本發(fā)明屬于小分子食品環(huán)境污染物的免疫化學(xué)和殘留生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種呋蟲(chóng)胺半抗原、完全抗原和抗體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
呋蟲(chóng)胺是由日本三井化學(xué)株式會(huì)社研發(fā)的新一代煙堿類農(nóng)藥，是繼吡蟲(chóng)啉等第一代、噻蟲(chóng)嗪等第二代煙堿農(nóng)藥后的又一類具有新結(jié)構(gòu)的煙堿類農(nóng)藥。呋蟲(chóng)胺分子中具有的呋喃環(huán)和開(kāi)環(huán)的胍基取代了前兩類氯代吡啶基、氯代噻唑基或者閉環(huán)胍基，是煙堿類農(nóng)藥分子結(jié)構(gòu)中唯一不含鹵素原子和芳香環(huán)的種類，殺蟲(chóng)活性和安全性更高。呋蟲(chóng)胺也是一種煙堿乙酰膽堿受體(nachr)激動(dòng)劑，具有較好的胃毒、觸殺和根部?jī)?nèi)吸性，活性高、安全性高、持效期長(zhǎng)，殺蟲(chóng)譜廣等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于水稻、蔬菜、果樹(shù)中的飛虱、椿象類、二化螟、蚜蟲(chóng)類、粉虱類、蛾類、薊馬類等的防治，對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性的很多害蟲(chóng)具有較好的防治效果，是煙堿類農(nóng)藥的最新品種。
即使呋蟲(chóng)胺的毒性較小，但是大量使用仍不免會(huì)在農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中造成殘留，長(zhǎng)期的低濃度的殘留也會(huì)對(duì)人類健康和環(huán)境造成危害，特別是對(duì)家蠶、蜜蜂等生物還是具有一定的毒性，歐盟已經(jīng)禁用了包括吡蟲(chóng)啉等在內(nèi)的三種新煙堿類殺蟲(chóng)劑在很多種作物中的應(yīng)用，在美國(guó)epa要求在戶外使用呋蟲(chóng)胺時(shí)一定要測(cè)定其對(duì)非靶標(biāo)昆蟲(chóng)，比如傳粉昆蟲(chóng)的影響。而且，很多國(guó)家都制定了越來(lái)越嚴(yán)格的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)對(duì)呋蟲(chóng)胺的限量標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)作物不同從0.05-50mg/kg，日本的肯定列表規(guī)定呋蟲(chóng)胺的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.01-2mg/kg。農(nóng)藥殘留現(xiàn)在主要是靠氣相色譜、液相色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，該類技術(shù)具有精密度高等優(yōu)點(diǎn)，但是它們具有儀器設(shè)備昂貴、條件要求高、過(guò)程繁瑣不易掌握、成本高昂等特點(diǎn)，特別對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品等附加值低、保鮮要求高的產(chǎn)品不適合，因此對(duì)于快速、成本低廉、靈敏度高的分析技術(shù)比較迫切。
其中，酶免疫反應(yīng)是發(fā)展較早，較為成熟的一種快速分析方法。但是與大分析相比較而言，小分子不容易引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，即不具備免疫原性，被稱為半抗原；但是具有特定結(jié)構(gòu)的小分子可以與抗體產(chǎn)生反應(yīng)，即小分子具有反應(yīng)原性，因此如果將小分子連接到具有免疫原性的大分子上，做成人工抗原，就可以使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對(duì)小分子結(jié)構(gòu)的抗體。但是不是任何小分子與大分子連接都會(huì)產(chǎn)生針對(duì)這個(gè)小分子的抗體，也不是產(chǎn)生的抗體都能針對(duì)此小分子產(chǎn)生特異性結(jié)合，因此在小分子半抗原結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)非常重要，首先要設(shè)計(jì)合理的半抗原結(jié)構(gòu)既能容易實(shí)現(xiàn)反應(yīng)又能夠較恰當(dāng)?shù)哪M目標(biāo)分析物的結(jié)構(gòu)；其次，要選擇合適的與大分子的結(jié)合位點(diǎn)、選擇合適長(zhǎng)度和合適結(jié)構(gòu)的連接臂，凸顯小分子的特征結(jié)構(gòu)、易于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)能刺激機(jī)體產(chǎn)生反應(yīng)；再次，考慮到還要分子的空間結(jié)構(gòu)、電子云密度、構(gòu)型構(gòu)像等的諸多因素，都可能會(huì)對(duì)抗體的性質(zhì)產(chǎn)生較大影響。
基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)的分析技術(shù)主要是elisa和eia，其中以elisa應(yīng)用更為廣泛，elisa技術(shù)發(fā)展自70年代，農(nóng)藥等小分子免疫檢測(cè)技術(shù)發(fā)展自80年代，elsia以根據(jù)酶標(biāo)的抗體分解底物顯示顏色的深度或吸光度與待測(cè)物質(zhì)含量之間的關(guān)系來(lái)進(jìn)行測(cè)定。這一技術(shù)手段具有靈敏度高、分析速度快、抗基底干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，得到了較快的發(fā)展。該技術(shù)最重要的在于小分子半抗原結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)、連接位點(diǎn)的選擇、連接臂結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度的選擇等等會(huì)影響抗體結(jié)構(gòu)的重要方面，也是該技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)和高質(zhì)量抗體的保障。關(guān)于呋蟲(chóng)胺人工半抗原、人工抗原、抗體以及以此為基礎(chǔ)的免疫分析方法尚未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種呋蟲(chóng)胺半抗原、完全抗原和抗體。
本發(fā)明的目的還在于提供上述呋蟲(chóng)胺半抗原、完全抗原和抗體的制備方法。
本發(fā)明的目的還在于提供上述半抗原、完全抗原和抗體在呋蟲(chóng)胺含量檢測(cè)免疫分析方法的建立方面的應(yīng)用。
一種呋蟲(chóng)胺半抗原，所述呋蟲(chóng)胺半抗原的分子結(jié)構(gòu)如式i所示：
一種呋蟲(chóng)胺免疫原，是由上述的半抗原與牛血清半蛋白偶聯(lián)而來(lái)，其分子結(jié)構(gòu)如式ii所示：
一種呋蟲(chóng)胺包被原，是由上述的半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)而來(lái)，其分子結(jié)構(gòu)如式iii所示：
一種呋蟲(chóng)胺抗體，是能與上述呋蟲(chóng)胺免疫原或呋蟲(chóng)胺包被原發(fā)生特異性反應(yīng)的igg抗體。
上述呋蟲(chóng)胺半抗原的制備方法，按照如下步驟進(jìn)行：
(1)將呋蟲(chóng)胺2.00-2.50g溶于無(wú)水三口瓶中的20-30ml乙醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，磁力攪拌步驟(1)制備的呋蟲(chóng)胺乙醇溶液，緩慢投入8.50-11.25g二水合氯化亞錫，至完全溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù)回流反應(yīng)4-6h；
(3)反應(yīng)完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心，棄去沉淀，再重復(fù)離心3次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標(biāo)產(chǎn)物。
上述呋蟲(chóng)胺免疫原的制備方法，按照如下步驟進(jìn)行：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝5.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.040-0.045g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，完全溶解后再攪拌15min，加0.020-0.025gn-n-羥基琥珀酰亞胺，溶解后攪拌40min；
(2)將權(quán)利要求1中所述的半抗原0.020-0.031g溶解到1.0ml的dmf中，將步驟(1)制備的反應(yīng)液的ph調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜；
(3)將步驟(2)制備的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心，然后進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存；
上述呋蟲(chóng)胺免疫原的制備方法，按照如下步驟進(jìn)行：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝6.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.030-0.039g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，完全溶解后再攪拌15min，加0.010-0.030gn-n-羥基琥珀酰亞胺溶解后攪拌40min；
(2)將權(quán)利要求1所述的半抗原0.020-0.031g溶解到1.0ml的dmf中，將步驟(1)制備的反應(yīng)液的ph調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜；
(3)將步驟(2)制備的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心，然后進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
上述呋蟲(chóng)胺抗體的制備方法，按照如下步驟進(jìn)行：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔，采用皮下注射法進(jìn)行免疫，一共進(jìn)行五次免疫，具體做法是：
第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；
第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；
第五次免疫為加強(qiáng)免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進(jìn)行注射免疫；
第二至第五次免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進(jìn)行，從第三次免疫后開(kāi)始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測(cè)定血清效價(jià)；
(2)抗體純化：當(dāng)抗血清中的抗體對(duì)權(quán)利要求3中所述的呋蟲(chóng)胺包被原效價(jià)達(dá)到1∶60000-1∶80000時(shí)，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法對(duì)抗血清進(jìn)行純化，制備得權(quán)利要求4中所述的igg抗體。
上述呋蟲(chóng)胺包被原和呋蟲(chóng)胺抗體的應(yīng)用，用于呋蟲(chóng)胺含量檢測(cè)免疫分析方法的建立。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的半抗原能夠很好的模擬呋蟲(chóng)胺分子結(jié)構(gòu)特征，為呋蟲(chóng)胺特征結(jié)構(gòu)的暴漏和高特異性抗體的產(chǎn)生做好基礎(chǔ)；抗體具有高的特異性，檢測(cè)限達(dá)到1.28μg/l；上述半抗原合成簡(jiǎn)單，收率高，反應(yīng)易于控制；本發(fā)明合成的半抗原的方法簡(jiǎn)單，易于掌握，所建立的酶聯(lián)免疫方法靈敏度和準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)單，成本低，非常適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，本發(fā)明為高效，低廉、快速的免疫檢測(cè)產(chǎn)品打下很好的基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。
附圖說(shuō)明
圖1為實(shí)施例2半抑制濃度即ic50的值測(cè)定曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1
呋蟲(chóng)胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲(chóng)胺2.10g溶于無(wú)水三口瓶中的25ml乙醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，磁力攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入8.5g二水合氯化亞錫，至完全溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù)回流反應(yīng)4h；
(3)反應(yīng)完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復(fù)離心3次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標(biāo)產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝4.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.045gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.021gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進(jìn)行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝6.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.035gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.015gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.5的溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔選用新西蘭大白兔(免疫前先采其血清作為陰性血清)，采用皮下注射法進(jìn)行免疫，一共進(jìn)行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第五次免疫為加強(qiáng)免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進(jìn)行注射免疫；第二至加強(qiáng)(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進(jìn)行，從第三次免疫后開(kāi)始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測(cè)定血清效價(jià)；
(2)抗體純化：當(dāng)抗血清中的抗體對(duì)呋蟲(chóng)胺包被原效價(jià)達(dá)到1∶60000時(shí)，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法粗體，葡聚糖凝膠純化對(duì)抗血清進(jìn)行制備，制得igg抗體。
實(shí)施例2
呋蟲(chóng)胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲(chóng)胺2.40g溶于無(wú)水三口瓶中的25ml乙醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，磁力攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入10.00g二水合氯化亞錫，至完全溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù)回流反應(yīng)5h；
(3)反應(yīng)完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復(fù)離心4次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標(biāo)產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝5.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.042gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.023gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進(jìn)行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝5.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.034gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.014gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至9.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔，采用皮下注射法進(jìn)行免疫，一共進(jìn)行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第二次至第四次免疫免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第五次免疫為加強(qiáng)免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進(jìn)行注射免疫；第二至加強(qiáng)(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進(jìn)行，從第三次免疫后開(kāi)始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測(cè)定血清效價(jià)；
(2)抗體純化：當(dāng)抗血清中的抗體對(duì)呋蟲(chóng)胺包被原效價(jià)達(dá)到1∶70000時(shí)，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法粗體，葡聚糖凝膠純化對(duì)抗血清進(jìn)行制備，制得igg抗體。
呋蟲(chóng)胺抗體在檢測(cè)呋蟲(chóng)胺含量的應(yīng)用，包括如下步驟：
(1)包被：用包被緩沖液(ph＝9.6，0.1mol/l的碳酸鹽溶液)稀釋包被原(在7中已定容)到2μg/ml，100μl/孔，室溫孵育3h后，用洗板液(含有0.02％吐溫20的磷酸鹽緩沖液)洗滌孔3次；
(2)封閉：每孔加入200μl含有1％ova，0.02％吐溫20的ph＝7.4的磷酸鹽封閉緩沖液封閉室溫封閉40min，用洗板液洗滌孔3次；
(3)加樣：將待測(cè)樣品溶于ph7.4的磷酸緩沖液中，每孔50μl(或每孔加入50μl梯度濃度的標(biāo)樣，包括0點(diǎn)，即只加入50μl空白磷酸鹽緩沖液的空白孔)，同時(shí)設(shè)置完全相同的另一組加樣組，測(cè)定陰性血清孔的值；
(4)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：將抗體溶于ph7.4的磷酸緩沖液中，加入待測(cè)樣品或標(biāo)樣后，每孔加入50μl抗體溶液，孵育80min后用洗板液洗滌三次；
(5)加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗：將二抗用ph7.4的磷酸緩沖液20000倍稀釋，每孔加入100μl，室溫孵育70分鐘后，甩出反應(yīng)液拍凈酶標(biāo)板洗孔3次；
(6)顯色反應(yīng)：底物反應(yīng)液由a液(一水合檸檬酸0.49g，十二水合磷酸氫二鈉1.94g，溶于100ml水)9.5ml，b液(過(guò)氧化氫脲75mg溶于10ml水，4℃避光保存)32μl，c液(四甲基聯(lián)苯胺(tmb)50mg溶于無(wú)水乙醇25ml，4℃避光保存)0.5ml，混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配，顯色時(shí)每孔加入50μl，20min后每孔加入50μl2.5mol/l的硫酸終止反應(yīng)后在自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀數(shù)。
根據(jù)顏色反應(yīng)的吸光度值，根據(jù)公式抑制率i(％)＝[1-(a樣品-a陰性)/(a空白-a陰性)]*100％，其中a樣品是指加有待測(cè)樣品或者標(biāo)液孔的吸光度，a陰性是指相同條件下不加抗體血清而加入陰性血清的孔的吸光值，a空白是待測(cè)物濃度為0時(shí)的孔的吸光度，計(jì)算出不同呋蟲(chóng)胺濃度對(duì)抗體的抑制率，并做出抑制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為呋蟲(chóng)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為抑制率，找出半抑制濃度即ic50的值，ic50越低說(shuō)明抗體的靈敏度越高，如圖1，ic50為0.0059μg/ml。
實(shí)施例3
呋蟲(chóng)胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲(chóng)胺2.10g溶于無(wú)水三口瓶中的30ml乙醇中醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，磁力攪攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入二水合8.5g氯化亞錫，至完全溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù)回流反應(yīng)6h；
(3)反應(yīng)完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復(fù)離心3次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標(biāo)產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝4.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.045gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.021gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進(jìn)行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝6.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.035gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.015gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.5的溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔(免疫前采其血清作為陰性對(duì)照)，采用皮下注射法進(jìn)行免疫，一共進(jìn)行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第五次免疫為加強(qiáng)免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進(jìn)行注射免疫；第二至加強(qiáng)(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進(jìn)行，從第三次免疫后開(kāi)始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測(cè)定血清效價(jià)；
(2)抗體純化：當(dāng)抗血清中的抗體對(duì)呋蟲(chóng)胺包被原效價(jià)達(dá)到1∶60000時(shí)，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法對(duì)抗血清進(jìn)行純化，制備得igg抗體。
elisa方法的建立
(1)棋盤(pán)法確定包被原濃度為2μg/ml，100μl/孔，抗體按照1∶3000稀釋，酶標(biāo)二抗按照1∶20000稀釋，加入梯度濃度的呋蟲(chóng)胺，做出抑制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定出其50％抑制濃度，即ic50(呋蟲(chóng)胺)；同時(shí)在另一些孔中將呋蟲(chóng)胺替代為與其結(jié)構(gòu)類似的其他農(nóng)藥，也做梯度濃度，找出其半抑制濃度，即ic50(類似物)。抗體的交叉反應(yīng)率：cr(％)＝ic50(呋蟲(chóng)胺)/ic50(類似物)，這一值表示了抗體的特異性，值越小，特異性越高，表1列出了該抗體對(duì)一些結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率。
表1抗體對(duì)一些結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率
實(shí)施例4
呋蟲(chóng)胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲(chóng)胺2.40g溶于無(wú)水三口瓶中的30ml乙醇中醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，磁力攪攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入10.00g二水合氯化亞錫，至完全溶解，再加入菹草提取物0.05g或婆婆納提取物0.1g，至完全溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù)回流反應(yīng)6h；所述菹草提取物或婆婆納提取物的提取方法為：將菹草或婆婆納新鮮的葉片放入烘箱在50-80℃條件下烘干，磨成粉末，加4-8倍重量份數(shù)的30％乙醇水溶液回流提取3次，合并濾液，蒸干制成。
(3)反應(yīng)完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復(fù)離心4次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標(biāo)產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝5.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.042gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.023gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，再加入菹草提取物0.05g或婆婆納提取物0.1g(制備方法如上所述)，將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進(jìn)行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝5.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.034gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.014gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，再加入菹草提取物0.05g或婆婆納提取物0.1g(制備方法如上所述)將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至9.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔，采用皮下注射法進(jìn)行免疫，一共進(jìn)行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第二次至第四次免疫免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第五次免疫為加強(qiáng)免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進(jìn)行注射免疫；第二至加強(qiáng)(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進(jìn)行，從第三次免疫后開(kāi)始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測(cè)定血清效價(jià)；
(2)抗體純化：當(dāng)抗血清中的抗體對(duì)呋蟲(chóng)胺包被原效價(jià)達(dá)到1∶70000時(shí)，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法粗體，葡聚糖凝膠純化對(duì)抗血清進(jìn)行制備，制得igg抗體。
呋蟲(chóng)胺抗體在檢測(cè)呋蟲(chóng)胺含量的應(yīng)用，包括如下步驟：
(1)包被：用包被緩沖液(ph＝9.6，0.1mol/l的碳酸鹽溶液)稀釋包被原(在7中已定容)到2μg/ml，100μl/孔，室溫孵育3h后，用洗板液(含有0.02％吐溫20的磷酸鹽緩沖液)洗滌孔3次；
(2)封閉：每孔加入200μl含有1％ova，0.02％吐溫20的ph＝7.4的磷酸鹽封閉緩沖液封閉室溫封閉40min，用洗板液洗滌孔3次；
(3)加樣：將待測(cè)樣品溶于ph7.4的磷酸緩沖液中，每孔50μl(或每孔加入50μl梯度濃度的標(biāo)樣，包括0點(diǎn)，即只加入50μl空白磷酸鹽緩沖液的空白孔)，同時(shí)設(shè)置完全相同的另一組加樣組，測(cè)定陰性血清孔的值；
(4)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：將抗體溶于ph7.4的磷酸緩沖液中，加入待測(cè)樣品或標(biāo)樣后，每孔加入50μl抗體溶液，孵育80min后用洗板液洗滌三次；
(5)加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗：將二抗用ph7.4的磷酸緩沖液20000倍稀釋，每孔加入100μl，室溫孵育70分鐘后，甩出反應(yīng)液拍凈酶標(biāo)板洗孔3次；
(6)顯色反應(yīng)：底物反應(yīng)液由a液(一水合檸檬酸0.49g，十二水合磷酸氫二鈉1.94g，溶于100ml水)9.5ml，b液(過(guò)氧化氫脲75mg溶于10ml水，4℃避光保存)32μl，c液(四甲基聯(lián)苯胺(tmb)50mg溶于無(wú)水乙醇25ml，4℃避光保存)0.5ml，混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配，顯色時(shí)每孔加入50μl，20min后每孔加入50μl2.5mol/l的硫酸終止反應(yīng)后在自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀數(shù)。
根據(jù)顏色反應(yīng)的吸光度值，根據(jù)公式抑制率i(％)＝[1-(a樣品-a陰性)/(a空白-a陰性)]*100％，其中a樣品是指加有待測(cè)樣品或者標(biāo)液孔的吸光度，a陰性是指相同條件下不加抗體而加入陰性血清的孔的吸光值，a空白是待測(cè)物濃度為0時(shí)的孔的吸光度，計(jì)算出不同呋蟲(chóng)胺濃度對(duì)抗體的抑制率，并做出抑制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為呋蟲(chóng)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為抑制率，找出半抑制濃度即ic50的值，ic50越低說(shuō)明抗體的靈敏度越高，ic50為0.00032μg/ml。
實(shí)施例5
呋蟲(chóng)胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲(chóng)胺2.10g溶于無(wú)水三口瓶中25ml乙醇中醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，磁力攪攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入二水合8.5g氯化亞錫，至完全溶解，再加入青金石粉末1g或硨磲粉末2g，氮?dú)獗Ｗo(hù)回流反應(yīng)6h；
(3)反應(yīng)完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復(fù)離心3次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標(biāo)產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝4.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.045gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.021gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，再加入青金石粉末1g或硨磲粉末2g，將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進(jìn)行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝6.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.035gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.015gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，再加入青金石粉末1g或硨磲粉末2g，將上一步驟反應(yīng)液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.5的溶液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進(jìn)行定容，計(jì)算完全抗原濃度，測(cè)定結(jié)合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔(免疫前采其血清作為陰性對(duì)照)，采用皮下注射法進(jìn)行免疫，一共進(jìn)行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第二次至第四次免疫免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，然后進(jìn)行注射免疫；第五次免疫為加強(qiáng)免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進(jìn)行注射免疫；第二至加強(qiáng)(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進(jìn)行，從第三次免疫后開(kāi)始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測(cè)定血清效價(jià)；
(2)抗體純化：當(dāng)抗血清中的抗體對(duì)呋蟲(chóng)胺包被原效價(jià)達(dá)到1∶60000時(shí)，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法對(duì)抗血清進(jìn)行純化，制備得igg抗體。
elisa方法的建立
(1)棋盤(pán)法確定包被原濃度為2μg/ml，100μl/孔，抗體按照1∶3000稀釋，酶標(biāo)二抗按照1∶20000稀釋，加入梯度濃度的呋蟲(chóng)胺，做出抑制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定出其50％抑制濃度，即ic50(呋蟲(chóng)胺)；同時(shí)在另一些孔中將呋蟲(chóng)胺替代為與其結(jié)構(gòu)類似的其他農(nóng)藥，也做梯度濃度，找出其半抑制濃度，即ic50(類似物)。抗體的交叉反應(yīng)率：cr(％)＝ic50(呋蟲(chóng)胺)/ic50(類似物)，這一值表示了抗體的特異性，值越小，特異性越高，表1列出了該抗體對(duì)一些結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率。
表1抗體對(duì)一些結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率