苯乙醇胺a半抗原、抗原及其制備方法和應用
【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于食品安全檢測技術領域，具體涉及苯己醇胺A半抗原、抗原、單克隆抗 體制備方法及其應用。
【背景技術】
[0003]目-受體激動劑在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中被用于作為飼料添加劑，如之前為人們所熟知的 克倫特羅等，送一類藥物可W減少脂肪，增加瘦肉，提高豬的單位經濟價值，但是它們都有 危險的副作用，輕則導致必律不整，嚴重一點就會導致必臟病。
[0004] 苯己醇胺A，又稱"克倫己胺"，化學式；2-[4- (4-硝基苯基）了基-2-基氨 基]-1-甲氧基苯己醇，分子式；C19肥4N204,分子量；344,是新一代的瘦肉精。四川省廣安 市廣安區(qū)要山鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站對某養(yǎng)豬場例行違禁藥物監(jiān)測中，用萊克多己胺測試卡分別檢 測母豬、仔豬和育肥豬尿液，發(fā)現(xiàn)該場育肥豬尿檢呈陽性，之后確認是新型添加物苯己醇胺 A。送種瘦肉精新品種棍現(xiàn)市場，再次敲響中國食品安全警鐘。因此被農業(yè)部發(fā)布的第1519 號公告列為"禁止在和動物飲水中使用的物質"。公告稱，根據(jù)《飼料和飼料添加劑管理條 例》有關規(guī)定，禁止在飼料和動物飲水中使用苯己醇胺A等物質。各級畜牧飼料管理部口要 加強日常監(jiān)管和監(jiān)督檢測，嚴肅查處在飼料生產、經營、使用和動物飲水中違禁添加苯己醇 胺A等物質的違法行為。
[0005] 目前，檢測苯己醇胺A的方法主要為儀器方法--高效液相色譜質譜法，送類方法 需要專業(yè)的儀器設備和專業(yè)的人員進行操作，前處理繁雜，費時，不適合大量樣本的篩查和 基層人員操作。免疫化學分析由于在抗原抗體的定性定量方面獨特的優(yōu)勢和操作簡便快 速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點彌補了理化分析的不足。苯己醇胺A人工抗 原的制備為送一方法的實施奠定了重要基礎。影響免疫化學分析質量的根本因素是抗體的 特異性與親和性，送些性質又決定于免疫半抗原分子的結構，因此免疫半抗原的分子設計 與合成就是產生特異性抗體和建立小分子獸藥殘留快速檢測技術的最基礎和最關鍵的步 驟。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種苯己醇胺A半抗原、抗原、特異性抗體制備方法及其應 用。
[0007] 本發(fā)明提供的苯己醇胺A半抗原，其結構為式I所示：
式I 本發(fā)明還保護式I所示化合物的制備方法，包括如下步驟： 苯己醇胺A138mg溶于IOmlImol/L肥1和4ml二甲基亞諷中；加入 鋒粉100mg，8(TC水浴攬拌反應30min，冷卻過濾，濾液調抑8.0,20ml己酸己醋萃取2 次，合并有機相，真空干燥；將殘留物IOmlDMF溶解，加入碳酸鐘60mg，賄己酸82mg，9(TC加 熱反應化，降低至室溫，加入50ml蒸傭水，IM鹽酸調抑6. 0, 50ml己酸己醋萃取2次，合并 有機相，無水硫酸鋼干燥，過濾，真空干燥濾液，殘留物即為半抗原。
[0008] 本發(fā)明所提供的苯己醇胺A抗原，是將苯己醇胺A半抗原與載體蛋白偶聯(lián)獲得的 抗原。
[0009] 所述苯己醇胺A抗原，其結構為式II所示：
本發(fā)明還保護所述苯己醇胺A抗原的制備方法，包括如下步驟： 稱取半抗原IOmg溶于2mlDMF，加入邸C4. 3mg，N服5.Img,室溫攬拌反應化；50mg BSA溶于5ml0.IM碳酸氨鋼緩沖液，將上述活化藥物逐滴 加入到蛋白溶液中，室溫攬拌過夜，PBS4度透析72小時，期間換透析液6 次。將透析液在無菌條件下過0.22Um孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。
[0010] 同法合成包被原。
[0011] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白度SA)，卵清蛋白（OVA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍蛋白（KLH)等。
[0012] 所述苯己醇胺A抗原可W作為免疫原制備苯己醇胺A特異性抗體，也可W作為包 被原制備酶柄板。
[0013] 所述抗體具體可為單克隆抗體。
[0014] 式I所示產物、所述苯己醇胺A抗原、所述抗體均可應用于檢測苯己醇胺A。
[0015] 本發(fā)明還公布了應用苯己醇胺A抗原和苯己醇胺A單克隆抗體制備得到的酶聯(lián)免 疫試劑盒。
[0016] 所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，是由包被有苯己醇胺A抗原的酶標板、酶標抗體工作 液、苯己醇胺A系列標準品、底物顯色液、終止液、濃縮復溶液、濃縮洗涂液。
[0017] 本發(fā)明依靠免疫學、免疫化學基本原理和殘留分析技術手段，設計、合成小分子目 標分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動物制備針對小分子分析物 的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學反應，定量的檢測樣本中微量小分子目標分 析物，具有特異、靈敏、準確、快速、方便、廉價等特點。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本較低， 半抗原產率較高。本發(fā)明克服了現(xiàn)有檢測技術中對苯己醇胺A樣品預處理復雜、耗時、且需 要大量有機溶劑萃取，W及在檢測過程中要用到精密昂貴的檢測儀器而不適于推廣使用等 缺點。本發(fā)明的苯己醇胺A人工抗原，通過免疫動物可產生了針對苯己醇胺A的特異性抗 體，用于快速檢測食品中的苯己醇胺A殘留，具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高、特 異性強等諸多優(yōu)點。
【附圖說明】
[0018] 圖1為苯己醇胺A酶聯(lián)免疫檢測試劑盒標準曲線。
【具體實施方式】
[0019]W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設置H次重復實驗，結果取平 均值。人血清白蛋白簡稱HSA。
[0020] 實施例1、制備苯己醇胺A半抗原 苯己醇胺A138mg溶于IOmlImol/L肥1和4ml二甲基亞諷中；加入 鋒粉100mg，8(TC水浴攬拌反應30min，冷卻過濾，濾液調抑8.0,20ml己酸己醋萃取2 次，合并有機相，真空干燥；將殘留物IOmlDMF溶解，加入碳酸鐘60mg，賄己酸82mg，9(TC加 熱反應化，降低至室溫，加入50ml蒸傭水，IM鹽酸調抑6. 0, 50ml己酸己醋萃取2次，合并 有機相，無水硫酸鋼干燥，過濾，真空干燥濾液，殘留物即為半抗原。
[0021] 苯己醇胺A半抗原的結構式如式I所示。
[0022] 實施例2、苯己醇胺A人工抗原的制備和鑒定 一、苯己醇胺A免疫抗原的合成 稱取半抗原IOmg溶于2mlDMF，加入邸C4. 3mg，N服5.Img,室溫攬拌反 應化；50mgBSA溶于5ml0.IM碳酸氨鋼緩沖液，將上述活化藥物逐滴加入到蛋白溶 液中，室溫攬拌過夜，PBS4°C透析72小時，期間換透析液6次。將透析液在無菌條件下過 0.22Um孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。
[0023] 苯己醇胺A免疫抗原的結構式如式II所示。
[0024] 二、苯己醇胺A包被抗原的合成 稱取半抗原IOmg溶于2mlDMF，加入邸C4. 3mg，N服5.Img,室溫攬拌反 應化；50mgOVA溶于5ml0.IM碳酸氨鋼緩沖液，將上述活化藥物逐滴加入到蛋白溶 液中，室溫攬拌過夜，PBS4°C透析72小時，期間換透析液6次。將透析液在無菌條件下過 0.22Um孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。
[0025] 二、苯己醇胺A人工抗原的鑒定 按合成苯己醇胺A免疫抗原和包被抗原反應所用的半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產物的比 例，分別進行紫外（200nnT400nm)掃描鑒定，并通過比較H者在同一波長下的吸光值計算 其結合比。產物的紫外光譜圖與載體蛋白相比發(fā)生了變化，說明半抗原已經與載體蛋白成 功偶聯(lián)制得苯己醇胺A人工抗原。經計算，苯己醇胺A半抗原分子與BSA分子的結合比為 16.8:1，苯己醇胺A半抗原分子與OVA分子的結合比為11. 5:1。
[0026] 實施例3、酶標單抗的制備和特異性鑒定 一、苯己醇胺A單抗的制備 1、用上述制備出的免疫原按IOOyg/只，W生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體 積混勻，頸背部皮下注射免疫6~8周齡Ba化/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天W免疫原與 弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天W免疫復合物IOOyg/只，不加 弗氏佐劑再追加免疫一次。
[0027] 2、按常規(guī)方法進行，取免疫小鼠的脾細胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞 (SP2/0)混合，然后在45s內緩慢加入預熱的融合劑（PEG4000)進行融合，用HAT培養(yǎng)基懸 浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37C，5 %C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天 后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時候進行全換液。
[0028] 3、細胞融合后，待細胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細 胞。初選采用間接化ISA方法，W包被抗原（預先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和 陽性血清稀釋度）包被酶標板，加入被測孔培養(yǎng)上清，賠育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和 IgM-HRP,OPD進行顯色反應。篩選出的陽性孔再用間接競爭化ISA方法篩選，先將細胞上 清與100yg/mL的苯己醇胺A等體積混合，37C水浴作用30min，再加入到包被好的酶標板 中。同時用PBS取代苯己醇胺A作對照，其余步驟同上。若經苯己醇胺A阻斷后的0〇45。皿 值下降到對照孔的50%W下，則判為陽性，經2^3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法 進行亞克隆化。
[0029] 4、將2^3次亞克隆建株后的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，收集上清液用間接化ISA測定 效價，凍存；并取8~10周齡Ba化/c小鼠腹腔注射液體石蠟0. 5mL/只，7~10日后腹腔注射 雜交瘤細胞廣2XIO6/只，7^10日后抽取小鼠腹水，離必取上清，測定效價，并凍存?zhèn)溆谩?br>[0030] 二、酶標抗體的制備 (1) 稱取辣根過氧化物酶（HRP) 2mg溶解于0.5血水中，加入0.5血0.06mol/L 化1〇4溶液，4°C避光作用30min; (2) 加入160mmol/L的己二醇0. 5mL,室溫作用30min; (3) 加入步驟一制備的苯己醇胺A單抗2mg,混勻后裝入處理過的透析袋中，置1000 血的0. 05mmol/L碳酸鋼緩沖液中透析，4°C過夜； (4) 透析液吸至10血的離必管中，加0. 25血5g/L的NaBH4溶液，混勻后置4°C2h; (5) 加入等體積的飽和硫酸倭溶液，4°C作用30min后4°C下3000r/min離必25min, 棄上清； (6) 將沉淀溶于1. 5血0. 02mol/LpH7. 4的PBS中，吸入透析袋內，在0. 02mol/LpH 7. 4PBS透析，4°C過夜（中途更換PBS3次）； (7) 將透析袋中液體吸至微量離必管中，4°C下100(K)r/min離