行減壓硅膠柱層析，收集洗脫組分，再經(jīng)過(guò)半制備反相高效液相色譜（洗脫液為甲醇：水=70:30，v/v）得到環(huán)戊烯酮類化合物，其結(jié)構(gòu)如式i所示：

式ⅰ。

該化合物ⅰ黃色油狀，分子式c13h20o4，[α]=+9.66(c0.01,meoh)；陽(yáng)離子hresimsm/z：263.1247[m+na]⁺；ir(film)νmax:3369.25,2926.37,1710.16,1634.24,1379.30,1054.54cm^-1；¹h和¹³c-nmr數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1化合物ⅰ的¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)（500and120mhz，inmeod）

注：a）表示本表信號(hào)歸屬基于dept、¹h-¹hcosy、hsqc及hmbc圖譜解析結(jié)果。氫信號(hào)多重度分別用s（單重峰）、d（二重峰）、t（三重峰）和m（多重峰）表；b)表示此欄中的數(shù)字和代號(hào)分別代表在¹h-¹hcosy譜中與相應(yīng)行中的1h給出偶合相關(guān)信號(hào)的¹h核；c)表示此欄中的數(shù)字和代號(hào)分別代表在hmbc譜中與相應(yīng)行中的¹h給出偶合相關(guān)信號(hào)的¹³c核。

實(shí)施例3

神經(jīng)毒活性的測(cè)試

（1）實(shí)驗(yàn)樣品

被測(cè)樣品溶液的配制：測(cè)試樣品為上述實(shí)施例2中分離純化的化合物ⅰ純品，精密稱取適量樣品，供測(cè)活性。該實(shí)驗(yàn)使用的指示細(xì)胞為sh-sy5y神經(jīng)細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)方法

1、通過(guò)dpph自由基清除測(cè)定確定化合物ⅰ的抗氧化性質(zhì)。將各種濃度的藥物加入到dpph的甲醇溶液（0.2mm）中。將混合物（200μl/孔）加入96孔板中，并在室溫下?lián)u動(dòng)20分鐘。用酶標(biāo)儀在517nm處測(cè)量吸光度。用維生素c作為陽(yáng)性對(duì)照。使用下式計(jì)算dpph自由基清除活性：dpph自由基清除活性（％）=[（對(duì)照的吸光度-樣品的吸光度）/對(duì)照的吸光度]×100。

2、aβ原纖維化由tht測(cè)定分析。將10μm單體aβ1-42與各種濃度的藥物和5μmtht混合，在37℃下培養(yǎng)3天。用酶標(biāo)儀以440nm作為激發(fā)波長(zhǎng)和485nm作為發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量樣品的熒光強(qiáng)度。

3、aβ寡聚化由透射電鏡觀察。將10μm單體aβ1-42與10μm藥物混合，震蕩48小時(shí)。醋酸鈾染色后，由透射電鏡觀察形態(tài)。

4、用3（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（mtt）測(cè)定評(píng)估細(xì)胞活力。sh-sy5y細(xì)胞從上海細(xì)胞生物學(xué)研究所（中國(guó)科學(xué)院）獲得并保存在補(bǔ)充有10％胎牛血清（fbs）和青霉素（100μg/ml）/鏈霉素（100μg/ml）的高葡萄糖修飾的eagle培養(yǎng)基（dmem）中，培養(yǎng)基保存在37℃，含5％co2的潮濕環(huán)境中。培養(yǎng)基每?jī)商旄乱淮?。?duì)于h2o2實(shí)驗(yàn)，將具有低血清含量（1％fbs）的dmem中的sh-sy5y細(xì)胞以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種在6孔或96孔板中24小時(shí)，然后進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。在處理細(xì)胞后向每個(gè)孔中加入10μlmtt溶液（5mg/ml）。將平板放在37℃濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。隨后，向每個(gè)孔中加入100μl溶劑化溶液（0.01nhcl在10％sds溶液中），然后培養(yǎng)16-20小時(shí)。以655nm作為參考波長(zhǎng)在570nm的波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光度。由fda通過(guò)活細(xì)胞中的酯酶活性形成的熒光素顯現(xiàn)活細(xì)胞。通過(guò)pi染色分析非存活細(xì)胞，其僅穿透死細(xì)胞的膜。用10μg/ml的fda和5μg/ml的pi培養(yǎng)15分鐘后檢查細(xì)胞。使用uv光學(xué)顯微鏡獲取圖像，并將其與在相差顯微鏡下采集的圖像進(jìn)行比較。

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、我們首先評(píng)估了化合物ⅰ對(duì)自由基清除的影響?；衔铫』蚓S生素c（vitc）以指定濃度加入到0.2mmdpph溶液中20分鐘，通過(guò)評(píng)價(jià)517nm處的吸光度來(lái)測(cè)量dpph自由基的含量。如圖1所示，化合物ⅰ濃度依賴性地降低dpph自由基的含量，表明化合物ⅰ可能作為有效的抗氧化劑，數(shù)據(jù)表示三次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±sem，相對(duì)于對(duì)照組**p<0.01（anova和duncet試驗(yàn)）?；衔铫〉挠行Э寡趸饔每赡苁怯捎谄淞u基。許多抗氧化劑，如維生素c和維生素e，可能有助于延遲阿爾茨海默?。╝d）的發(fā)病并且有助于緩解其癥狀。因此，化合物ⅰ作為具有強(qiáng)自由基清除性能的新環(huán)戊烯酮，也可用于ad的治療。

2、以前的研究表明aβ肽會(huì)在ad患者的腦中積累。aβ肽可以形成高毒性的寡聚體和原纖維，這被認(rèn)為是ad的關(guān)鍵致病因素。aβ寡聚體和原纖維可以進(jìn)一步聚集成斑塊，這是ad的標(biāo)志。因此，優(yōu)選抑制aβ纖維化、寡聚化形成的藥物可能對(duì)ad治療產(chǎn)生疾病緩解的作用。我們進(jìn)一步測(cè)量了化合物ⅰ對(duì)aβ原纖維和寡聚體形成的影響。將aβ1-42單體（20μm）在指示濃度下與化合物ⅰ一起培養(yǎng)3天，用酶標(biāo)儀以440nm作為激發(fā)波長(zhǎng)和485nm作為發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量樣品的熒光強(qiáng)度。用硫代黃素t（tht）測(cè)定法測(cè)量aβ原纖維。由圖2可知，化合物ⅰ顯著降低aβ1-42原纖維的形成，相對(duì)于單獨(dú)aβ1-42組**p<0.01（anova和duncet試驗(yàn)）。由圖3可知，化合物ⅰ阻止aβ1-42寡聚化。10μm化合物ⅰ加入到10μmaβ1-42單體溶液液中，震蕩48小時(shí)，醋酸鈾染色后透射電鏡觀察形態(tài)。

如圖2、3所示，與單獨(dú)培養(yǎng)的aβ單體相比，化合物ⅰ和aβ單體的共培養(yǎng)導(dǎo)致aβ原纖維和寡聚體的形成減少。這些結(jié)果表明化合物ⅰ可以有效抑制aβ原纖維、寡聚體的形成，并且可能有益于ad的治療。

3、除aβ原纖維外，氧化應(yīng)激在ad發(fā)病機(jī)制中也起重要作用。過(guò)氧化氫（h2o2）是廣泛使用的神經(jīng)毒素，用h2o2建立氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性模型可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧增加，并通過(guò)作用于許多細(xì)胞內(nèi)的大分子來(lái)促進(jìn)神經(jīng)毒性。我們調(diào)查了化合物ⅰ對(duì)h2o2誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞神經(jīng)元損失的神經(jīng)保護(hù)作用。sh-sy5y細(xì)胞用化合物ⅰ預(yù)處理2小時(shí)，隨后用h2o2處理sh-sy5y細(xì)胞24小時(shí)。通過(guò)mtt測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞活力。圖4顯示化合物ⅰ以濃度依賴性的方式顯著降低h2o2誘導(dǎo)神經(jīng)元的死亡，這表明該化合物是有效的神經(jīng)保護(hù)劑。只用50μm化合物ⅰ處理sh-sy5y細(xì)胞26小時(shí)，這對(duì)細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性（該數(shù)據(jù)未顯示），這表明該化學(xué)物質(zhì)是相當(dāng)安全的?；罴?xì)胞和死細(xì)胞的熒光素二乙酸酯（fda）/碘化丙啶（pi）雙染色進(jìn)一步證實(shí)，30μm和50μm的化合物ⅰ顯著地保護(hù)了sh-sy5y細(xì)胞中的h2o2誘導(dǎo)的神經(jīng)元不死亡（圖5）。

由上述可知化合物ⅰ顯著地清除了2,2-二苯基-1-苦肼基的自由基，并顯著地減少了在體外的β-淀粉樣蛋白（aβ）的纖維化。此外，化合物ⅰ顯著地減少了h2o2誘導(dǎo)的sh-sy5y細(xì)胞的神經(jīng)毒性。這些發(fā)現(xiàn)表明，化合物ⅰ作為一種新發(fā)現(xiàn)的環(huán)戊烯酮，具有有效的抗氧化，抗aβ原纖化特性和神經(jīng)保護(hù)作用，可作為治療阿爾茨海默氏病的藥物或先導(dǎo)化合物。

上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。