本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum)，菊科澤蘭屬，多年生草本或亞灌木，能快速形成單優(yōu)群落，并且會(huì)以多種方式抑制其它植物生長(zhǎng)，是一種世界性的惡性雜草，也是我國(guó)現(xiàn)存危害最大的一種外來(lái)植物。由于紫莖澤蘭含有多種有毒組分及惡臭組分，僅有澤蘭等極少數(shù)物種對(duì)其有采食現(xiàn)象。近年來(lái)雖然人們對(duì)紫莖澤蘭的治理采取了投放專(zhuān)性天敵、除草劑、植物防控等手段，但均收效甚微。
微生物作為一種高效、安全、無(wú)殘留的現(xiàn)代農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及科學(xué)研究中有著舉足輕重的地位。相應(yīng)地，針對(duì)紫莖澤蘭的微生物農(nóng)藥研發(fā)也成為近年來(lái)紫莖澤蘭防治領(lǐng)域的一個(gè)主要方向，但由于紫莖澤蘭本身含有多種抑菌物質(zhì)，導(dǎo)致研發(fā)工作至今也收效甚微。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其應(yīng)用，以該枯草芽孢桿菌作為活性成分的菌劑用于紫莖澤蘭的防控，效果好成本低。
本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌，專(zhuān)利申請(qǐng)人的菌株編號(hào)為ZLSY2；該菌株已于2016年12月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC),地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)：CGMCC No.13451,分類(lèi)命名：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。
本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌株的生物學(xué)特性為：
LB培養(yǎng)基(LB Medium)培養(yǎng)的菌落表面有褶皺，粗糙不透明，白色，污白色或微黃色，圓形，不規(guī)則。
菌體呈短桿狀，無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。最適溫度37℃。
淀粉水解實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，油脂水解實(shí)驗(yàn)陰性，石蕊牛奶陽(yáng)性，尿素實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；發(fā)酵葡萄糖可產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣；吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)陰性，硫化氫實(shí)驗(yàn)陰性，V-P陰性，M-R陽(yáng)性。
本發(fā)明菌株是通過(guò)從云南野外紫莖澤蘭寄生昆蟲(chóng)澤蘭實(shí)蠅(Procecidochares utilis Stone)的消化道篩分出來(lái)的。
本發(fā)明枯草芽孢桿菌的應(yīng)用是以其為活性成分制成菌劑防控紫莖澤蘭。
本發(fā)明枯草芽孢桿菌能對(duì)紫莖澤蘭產(chǎn)生生物侵染，造成紫莖澤蘭葉片及莖病變而快速致死。
以本發(fā)明枯草芽孢桿菌為活性成分制成菌劑防控紫莖澤蘭可以按以下方法：
一階段擴(kuò)繁培養(yǎng)：用標(biāo)準(zhǔn)固態(tài)LB培養(yǎng)基，加入體積為該固態(tài)培養(yǎng)基體積0.4～0.6％的紫莖澤蘭水提取物，調(diào)整pH值為6.5～7.5，倒平板培養(yǎng)皿冷卻，接種保藏的ZLSY2菌株，然后在37℃±3℃下培養(yǎng)23～25小時(shí)，得到一階段擴(kuò)繁培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)基；
二階段擴(kuò)繁培養(yǎng)：用標(biāo)準(zhǔn)液體LB培養(yǎng)基，加入體積為該液體培養(yǎng)基體積0.4～0.6％的紫莖澤蘭水提取物，調(diào)整pH值為6.5～7.5，接入一階段擴(kuò)繁培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)基，在37℃±3℃培養(yǎng)23～25小時(shí)，接種比例為：1cm2的一階段擴(kuò)繁培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)基接種于1.9～2.1L的該液體培養(yǎng)基；
將二階段擴(kuò)繁培養(yǎng)完成后的培養(yǎng)液，7～9℃下冷藏，取出靜置至室溫，1份體積的該培養(yǎng)液加5～10份體積的水稀釋后，直接噴灑在紫莖澤蘭葉片上，可一次或連續(xù)多次噴灑使用。
所說(shuō)紫莖澤蘭水提取物有市售商品，也按以下方法制得：取包含葉片在內(nèi)的紫莖澤蘭鮮品，粉碎后在40℃±5℃下，按紫莖澤蘭鮮品與水的質(zhì)量比為1:8～12的比例用水浸提1.8～2.2小時(shí)，取上清過(guò)濾后即得。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌用于紫莖澤蘭的防控，效果好成本低。
具體實(shí)施方式
實(shí)例1。
第一步：首選將篩分純化好的ZLSY2菌株，用標(biāo)準(zhǔn)固體LB培養(yǎng)基滅菌后，在未凝固前添加0.5％體積的紫莖澤蘭提取物，并調(diào)整pH值至7.0.倒平板，待冷凝后將ZLSY2接種至培養(yǎng)基上，在34℃培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)后，將帶菌培養(yǎng)基分割成1cm2的小塊備用。
第二步：配置標(biāo)準(zhǔn)液體LB培養(yǎng)基，滅菌后按體積比添加0.5％的紫莖澤蘭提取物，調(diào)整pH值至7.0，降溫至37℃，將上一步驟準(zhǔn)備好帶菌的1cm2小塊培養(yǎng)基按比例接種(添加)至液體培養(yǎng)基中，在34℃下培養(yǎng)24小時(shí)后取出降溫至8℃冷藏6小時(shí)。
第三步：將冷藏好的帶菌液體培養(yǎng)基取出，按體積比，培養(yǎng)基：水為1:10稀釋后，噴灑至紫莖澤蘭葉片表面即可。
實(shí)例2：
第一步：首選將篩分純化好的ZLSY2菌株，用標(biāo)準(zhǔn)固體LB培養(yǎng)基滅菌后，在未凝固前添加0.5％體積的紫莖澤蘭提取物，并調(diào)整pH值至7.0.倒平板，待冷凝后將ZLSY2接種至培養(yǎng)基上，在40℃培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)后，將帶菌培養(yǎng)基分割成1cm2的小塊備用。
第二步：配置標(biāo)準(zhǔn)液體LB培養(yǎng)基，滅菌后按體積比添加0.5％的紫莖澤蘭提取物，調(diào)整pH值至7.0，降溫至37℃，將上一步驟準(zhǔn)備好帶菌的1cm2小塊培養(yǎng)基按比例接種(添加)至液體培養(yǎng)基中，在40℃下培養(yǎng)24小時(shí)后取出降溫至8℃冷藏6小時(shí)。
第三步：將冷藏好的帶菌液體培養(yǎng)基取出，按體積比、培養(yǎng)基：水為1:10的比例稀釋后，噴灑至紫莖澤蘭葉片表面即可。
實(shí)例3：
第一步：首選將篩分純化好的ZLSY2菌株，用標(biāo)準(zhǔn)固體LB培養(yǎng)基滅菌后，在未凝固前添加0.5％體積的紫莖澤蘭提取物，并調(diào)整pH值至7.0.倒平板，待冷凝后將ZLSY2接種至培養(yǎng)基上，在35℃培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)后，將帶菌培養(yǎng)基分割成1cm2的小塊備用。
第二步：配置標(biāo)準(zhǔn)液體LB培養(yǎng)基，滅菌后按體積比添加0.5％的紫莖澤蘭提取物，調(diào)整pH值至7.0，降溫至37℃，將上一步驟準(zhǔn)備好帶菌的1cm2小塊培養(yǎng)基按比例接種(添加)至液體培養(yǎng)基中，在35℃下培養(yǎng)24小時(shí)后取出降溫至8℃冷藏6小時(shí)。
第三步：將冷藏好的帶菌液體培養(yǎng)基取出，按照體積比、培養(yǎng)基：水為1:5的比例稀釋后，噴灑至紫莖澤蘭葉片表面即可。
實(shí)例4：
第一步：首選將篩分純化好的ZLSY2菌株，用標(biāo)準(zhǔn)固體LB培養(yǎng)基滅菌后，在未凝固前添加0.5％體積的紫莖澤蘭提取物，并調(diào)整pH值至7.0.倒平板，待冷凝后將ZLSY2接種至培養(yǎng)基上，在40℃培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)后，將帶菌培養(yǎng)基分割成1cm2的小塊備用。
第二步：配置標(biāo)準(zhǔn)液體LB培養(yǎng)基，滅菌后按體積比添加0.5％的紫莖澤蘭提取物，調(diào)整pH值至7.0，降溫至37℃，將上一步驟準(zhǔn)備好帶菌的1cm2小塊培養(yǎng)基按比例接種(添加)至液體培養(yǎng)基中，在40℃下培養(yǎng)24小時(shí)后取出降溫至8℃冷藏6小時(shí)。第三步：將冷藏好的帶菌液體培養(yǎng)基取出，按體積比、培養(yǎng)基：水為1:5的比例稀釋后，噴灑至紫莖澤蘭葉片表面即可。
實(shí)例5。
將實(shí)例2所得的菌液按三種用量對(duì)紫莖澤蘭噴灑一次后，均產(chǎn)生生物侵染，造成紫莖澤蘭病變的實(shí)測(cè)效果見(jiàn)下表：
(表中：時(shí)間為噴灑菌液后到觀測(cè)記錄時(shí)經(jīng)過(guò)的時(shí)間，發(fā)病率為每100株紫莖澤蘭中的發(fā)病株所占百分比。滿足以下任一項(xiàng)條件認(rèn)定為發(fā)病株：1、該株紫莖澤蘭的莖顯著病變枯死；2、該株紫莖澤蘭的葉片出現(xiàn)超過(guò)2mm2的病變斑，并且這樣的病變斑數(shù)量不少于5個(gè)。用量的含義是每平方米紫莖澤蘭噴灑相應(yīng)體積的菌液。)
效果分析：基本上有這樣的規(guī)律，即紫莖澤蘭噴灑菌液后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重的病變感染，并且病變感染程度隨菌液用量的增加而加劇。