本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的載體。

背景技術(shù)：

細(xì)胞培養(yǎng)是指在合適的培養(yǎng)條件下，動(dòng)物細(xì)胞離體生長(zhǎng)和增殖，并保持其特征和功能的技術(shù)。來(lái)自于動(dòng)物實(shí)體組織的大多數(shù)細(xì)胞需要貼壁單層生長(zhǎng)。只要它們沒(méi)有轉(zhuǎn)化為非貼壁依賴(lài)性的，必須貼附在合適的固體介質(zhì)上并鋪展，才能開(kāi)始生長(zhǎng)。

傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)是使用細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)皿經(jīng)過(guò)處理適于細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)，一個(gè)傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿提供了78.52cm²并可以可支持10⁶-10⁷個(gè)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)。隨后，人們開(kāi)始使用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，滾瓶、以及中空纖維等裝置進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。此種方法工藝勞動(dòng)強(qiáng)度大，細(xì)胞產(chǎn)量低，產(chǎn)品批間差異大，且容易造成污染，耗時(shí)耗力，并不能滿足現(xiàn)今社會(huì)上對(duì)細(xì)胞產(chǎn)物大批量培養(yǎng)的需求。

微載體是細(xì)胞培養(yǎng)中所使用的一類(lèi)無(wú)毒性、非剛性、密度均一、透明的小顆粒。能使貼壁依賴(lài)性細(xì)胞貼附在顆粒表面進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而增加細(xì)胞貼附生長(zhǎng)的面積，有利于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)和收集。

最早使用微載體培養(yǎng)技術(shù)的是1967年Van Wezel利用離子交換凝膠(DEAE-Sephadex A50)作為載體，輕微攪動(dòng)即可使該離子交換凝膠成為微小的顆粒懸浮在培養(yǎng)基中，由于這種微載體帶有電荷，利于細(xì)胞貼附于載體上進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，而且載體處于懸浮狀態(tài)不僅可大大增加細(xì)胞附著面積，又使細(xì)胞能與培養(yǎng)基充分接觸，進(jìn)而有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此能達(dá)到大量培養(yǎng)細(xì)胞的目的。

微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，由于其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，且放大容易，已廣泛用于培養(yǎng)各種類(lèi)型細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。良好的細(xì)胞培養(yǎng)微載體具有以下特點(diǎn)：表面積/體積(S/V)大，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長(zhǎng)情況；簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，重現(xiàn)性好；培養(yǎng)基利用率較高；容易進(jìn)行放大培養(yǎng)；細(xì)胞收獲過(guò)程不復(fù)雜；勞動(dòng)強(qiáng)度??；培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。目前已開(kāi)發(fā)了多種商業(yè)化的微載體，包括葡聚糖微載體、聚賴(lài)氨酸液體微載體、大孔明膠微載體、纖維素微載體、殼聚糖微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚苯乙烯微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。

大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)是通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)病毒疫苗或蛋白產(chǎn)品的有效途徑。貼壁依賴(lài)性細(xì)胞貼附在微載體上利用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)成為迄今最常用、最有效的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)模式之一。

目前市場(chǎng)上使用的商品化微載體主要有：如GE公司的CytodexⅠ、CytodexⅡ、CytodexⅢ和Thermo公司的Cytopore，Cytoline，Biosilon、CultispherG等，以上的微載體因?yàn)槠渲谱餍枰?jīng)過(guò)多種生物反應(yīng)溶劑、高分子聚合物材料以及添加劑、還原劑等相互反應(yīng)、中和以及清洗，工序繁多，工藝復(fù)雜，所以?xún)r(jià)格昂貴，目前的市場(chǎng)價(jià)已達(dá)每公斤3-10萬(wàn)元人民幣，還時(shí)常出現(xiàn)供貨不及時(shí)的現(xiàn)象。而且由于此類(lèi)微載體的尺寸在幾微米到幾百微米不等，體積微小，在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)需要大量的微載體置入反應(yīng)器內(nèi)，容易造成微載體堆積，使得相連的微載體之間的空隙很小，細(xì)胞生長(zhǎng)密度比較大，在底部及中心部位的細(xì)胞就很難獲得細(xì)胞增殖所需的充足養(yǎng)分，以及影響細(xì)胞消耗過(guò)的廢物排放，使得細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)狀態(tài)變差，容易造成底部的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至死亡。受損死亡的細(xì)胞從載體上脫落進(jìn)而影響其它細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果是干細(xì)胞，則更容易產(chǎn)生非特異性分化。

因此，開(kāi)發(fā)出細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中適合于多種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)所用的載體，具有廣泛的應(yīng)用前景，對(duì)促進(jìn)生物反應(yīng)器載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展具有重要的歷史意義。

本發(fā)明的目的是為生物細(xì)胞的增殖培養(yǎng)提供一種生長(zhǎng)載體，使其可以擁有更大的細(xì)胞吸附生長(zhǎng)空間，并在載體之間的空隙形成適合細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，可以大規(guī)模培養(yǎng)所需的細(xì)胞。并隨著培養(yǎng)容器或者反應(yīng)器的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)攪拌培養(yǎng)基的功能，避免由于傳統(tǒng)的反應(yīng)器采用機(jī)械式攪拌原理而產(chǎn)生剪切力，從而造成細(xì)胞受損，甚至死亡。

此外，也可以給載體增加可磁化物質(zhì)，使之可以通過(guò)外部磁場(chǎng)控制載體的運(yùn)動(dòng)、分布以及狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)更均勻的攪拌培養(yǎng)基液體和形成更優(yōu)的細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境。

本發(fā)明具有結(jié)構(gòu)及制造工藝簡(jiǎn)單、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，適用于作為大規(guī)模培養(yǎng)生物細(xì)胞的生長(zhǎng)載體。其特點(diǎn)是：將載體置入培養(yǎng)容器或者反應(yīng)器中，通過(guò)磁場(chǎng)或者依靠其浮力或者重力，使得載體在培養(yǎng)容器或者反應(yīng)器中上浮、下沉或者懸浮，并在此過(guò)程中攪動(dòng)培養(yǎng)基溶液，使液體中的養(yǎng)分充分均勻化，可以為培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞提供良好的代謝支持，并可以讓貼壁細(xì)胞更容易吸附在載體上生長(zhǎng)、增殖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一種新型的用于細(xì)胞培養(yǎng)的載體。

本發(fā)明所涉及的一種新型的細(xì)胞培養(yǎng)的載體，其主要是由單一材料或混合物材料整體注塑成型為實(shí)芯或空芯形體，或由單一材料或混合物材料整體加工成型為實(shí)芯或空芯形體，或由外包表殼、內(nèi)置芯物等構(gòu)成實(shí)芯或空芯形體，或由載體主體、內(nèi)置芯物、封蓋等構(gòu)成實(shí)芯或空芯形體。其特征在于，整個(gè)載體成型后形成一個(gè)密閉的整體，載體的尺寸值范圍為：大于等于1mm，小于培養(yǎng)容器的內(nèi)壁邊長(zhǎng)；這一特點(diǎn)使之明顯不同于其它發(fā)明中的微載體，其主要是載體外壁提供給細(xì)胞附著生長(zhǎng)、實(shí)現(xiàn)載體攪拌細(xì)胞培養(yǎng)容器里液體的功能并使懸浮細(xì)胞均勻分布。

以上所述的載體可由多個(gè)結(jié)構(gòu)零件結(jié)合組成一個(gè)整體形體，各個(gè)零件采用二次或多次注塑連接成密封的整體，或采用膠水粘接成一個(gè)密封的整體，或采用超聲波焊接成一個(gè)密封的整體，或在結(jié)構(gòu)上采用過(guò)盈配合壓合成一個(gè)密封的整體，或采用螺紋擰合成一個(gè)密封的整體，或采用激光燒結(jié)成一個(gè)密封的整體，或采用加熱熱熔成一個(gè)密封的整體等各種結(jié)合方式。

以上所述的載體是形狀為球形或橢球形或圓餅形或擁有多邊形輪廓的平滑無(wú)棱角物體。

以上所述的載體的最優(yōu)的尺寸值范圍為：大于等于1mm，但小于培養(yǎng)容器的內(nèi)壁邊長(zhǎng)。

以上所述的載體的外壁表面可制作成光滑面，或可以制作成圓滑的凹凸曲面，或可以制作成波紋面等多種曲面形式。

以上所述的載體成型后的密度與培養(yǎng)基液體的密度比值應(yīng)滿足：0<d<2，d為載體密度與培養(yǎng)基液體密度比值，最優(yōu)的比值范圍為：0.95<d<1.05，以保證其在培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)液里可憑自身浮力或重量實(shí)現(xiàn)上浮、下沉或懸浮在培養(yǎng)基液體中。

以上所述的內(nèi)置芯物可由坡莫合金、硅鐵軟磁合金、四氧化三鐵和鐵、鈷、鎳及其合金等導(dǎo)磁性高的順磁性金屬材料制成。以保證載體在沒(méi)有磁場(chǎng)的環(huán)境下，沒(méi)有磁性，從而不會(huì)產(chǎn)生相互吸引聚集功能。而在有磁場(chǎng)的環(huán)境下，能受到磁力控制進(jìn)行運(yùn)動(dòng)

以上所述的內(nèi)置芯物可嵌在載體主體端面開(kāi)口處，或可以放置在載體主體內(nèi)的凹槽底部，將封蓋嵌裝在載體主體上部密封。

以上所述的內(nèi)置芯物由單一的塊狀、片狀或顆粒組成，或由多個(gè)塊狀、片狀或顆粒組成，或由粉末組成，可以根據(jù)磁場(chǎng)方向運(yùn)動(dòng)。

以上所述的載體主體材質(zhì)可以采用聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、PBS樹(shù)脂、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、硝酸纖維、聚氨酯等塑料材質(zhì)，也可以采用玻璃、陶瓷等非金屬材質(zhì)，還可以采用不銹鋼等金屬或者合金金屬材質(zhì)。

以上所述的載體在置入細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)并培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，載體的尺寸值應(yīng)滿足x<L/2，其中x為載體的任意徑長(zhǎng)(如圓形珠子的直徑，橢圓型珠子的最長(zhǎng)徑或最短徑)，L為培養(yǎng)容器內(nèi)部型腔中最短的兩個(gè)邊長(zhǎng)中任意一個(gè)長(zhǎng)度，在邊長(zhǎng)的尺寸能滿足裝入多個(gè)載體時(shí)，其尺寸值范圍應(yīng)滿足以下公式：L/n>x>L/(n+1/2)；最佳的尺寸值范圍為；L/(n+1/10)>x>L/(n+1/3)。n為載體的個(gè)數(shù)。

以上所述的載體可以在表面采用親水或疏水處理，或表面附著溫敏性分子聚合物等物質(zhì)。

本發(fā)明相對(duì)于市場(chǎng)上現(xiàn)有的載體，具有以下一些優(yōu)點(diǎn)：

①、本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，加工制造方便，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，成本低，可以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化、大批量的生產(chǎn)制造。

②、本發(fā)明由于加工及生產(chǎn)制造成本低，采用一次性使用方式培養(yǎng)細(xì)胞，無(wú)需重復(fù)多次使用，從而避免產(chǎn)生殘留污染、清洗不便以及滅菌的問(wèn)題。

③、本發(fā)明可以在細(xì)胞培養(yǎng)容器或反應(yīng)器內(nèi)，依靠磁場(chǎng)或者重量與培養(yǎng)基溶液的比重來(lái)實(shí)現(xiàn)上浮、下沉和懸浮的功能，以此在培養(yǎng)基溶液內(nèi)實(shí)現(xiàn)攪拌的功能。

④、本發(fā)明由于其本體尺寸比較大，在1mm以上，可以在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，載體堆積后，能在載體之間形成較大的空間，滿足懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)以及細(xì)胞成長(zhǎng)所需養(yǎng)分的交換。

本發(fā)明通過(guò)結(jié)構(gòu)上的改進(jìn)極大的提高了培養(yǎng)細(xì)胞的載體的生產(chǎn)制造成本，優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)的難度，可以方便簡(jiǎn)捷地實(shí)現(xiàn)多種類(lèi)型細(xì)胞的增殖，并可以規(guī)?；?、大批量的培養(yǎng)細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明單一材質(zhì)球形載體的截面結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明空心球形導(dǎo)磁載體的截面結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為本發(fā)明復(fù)合導(dǎo)磁球形載體的截面結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4為本發(fā)明表面處理球形載體的截面結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

在下文中將參考以上的附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，參考這些附圖，其中在整個(gè)視圖中，相似的參考特性指定為類(lèi)似的或相應(yīng)的部件。在本發(fā)明中的實(shí)施例中，哪些判斷為能夠令本發(fā)明的主旨造成不必要的模糊的公知性能和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述被忽略掉。

以上所述的用于細(xì)胞培養(yǎng)的載體的實(shí)施例，是為了對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不應(yīng)理解為完全覆蓋本發(fā)明所包括的內(nèi)容。并且不用于限制所有容器結(jié)構(gòu)件的材料的種類(lèi)，以及在對(duì)于本實(shí)施例中所定義的所基本參數(shù)的限制。

實(shí)施例一：

如附圖1所示的單一材質(zhì)球形載體的截面結(jié)構(gòu)示意圖，單一材質(zhì)的球形載體可包括：實(shí)心球形載體1和空心球形載體2。實(shí)心球形載體1其特征在于：采用聚苯乙烯或聚丙烯或聚碳酸酯或聚四氟乙烯等聚合物材料注塑或機(jī)械加工成為實(shí)心球體，也可采用或玻璃、陶瓷等非金屬材質(zhì)加工成為實(shí)心球體。球體的直徑為6mm，由于其整體的密度比培養(yǎng)基液體的密度大，所以在反應(yīng)器或培養(yǎng)容器內(nèi)，該載體會(huì)沉降在培養(yǎng)基液體的底部。空心球形載體2其特征在于：采用聚苯乙烯或聚丙烯或聚碳酸酯或聚四氟乙烯等聚合物材料注塑或機(jī)械加工成為空心球體，也可采用或玻璃、陶瓷等非金屬材質(zhì)加工成為空心球體。球體的直徑為6mm，由于其整體的密度比培養(yǎng)基液體的密度小，載體會(huì)懸浮在反應(yīng)器或者培養(yǎng)容器中培養(yǎng)基液體的上面。在培養(yǎng)過(guò)程中，需要反應(yīng)器或培養(yǎng)容器能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)動(dòng)或擺動(dòng)，能夠使載體上下或左右或按設(shè)定軌跡運(yùn)動(dòng)。

實(shí)施例二：

如附圖2所示的空心球形導(dǎo)磁載體的截面結(jié)構(gòu)示意圖，其特征在于：主要由外殼1和內(nèi)芯2構(gòu)成。外殼1采用聚苯乙烯或聚丙烯或聚碳酸酯或聚四氟乙烯等聚合物材料做為中間為空芯的球體外殼，內(nèi)芯2采用帶有導(dǎo)磁性能的四氧化三鐵或者硅鋼片。內(nèi)芯2置入在外殼1內(nèi)部的空間內(nèi)。整個(gè)球體的直徑為6mm，內(nèi)徑空芯直徑為4mm。載體通過(guò)置入四氧化三鐵或者硅鋼片的重量來(lái)控制整個(gè)載體的重量，使其整體的密度相對(duì)于培養(yǎng)基液體密度對(duì)比的大小來(lái)控制載體在培養(yǎng)基液體中上浮、懸浮或者下沉。使整個(gè)載體在有磁場(chǎng)的環(huán)境下，能夠?qū)崿F(xiàn)吸附細(xì)胞，并且載體能夠吸附在反應(yīng)器或培養(yǎng)容器的磁極端。載體在培養(yǎng)基液體中運(yùn)動(dòng)時(shí)，可起到攪拌培養(yǎng)基液體的作用，同時(shí)可以增大貼壁細(xì)胞的可增殖的表面積，提高培養(yǎng)的效率。

實(shí)施例三：

如附圖3所示的復(fù)合導(dǎo)磁球形載體的截面結(jié)構(gòu)示意圖，其特征在于：主要由球蓋1、封蓋2、磁芯3和球體4構(gòu)成。磁芯3置入球體4中間的空間內(nèi)，再將封蓋2蓋在球體4上端面上，使球體4內(nèi)的空間形成密閉的空間，再將球蓋壓住封蓋2合在球體4上，使載體形成一個(gè)圓形的密閉整體。球蓋1和球體4可由聚碳酸酯、聚丙烯、PBS樹(shù)脂、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、硝酸纖維、聚氨酯等材料注塑成型。磁芯3采用可導(dǎo)磁的四氧化三鐵或硅鋼片制成。封蓋2在不影響重量的情況下可以采用塑性材料注塑或者金屬、非金屬等材料加工制成。也可以用和磁芯3相同的材質(zhì)，增大磁性。球蓋1可以采用整體包裹封蓋2注塑在球體4上；也可以采用超聲波焊接在球體4上；也可以采用激光燒結(jié)使球蓋1和球體4粘接在一起，形成一個(gè)密閉的載體；還可以采用整體加熱，使球蓋1和球體4熔接形成密閉的整體。載體在磁場(chǎng)環(huán)境下能夠隨磁場(chǎng)的變化而運(yùn)動(dòng)，從而能在反應(yīng)器或培養(yǎng)容器中實(shí)現(xiàn)攪拌培養(yǎng)基液體的功能，并能作為貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的附著物，使得細(xì)胞在同一環(huán)境下取得最大化的培養(yǎng)效果，提高效率。

實(shí)施例四：

如附圖4所示的表面處理球形載體的截面結(jié)構(gòu)示意圖，其特征在于：主要由空心球體1和表面涂層2構(gòu)成。空心球體1由混合有導(dǎo)磁性的材質(zhì)制成，再在空心球體1表面附著一層無(wú)毒性的處理層。表面處理可以采用等離子親水或疏水處理，也可以采用附著溫敏性分子聚合物，也可以表面附著明膠或膠原蛋白等。處理過(guò)的載體表面無(wú)毒性，適合貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。同時(shí)由于里層的空心球體1帶有導(dǎo)磁性質(zhì)，可以在反應(yīng)器或培養(yǎng)容器中的磁場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)，在攪拌培養(yǎng)基液體的同時(shí)，作為貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)附著物，增大細(xì)胞培養(yǎng)的表面積，提高培養(yǎng)效率。

以上所述的載體的實(shí)施例，是為了對(duì)本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)中的進(jìn)一步說(shuō)明，不應(yīng)理解為完全覆蓋本發(fā)明所包括的內(nèi)容。并且不用于限制所有載體結(jié)構(gòu)件的材料的種類(lèi)，以及在對(duì)于本實(shí)施例中所定義的所基本參數(shù)的限制。