本發(fā)明涉及微生物學(xué)中的多糖藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種微生物胞外多糖，尤其是涉及一種鼠李糖乳桿菌來源的胞外多糖的制備及用途。

背景技術(shù)：

多糖一直以來是生命有機(jī)體不可或缺的組成部分，是高等植物、動物細(xì)胞膜及微生物細(xì)胞壁的重要構(gòu)成。近年來隨著膜化學(xué)功能研究、免疫物質(zhì)的化學(xué)研究及新藥物資源的研究開發(fā)，以及對多糖的探索不斷深入，發(fā)現(xiàn)多糖不僅結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且顯示出多種多樣的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗衰老以及抗菌等。

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的一類大分子糖類化合物，有的依附于微生物細(xì)胞壁形成莢膜，稱為莢膜多糖；有的則進(jìn)入培養(yǎng)基形成粘液，稱為粘液多糖，他們都是微生物適應(yīng)環(huán)境的代謝產(chǎn)物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌來源的胞外多糖是食品級多糖的良好來源，不僅對乳制品的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味有重要影響，而且作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、膠凝劑及保濕劑廣泛應(yīng)用于各種食品中。研究表明，乳酸菌胞外多糖還具有抗腫瘤、降血清膽固醇、增強(qiáng)人體免疫力等多種生理功能，因此將其開發(fā)成功能性食品或藥品具有廣闊的應(yīng)用前景。自然界產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌來源十分廣泛，如乳制品、發(fā)酵食品、動物腸道等。高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌種通常為產(chǎn)粘菌株，如乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)，鼠李糖乳桿菌(Lactobacilus rhamnosus)，乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)等。但發(fā)酵乳的粘度及質(zhì)構(gòu)與多糖的產(chǎn)量并非有直接的相關(guān)，而與多糖的分子量、鏈的長度、分支度以及單糖組成等有關(guān)。根據(jù)單糖組成的種類不同，乳酸菌胞外多糖可分為兩大類：同型多糖和異型多糖。僅有同一種單糖聚合形成的即為同型多糖，乳酸菌胞外多糖中的同型多糖組成單糖主要為葡萄糖或果糖。而根據(jù)糖苷鍵類型不同，可分為四種：(1)葡聚糖(Dextrans)：葡萄糖殘基通過α-1，6-糖苷鍵連接而成，在C3上連有不同程度的分支，而在C2和C4上很少有分支；(2)β-葡聚糖(β-glucans)：葡萄糖殘基通過β-1，3-糖苷鍵連接而成；(3)果聚糖(Fructans)：果糖殘基通過β-2，6-糖苷鍵或者β-2，1-糖苷鍵連接而成；(4)變聚糖(Mutans)：葡萄糖殘基通過α-1，3-糖苷鍵連接而成直鏈多糖(直鏈中糖苷鍵含量>50％)，含有少量的α-1，6分支；(5)其他種類的多聚糖。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明中的鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497，是從8種市售酸奶中依據(jù)菌落拉絲法和胞外總糖產(chǎn)量篩選獲得，代號為ZLW-1。菌株的分類名稱：鼠李糖乳桿菌Lactobacilus rhamnosus，保藏編號為：CGMCC No.13497，保藏日期：2016年12年26日，保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

通過菌落拉絲法結(jié)合胞外總糖產(chǎn)量篩選到的一株產(chǎn)胞外多糖的鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497，通過16S rDNA序列鑒定得知該菌株屬于鼠李糖乳桿菌亞種。

本發(fā)明還公開了一種鼠李糖乳桿菌胞外多糖，其由本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌菌株CGMCC No.13497發(fā)酵而得。優(yōu)選的方法為：將本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌菌株CGMCC No.13497在脫脂乳培養(yǎng)基中37℃靜置恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)上清液經(jīng)初步分離得到粗多糖，粗多糖經(jīng)過DEAE-52離子交換層析和Sephacryl S-300凝膠層析的方法純化，即得。更有選的方法為：將鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497在脫脂乳培養(yǎng)基中37℃恒溫靜置培養(yǎng)18-24h，培養(yǎng)液經(jīng)離心除菌體獲得上清液，上清液經(jīng)Sevag法除蛋白，3-5倍體積乙醇沉淀，真空冷凍干燥后獲得粗多糖；所述粗多糖經(jīng)過DEAE-52離子交換層析純化，流動相為1mol/L NaCl，流速為SV＝1/120；洗脫組分經(jīng)截留分子量為5000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，濃縮4倍體積后再經(jīng)過Sephacryl S-300凝膠層析純化，流動相為雙蒸水，流速為SV＝1/500；洗脫組分經(jīng)截留分子量為7000Da的透析袋流水透析36-48h，透析截留液經(jīng)真空冷凍干燥，即得。

該菌株在2L的脫脂乳培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫靜置培養(yǎng)，最終粗多糖產(chǎn)量可達(dá)到2.9g/L。培養(yǎng)后的粗多糖經(jīng)DEAE-52陰離子交換層析和Sephacryl S-300凝膠層析的方法純化后得到一種純度為95.3％的水溶性胞外多糖組分(Extracellular polysaccharide，EPS)，其分子量為1.4×10⁵Da。體內(nèi)外實驗表明，本發(fā)明鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，治療結(jié)腸炎的作用，在作為免疫增強(qiáng)劑，抗炎藥物方面具有廣闊的應(yīng)用價值。

體外巨噬細(xì)胞增殖實驗表明，本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的活性。所述的巨噬細(xì)胞為鼠源巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞。

體內(nèi)抗?jié)冃越Y(jié)腸炎實驗表明，本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS能夠明顯減緩潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)，顯著降低了TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的疾病活動指數(shù)，同時對TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有良好的治療作用。

本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS還可用于制備具有抗炎效果的口服或注射制劑，也可用于制備具有免疫增強(qiáng)功能的保健品。

本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS優(yōu)選用下列方法制備：將鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497在脫脂乳培養(yǎng)基中37℃恒溫靜置培養(yǎng)18-24h，培養(yǎng)液經(jīng)離心除菌體獲得上清液，上清液經(jīng)Sevag法除蛋白，3-5倍體積乙醇沉淀，真空冷凍干燥后獲得粗多糖；粗多糖經(jīng)過DEAE-52離子交換層析(Φ2.6cm×30cm，BV＝120mL)分離，流動相為1mol/L NaCl，流速為SV＝1/120；洗脫組分經(jīng)截留分子量為5000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，濃縮4倍體積后在經(jīng)過Sephacryl S-300凝膠層析(Φ1.6cm×80cm，BV＝120mL)純化，流動相為雙蒸水，流速為SV＝1/500，洗脫組分經(jīng)截留分子量為7000Da的透析袋流水透析36-48h，透析截留液經(jīng)真空冷凍干燥后獲得精品糖EPS。

下面是本發(fā)明多糖的藥效學(xué)試驗及結(jié)果：

一、體外巨噬細(xì)胞增殖實驗

采用CCK-8檢測方法。將體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞RAW 264.7，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)及稀釋后得到5×10⁶個/mL的細(xì)胞懸液，于96孔板中每孔加100μL巨噬細(xì)胞懸液，于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h至巨噬細(xì)胞貼壁后，每孔加入20μL的EPS(終濃度為50、100、200、400μg/mL)，同時設(shè)定control組(加20μL的生理鹽水)，每組設(shè)定3個復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，吸取并棄掉上清，每孔加入100μL CCK-8溶液(DMEM：CCK-8＝10:1)，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h后，于450nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光值。結(jié)果見附圖6。

由圖6可以看出，采用CCK-8方法檢測加入的EPS 24h后RAW 264.7細(xì)胞的生長狀況。EPS對RAW 264.7細(xì)胞生長具有明顯的刺激增殖作用，且具有劑量依賴性，活細(xì)胞數(shù)量明顯多于陰性對照的空白組。而400μg/mL的EPS加藥組的巨噬細(xì)胞數(shù)量為空白對照組的1.78倍。實驗結(jié)果表明，EPS作用下RAW 264.7巨噬細(xì)胞增殖效果十分明顯。

二、體內(nèi)抗?jié)冃越Y(jié)腸炎實驗

1.大鼠結(jié)腸炎模型的建立

將SD大鼠用300mg/kg劑量的水合氯醛麻醉，之后將三硝基苯磺酸(TNBS)溶解于40％的乙醇中，注射于小鼠結(jié)腸部位，后將小鼠倒置30s，確保TNBS充分吸收。

2.TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的疾病指數(shù)變化

取體重為180-200g的SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，用無菌水溶解鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS制成EPS溶液(20mg/kg)。組別設(shè)置為TNBS模型組，空白組，TNBS+EPS組，TNBS+SASP組，每組10只動物。在連續(xù)給藥期間，空白組和模型組每天給藥生理鹽水，EPS組每天給藥EPS。SASP組每天給藥SASP(100mg/kg)，各組連續(xù)給藥14天。每天記錄大鼠體重和糞便稀疏程度，并且計算大鼠疾病活動指數(shù)。疾病活動指數(shù)按照下表計算。繪制疾病活動指數(shù)-時間變化曲線。結(jié)果如附圖7所示。

疾病指數(shù)

由圖7可以看出，在EPS給藥之后，大鼠體內(nèi)潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀得到明顯緩解，疾病活動指數(shù)呈明顯下降的趨勢。相比于模型組，EPS給藥組最終的疾病活動指數(shù)下降了3.1倍，結(jié)果表明本發(fā)明鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS對TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎具有一個顯著的治療作用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中篩選的十株乳酸菌的多糖產(chǎn)量

圖2是鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497在發(fā)酵過程中的多糖積累和生物量變化

圖3是粗多糖在DEAE-52陰離子交換柱上的洗脫曲線

圖4是粗多糖在Sephacryl S-300凝膠層析柱上的洗脫曲線

圖5是鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS的HPLC圖譜

圖6是鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS對巨噬細(xì)胞增殖的倍數(shù)變化

圖7是鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS對大鼠的疾病活動指數(shù)變化

具體實施方式

實施例1

一、產(chǎn)糖菌株的篩選和鑒定

1.酸奶樣品預(yù)處理

菌株分離樣品為8種市售酸奶。取酸奶液體樣品5mL加含有50mL 0.1％無菌蛋白胨水的錐形瓶中，振蕩后靜置20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.菌落拉絲法初篩

取液體樣品2mL于20mL 0.1％無菌蛋白胨水中振蕩混勻，梯度稀釋10⁵倍，取100μL涂布于MRS平板培養(yǎng)基，37℃恒溫倒置培養(yǎng)72h，挑取總計156個粘稠且有明顯拉絲的單菌落轉(zhuǎn)接至MRS斜面培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.菌種鏡檢

從斜面挑取少量菌體至載玻片上進(jìn)行涂片、革蘭染色，然后在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。選取鏡檢形態(tài)大小規(guī)則均一，沒有雜菌的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

4.菌株復(fù)篩

將從平板上得到的分離株接種到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，再按3％的接種量接種到50mL MRS搖瓶培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18h。取20mL培養(yǎng)液，沸水浴加熱10min，冷卻到室溫，10000×g離心10min，取上清液薄膜濃縮至5mL，加入1mL Servag試劑，4℃靜置過夜。10000×g離心10min后取上清液，用雙蒸水定容至10mL后，苯酚硫酸法測定總糖的含量，DNS法測定還原糖含量。而溶液中的多糖含量＝總糖含量－還原糖含量。根據(jù)多糖產(chǎn)量結(jié)合拉絲性能，選取10株拉絲現(xiàn)象明顯，總糖含量相對較高的菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。菌株篩選結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，對產(chǎn)胞外多糖菌株使用的拉絲法進(jìn)行初篩時，根據(jù)各菌株的拉絲特征我們將八種市售酸奶的稀釋液涂布于MRS平板上，篩選出156株具有明顯拉絲現(xiàn)象的菌株，繼而通過革蘭染色確定156株菌均為革蘭陽性菌。而將平板上分離的156株菌轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，取18h發(fā)酵液煮沸滅活，Sevag法除蛋白，醇沉透析，雙蒸水定容后通過苯酚硫酸法測定總糖含量，DNS法測定還原糖含量，從而計算出多糖的產(chǎn)量。附圖1中列出了多糖產(chǎn)量相對較多的十個菌株，而菌株5-5、8-4以及6-19相比其他菌株的多糖產(chǎn)量較高，同時結(jié)合拉絲性能，我們選取這三株菌進(jìn)行接下來的實驗研究。

5.菌種16S rDNA鑒定

菌種鑒定通過16S rDNA序列分析完成。挑取菌株5-5斜面培養(yǎng)物適量，加至5mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，取2mL菌液，5000×g離心5min，棄上清液，在沉淀中加入300μL細(xì)胞裂解液，加入10μL蛋白酶K，56℃水浴1h。100℃沸水浴加熱10min后，12000×g離心10min，取上清液進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列如下：

上游引物：5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3'

下游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

PCR產(chǎn)物純化后送交南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。測得菌株5-5的16S rDNA序列。測序結(jié)果用BLAST程序與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中已報道的細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行比對，結(jié)果表明，菌株5-5的16S rDNA序列與鼠李糖乳桿菌亞種Lactobacilus rhamnosus strain HFI-K2的同源性為99.7％。

由以上鑒定結(jié)果可得，鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497為鼠李糖乳桿菌亞種(Lactobacilus rhamnosus)，該菌已于2016年12月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號：CGMCC No.13497。

實施例2

鼠李糖乳桿菌胞外多糖的發(fā)酵制備

1.鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497在2L發(fā)酵瓶中發(fā)酵培養(yǎng)

(1)種子培養(yǎng)基的配制

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，檸檬酸二銨2g/L，乙酸鈉5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫80 1mL/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，MnSO₄·4H₂O 0.25g/L，調(diào)節(jié)pH至6.4。MRS斜面培養(yǎng)基：在MRS固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1.8％瓊脂。

(2)種子液的培養(yǎng)

將實驗所需的菌株從-20℃保藏的甘油管中接種至MRS斜面，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用接種環(huán)挑取少許接種至5ml MRS液體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后，轉(zhuǎn)接至50mL MRS液體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制

將2L脫脂牛奶倒入3L發(fā)酵瓶中，紗布塞封口，于105℃，20min進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻后置于常溫備用。

(4)2L脫乳培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)

將MRS液體脂培養(yǎng)基中16h種子培養(yǎng)物以5％接種量接種至2L脫脂乳培養(yǎng)基中。置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h。每隔2h取樣3mL測定生物量、總糖含量以及還原糖含量。生物量通過干濕重法測定。多糖含量＝總糖含量-還原糖含量。總糖含量通過苯酚硫酸法測定，還原糖含量通過DNS法測定。

結(jié)果見圖2.由圖2可以看出，在發(fā)酵過程中多糖在不斷積累，在8h之后積累速率明顯加快，在18h之后產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，最終達(dá)到2.9g/L；生物量在4h-12h內(nèi)迅速上升，在12h之后趨于穩(wěn)定，在20h時達(dá)到最大值2.8g/L。結(jié)果表明在鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497規(guī)模發(fā)酵時，將發(fā)酵總時間控制在18h能夠獲得較高產(chǎn)量的胞外多糖，保證后續(xù)分離純化和藥理活性實驗過程有足夠的粗多糖來源基礎(chǔ)。與此同時鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497在2L發(fā)酵瓶發(fā)酵獲得的胞外多糖產(chǎn)量較其他乳酸菌相對較高，因此本發(fā)明中鼠李糖乳桿菌CGMCC No.13497是一株良好的多糖生產(chǎn)菌種，有潛在的工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用價值。

2、鼠李糖乳桿菌胞外粗多糖的提取

(1)純化試劑的配制

Sevag試劑：氯仿與正丁醇以4∶1的體積比混合。

(2)發(fā)酵產(chǎn)物中粗多糖的提取

將2L發(fā)酵液100℃煮沸5min，滅活殘余菌體。之后將2L滅活菌體的發(fā)酵液于10000×g離心10min，去除沉淀取上清液；將上清液薄膜濃縮至500mL，加入1/5倍體積Sevag試劑，于搖床中200rpm震蕩20min；Sevag試劑反應(yīng)后于5000×g離心，去除沉淀，收集上清，重復(fù)三次。之后進(jìn)行乙醇沉淀，將95％乙醇和上清液置于4℃冷卻30min，加入3-5倍體積95％的乙醇，充分?jǐn)嚢韬?此過程應(yīng)伴隨多糖稱絮狀沉淀析出)，4℃靜置過夜。之后倒去上層乙醇，將沉淀用蒸餾水充分?jǐn)嚢枞芙?，進(jìn)行真空冷凍干燥后獲得干燥后的淡黃色粉末狀粗多糖。

3、鼠李糖乳桿菌胞外精多糖的制備

(1)粗多糖溶液配制

稱取粗多糖1g溶解于10mL雙蒸水中充分溶解，配成100mg/mL的水溶液，于冷凍離心機(jī)8000×g離心10min后，取上清液即為100mg/mL粗多糖水溶液。

(2)DEAE-52陰離子交換層析

將粗多糖水溶液上樣至平衡好的DEAE-52陰離子交換柱(Φ2.6cm×30cm，BV＝120mL)。用5倍柱體積雙蒸水沖洗離子交換柱，流速為SV＝1/240(0.5mL/min)，再用2倍柱體積1mol/L的NaCl溶液洗脫，流速為SV＝1/120(1mL/min)。利用自動分部收集器收集，每管收集5mL，用苯酚硫酸法逐管測定總糖含量，作出洗脫曲線，合并收集相同組分，得到NaCl洗脫多糖組分EPS。結(jié)果見圖3。

在圖3中，粗多糖溶于水后離心，除去不溶于水的雜質(zhì)沉淀后，取上清液上樣至DEAE-52陰離子交換柱后先用雙蒸水洗脫5倍柱體積，將與樹脂不結(jié)合或結(jié)合較弱的物質(zhì)洗脫出來。繼而通過用0-1mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，檢測并收集洗脫峰。結(jié)果表明EPS帶有一定負(fù)電荷，能與DEAE-52離子交換樹脂有一定的結(jié)合，因此需要一定濃度的鹽溶液(NaCl)才能將EPS洗脫下來。

(3)超濾濃縮

用截流分子量為5000Da的超濾膜對(2)中的NaCl洗脫的收集液EPS進(jìn)行超濾；壓力為0.08MPa，超濾濃縮4倍體積后進(jìn)行真空冷凍干燥。

(4)Sephacryl S-300凝膠層析

取(3)中真空冷凍干燥所得樣品EPS 150mg分別溶于5mL雙蒸水中配成30mg/mL的水溶液，于冷凍離心機(jī)8000×g離心10min后取上清液后過0.45μm濾膜過濾除菌。取溶液上樣至平衡好的Sephacryl S-300凝膠層析柱(Φ1.6cm×80cm，BV＝120mL)。用2倍柱體積雙蒸水洗脫，流速為SV＝1/500(0.25mL/min)，自動分部收集器收集，每管收集3mL，用苯酚硫酸法逐管測定總糖含量，作出洗脫曲線，合并收集相同組分。結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，DEAE-52陰離子交換柱中NaCl洗脫出的鹽洗組分EPS進(jìn)一步通過Sephacryl S-300凝膠層析柱進(jìn)行純化，得到洗脫曲線圖譜，EPS自第14管開始出峰到第28管結(jié)束，含有少量的蛋白，此多糖組分可能為結(jié)合了一定量蛋白的蛋白糖，需進(jìn)一步結(jié)構(gòu)鑒定來確定其多糖構(gòu)成。兩種組分的洗脫峰均為單一對稱峰，說明鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS是均一的單糖組分。

(5)透析凍干

選擇截流分子量為7000Da的透析袋，加入(4)中洗脫的收集液，流水透析36-48h，真空冷凍干燥得到精品糖EPS，稱量標(biāo)記，于-20℃冰箱保存。最終經(jīng)分離純化后的多糖收率如表1所示。

表1粗多糖和精多糖EPS的理化參數(shù)

4、鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS的組成及其理化參數(shù)測定

多糖含量測定

精確稱取葡萄糖20mg于烘箱105℃干燥至恒重后，溶于100mL雙蒸水中配成0.2mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液按照下表分別稀釋為20、40、80、100、120、160、200μg/mL，而后加入0.4mL苯酚溶液，再快速加入2.0mL濃硫酸，充分混勻，室溫下靜置30min，靜置后依次吸取200μL加入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定在波長490nm下的吸光值，雙蒸水作空白對照。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，A490為縱坐標(biāo)，作C-A490的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算對應(yīng)的回歸方程。將多糖樣品配成0.1mg/mL的溶液，按照以上方法吸取0.1mL，加入0.2mL苯酚溶液及1.0mL濃硫酸，酶標(biāo)儀測其490nm下的吸光值，根據(jù)回歸方程計算樣品的多糖含量。

蛋白含量測定

多糖組分中蛋白質(zhì)含量通過福林-酚法進(jìn)行。

(1)溶液的配制

(a)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制：精確稱取BSA 1.25mg溶于5mL雙蒸水中配制成250μg/mL的溶液。(b)樣品溶液配制：福林-酚甲試劑(V_A：V_B＝50：1)：A：10g Na₂CO₃、2g NaOH、0.25g酒石酸鉀鈉(KNaC₄H₄O₆·4H₂O)溶于500mL雙蒸水。B：0.5g CuSO₄·5H₂O溶于100mL雙蒸水中。福林-酚乙試劑：美國Sigma公司試劑。

將標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液按照下表分別稀釋為0、25、50、100、150、200、250μg/mL，而后加入5mL試劑甲，充分混勻，室溫下靜置10min，而后快速加入0.5mL試劑乙，立即搖勻，30℃水浴中靜置30min，1號試管(雙蒸水)為對照溶液，用分光光度計測各管在500nm處

吸光值。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，A500為縱坐標(biāo)作圖，繪出C-A500標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算其C-A500方程。同法測定樣品在500nm的吸光值，計算出多糖樣品中的蛋白含量。

純度鑒定

通過JASCO高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行純度鑒定。系統(tǒng)配置為Shodex sugar 805串聯(lián)Shodex sugar 802色譜柱，2414示差折光檢測器，流動相為雙蒸水，樣品濃度為10.0mg/mL，進(jìn)樣量為20μL，流速1.0mL/min，柱溫30℃，記錄樣品色譜曲線。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，通過高效液相檢測鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS的純度，鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS的高效液相色譜結(jié)果顯示為單一對稱峰，出峰時間為11.7min，表明EPS為均一多糖組分，純度為95.3％。由附圖3可知，EPS是一種純度高于95％的水溶性多糖組分，為之后的藥理學(xué)活性實驗提供了保證。

分子量測定

鼠李糖乳桿菌胞外多糖EPS分子量的測定通過高效凝膠滲透色譜法進(jìn)行。配置為Shodex sugar 805串聯(lián)Shodex sugar 802色譜柱，用2414示差折光檢測器檢測。以濃度為5.0mg/mL的樣品及葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為20μL，流動相為0.01mol/L的NaNO₃溶液，流速1.0mL/min，記錄各自的保留時間Tr，繪LogMr-Tr標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算其回歸方程。根據(jù)多糖樣品的保留時間，通過方程計算其相對分子質(zhì)量。

根據(jù)不同相對分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品及其對應(yīng)的保留時間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Log Mr＝-0.00486Tr³+0.459Tr²–14.7Tr+163。RAPS的保留時間為11.7min，代入方程能夠推算出其相對分子質(zhì)量約為1.4×10⁵Da。