一種半抗原、其人工抗原及其在檢測喹乙醇殘留標志物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種半抗原、其人工抗原及其在檢測喹乙醇殘留標志物中的應用。
【背景技術】
[0002] 喹乙醇（OLA)，分子式C12H13N3O 4，是喹噁啉類抗菌藥物的典型代表，其主要代謝物 為3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA)。由于OLA對大多數動物有明顯的致畸作用，對人也有潛 在的三致性（即致畸、致突變和致癌），很多國家規(guī)定禁止或限制使用0LA，我國規(guī)定只能用 于35kg以下的仔豬。MQCA為指定的喹乙醇的主要殘留標志物，用于監(jiān)控OLA在畜牧生產中 的違禁使用情況。歐盟、美國和中國分別制定了 MQCA的最高殘留限量（MRLs)。我國規(guī)定 MQCA在豬肝和豬肉中的最高殘留限量分別為50 μ g/kg和4 μ g/kg。
[0003] 利用儀器方法檢測MQCA的技術相對復雜、耗時長、成本高，而酶聯免疫方法 (ELISA)具有快速、靈敏、簡便、高效等優(yōu)點，能滿足目前生產鏈所需要的大量樣本的快速篩 選和現場檢測的要求。該技術研究的關鍵是半抗原分子的設計與合成、人工抗原與抗體的 制備。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種半抗原、其人工抗原及其在檢測喹乙醇殘留標志物中的 應用。
[0005] 本發(fā)明提供的半抗原為式（I )所示的化合物；
[0006]
[0007] 本發(fā)明還保護式（I )所示化合物的制備方法，包括如下步驟：
[0008] (1)乙酰乙酸乙酯、N-溴代丁二酰亞胺和4-硝基鄰苯二胺發(fā)生反應，用乙酸乙酯 萃取，減壓蒸干；
[0009] (2)取步驟（1)的產物，在無水乙醇中與氯化亞錫發(fā)生反應，用二氯甲烷萃取，減 壓蒸干；
[0010] (3)取步驟（2)的產物，在甲醇和水中與氫氧化鋰發(fā)生反應，減壓蒸干，得到式 (I )所示化合物。
[0011] 式（I )所示化合物的制備方法具體包括如下步驟：
[0012] (1)將650mg乙酰乙酸乙酯溶于20mL蒸餾水，然后加入I. 06g N-溴代丁二酰亞胺 并室溫反應0. 5h，然后加入750mg 4-硝基鄰苯二胺并室溫反應16小時，然后用乙酸乙酯萃 取，收集有機相，減壓蒸干，得到化合物2 ;
[0013] (2)將500mg化合物2溶于15mL無水乙醇，然后加入570mg氯化亞錫并室溫反應 4h，然后加入20mL IM NaOH水溶液，然后用二氯甲烷萃取，收集有機相，減壓蒸干，得到化合 物3 ;
[0014] (3)取230mg化合物3，溶于甲醇-水混合液（將5mL甲醇和2mL水混合，得到甲 醇-水混合液），然后加入120mg氫氧化鋰并室溫反應16小時，減壓蒸干，得到式（I )所 示的化合物。
[0015] 本發(fā)明還保護一種人工抗原，為式（I )所示化合物與載體蛋白的偶聯物。
[0016] 所述人工抗原的結構式具體如下：
[0017]
[0018] 所述載體蛋白可為人血清白蛋白（HSA)、牛血清白蛋白（BSA)、兔血清白蛋白 (RSA)、甲狀腺球蛋白（TG)、卵清蛋白（OVA)或血蘭蛋白（KLH)等。
[0019] 所述人工抗原具體可為式（I )所示的化合物與人血清白蛋白的偶聯物。所述人 工抗原中，式（I )所示的化合物和人血清白蛋白的偶聯物的偶聯比具體可為1:8。
[0020] 所述人工抗原的制備方法包括如下步驟：式（I )所示化合物與人血清白蛋白進 行重氮偶聯反應，得到偶聯物。
[0021] 所述人工抗原的制備方法具體如下：將25mg式（I )所示化合物溶于2mL水，然 后加入2mL IM鹽酸水溶液，然后依次加入20mg亞硝酸鈉和200mg人血清白蛋白，混勾，然 后2-8°C攪拌反應1-2小時（具體可4°C、120rpm攪拌反應2小時），然后在PBS緩沖液中 透析，得到人工抗原。
[0022] 本發(fā)明還保護所述人工抗原在制備抗體中的應用。
[0023] 以所述人工抗原為免疫原得到的抗體也屬于本發(fā)明的公開范圍。所述抗體可為單 克隆抗體或多克隆抗體。所述多克隆抗體可為兔源抗體、鼠源抗體、馬源抗體、羊源抗體、豬 源抗體或豚鼠源抗體。所述抗體具體可為將所述人工抗原免疫新西蘭大耳兔后得到的血 清。
[0024] 本發(fā)明還保護所述抗體在檢測喹乙醇殘留標志物中的應用。
[0025] 本發(fā)明還保護用標記酶標記式（I )所示化合物得到的酶標抗原。所述標記酶可 為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。所述酶標抗原中，所述辣根過氧化物酶可通過EDC法 或高碘酸鈉法與式（I )所示化合物交聯。
[0026] 本發(fā)明還包括所述酶標抗原在檢測喹乙醇殘留標志物中的應用。
[0027] 本發(fā)明還保護一種用于檢測喹乙醇殘留標志物的試劑盒，包括所述酶標抗原和所 述抗體。
[0028] 所述試劑盒由如下組件組成：包被有多克隆抗體的酶標板，標準溶液1，標準溶液 2,標準溶液3,標準溶液4,標準溶液5,標準溶液6,酶標抗原溶液，濃縮洗滌液，濃縮顯色 液，顯色液稀釋液，終止液；
[0029] 標準溶液I :PBS緩沖液；
[0030] 標準溶液2 :含有0· 30 μ g/LMQCA的PBS緩沖液；
[0031] 標準溶液3 :含有I. 00 μ g/LMQCA的PBS緩沖液；
[0032] 標準溶液4 :含有3. 00 μ g/LMQCA的PBS緩沖液；
[0033] 標準溶液5 :含有10. 00 μ g/LMQCA的PBS緩沖液；
[0034] 標準溶液6 :含有30. 00 μ g/LMQCA的PBS緩沖液；
[0035] 酶標抗原溶液：將5mg式（I )所示化合物溶于ImL水，然后逐滴加入0· 5mLEDC 水溶液（含5mg EDC)和0· 5mL NHS水溶液（含3mg NHS)并混勻，然后4°C攪拌5min，然后 加入ImL 20mg/mL HRP溶液（將辣根過氧化物酶溶于PBS緩沖液，得到HRP溶液）并4°C、 120rpm攪拌反應16小時，然后在生理鹽水中透析，得到酶標抗原溶液；
[0036] 濃縮洗滌液：含有0· 5% (質量百分含量）吐溫-20的PBS緩沖液；
[0037] 濃縮顯色液：濃度為lmg/ml的四甲基聯苯胺溶液（溶劑為二甲基甲酰胺）；
[0038] 顯色液稀釋液：含有0. 2M磷酸氫二鈉和0. 2M檸檬酸的水溶液，pH5. 0 ;
[0039] 終止液：lmol/L硫酸溶液；
[0040] 包被有多克隆抗體的酶標板的制備方法：①取所述抗體，用包被緩沖液（pH9. 6、 0. 05M的碳酸鹽緩沖液）稀釋，得到蛋白濃度為0. 2 μ g/mL的溶液；②取酶標板，每孔加入 150 μ L步驟①制備的溶液，37°C靜置2h，然后4°C靜置16小時，棄去孔內液體，用洗滌液 (將濃縮洗滌液用水稀釋至10倍體積，即為洗滌液）洗滌3次（每次30秒），拍干；③完成 步驟②后，取所述酶標板，每孔加入250 yL含5% (質量百分含量）脫脂牛奶的PBS緩沖 液，37°C溫育1小時，棄去孔內液體，干燥后得到包被有多克隆抗體的酶標板。
[0041] 以上任一所述喹乙醇殘留標志物具體可為3-甲基喹噁啉-2-羧酸。
[0042] 獸藥半抗原的設計總體來說就是對獸藥分子的電性和空間性的模擬。半抗原與待 測物結構盡可能相似是半抗原設計的一個主要原則。目前制備小分子半抗原的抗體常規(guī)方 法是選擇具有毒理學意義的原型藥物或代謝產物作為待測物，設計合成保留待測物分子結 構特征并帶有活性基團的人工半抗原，通過鍵合的方法使半抗原和蛋白質載體偶聯制備免 疫原，經動物免疫程序制備針對半抗原的特異性抗體。待測物分子中存在-C00H、-OH或-NH 2 等易于和蛋白質或間隔臂發(fā)生偶聯的官能團，常被用作連接點來制備免疫原。目前已有檢 測MQCA的方法大多數是直接在MQCA分子的-COOH位置設計改造抗原。實際上，在合成人 工抗原的過程中，即使半抗原絕大部分的官能團與待測物都是一致的，但在藥物分子與載 體蛋白連接的部位很容易受到屏蔽。以測定喹噁啉類藥物研究為例，如果選擇在-COOH位 置進行人工抗原設計和改造并偶聯載體蛋白，MQCA的部分特征性基團和結構（-C00H、氮雜 環(huán)）不能充分暴露作為B淋巴細胞的抗原表位，進而影響抗體靈敏度或特異性。因此，連接 位點的選擇對于抗體質量至關重要，這就要求對半抗原進行科學合理的設計與改造。
[0043] 本發(fā)明提供的半抗原，既完整保留喹乙醇殘留標志物分子特征性基團和結構 (-C00H、氮雜環(huán)），同時又帶有便于發(fā)生鍵合反應的連接基團-NH 2(便于通過鍵合的方法使 半抗原和蛋白質載體偶聯制備人工抗