本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種遺傳性耳聾基因檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

目前市場上已有的耳聾基因檢測產(chǎn)品主要有博奧的九項遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測試劑盒(微陣列芯片法)和十五項遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測試劑盒(微陣列芯片法)；凱普的耳聾易感基因檢測試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法)；中生北控的四項耳聾基因檢測試劑盒(ARMS-PCR法)；濟(jì)南英盛的先天性耳聾基因檢測試劑盒(熒光PCR法)、藥物性耳聾基因檢測試劑盒(熒光PCR法)、耳聾基因GJB2 235delC檢測試劑盒(熒光PCR法)和PDS基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)；智海生物工程有限公司的藥物性耳聾基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)。盡管目前檢測耳聾的產(chǎn)品有很多，但是尚未有直接、快速、同時檢測多個突變位點(diǎn)的產(chǎn)品。

廈門大學(xué)相關(guān)專利《一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒及其制備方法與應(yīng)用》(專利公開號104263848A)是所有專利中檢測位點(diǎn)最多的，但也僅檢測23種非綜合征遺傳性耳聾基因突變位點(diǎn)，無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司相關(guān)專利《一種遺傳性耳聾基因檢測試劑盒》(專利公開號103352080A)僅檢測17種非綜合征遺傳性耳聾易感基因突變，陳瑛《中國人群耳聾基因篩查試劑盒及其應(yīng)用》(專利公開號103911452A)檢測17種非綜合征遺傳性耳聾易感基因突變，北京科聆金儀生物技術(shù)有限公司《一種高特異性聾病易感基因檢測試劑盒及其應(yīng)用》(專利公開號102534031A)檢測12種聾病易感基因突變，這些檢測試劑盒檢測能力有限，或者通量低、或者耗時費(fèi)力，更重要的是難以同時對不同基因的多個突變位點(diǎn)進(jìn)行高通量檢測。本公司相關(guān)專利為《一種遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條及試劑盒》(專利開號104498609A)和現(xiàn)在本公司申請發(fā)明專利不屬于同一個技術(shù)平臺。

目前我國臨床應(yīng)用的檢測非綜合征遺傳性耳聾基因的試劑盒主要是基于液相芯片雜交法的原理開發(fā)的，實現(xiàn)在多管PCR體系中對多個基因中為數(shù)不多的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，如博奧生物技術(shù)有限公司、潮州凱普生物化學(xué)有限公司的十五項遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測試劑盒和耳聾易感基因檢測試劑盒能分別實現(xiàn)對15種和9種耳聾易感基因突變位點(diǎn)的檢測，但是這些方法或者所需專用儀器價格高、或者通量低、或者操作復(fù)雜耗時費(fèi)力。

除了上述的基于液相芯片雜交法的試劑盒，臨床上還有一種是基于熒光PCR技術(shù)的原理開發(fā)，如中生北控和濟(jì)南英盛生物技術(shù)有限公司開發(fā)的試劑盒僅能實現(xiàn)對耳聾易感基因的少數(shù)幾個位點(diǎn)進(jìn)行檢測，特別是濟(jì)南英盛的每個試劑盒只能對一個基因的少數(shù)幾個位點(diǎn)進(jìn)行檢測、檢測位點(diǎn)少、通量低、如需同時對一個樣本的幾個耳聾易感基因進(jìn)行檢測，需要同時使用三個試劑盒、成本高。

目前國內(nèi)還沒有針對中國人群多個耳聾易感基因的多個突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測的試劑盒。因此，有必要建立一種高通量、高效能、低成本的耳聾基因突變篩查方法，已實現(xiàn)臨床快速檢測或者規(guī)?；巳汉Y查。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可一次同時檢測與遺傳性耳聾相關(guān)的四個熱點(diǎn)基因中的30個突變位點(diǎn)的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒。

本發(fā)明提供一種遺傳性耳聾基因檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括PCR反應(yīng)液A、PCR反應(yīng)液B、PCR反應(yīng)液C、PCR反應(yīng)液D和PCR反應(yīng)液E；

所述PCR反應(yīng)液A包括如下引物和探針：

引物G2F1：5'-TAGTGATTCCTGTGTTGTGTG-3'；

引物G2R1：5'-AGCCTTCGATGCGGACCTTCTG-3'；

內(nèi)參引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；

內(nèi)參引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；

探針P1：5'-GTTTGTTCACACCCCCCAGGA-Z4-BHQ1

探針P2：5'-CAGCCACAATGAGGATC-3'；

探針P3：5'-TGCAGACAAAGTCGGCCT-3'；

探針P4：5'-TAGCACACGTTCTTGCAGCCTGGCTGCAG-3'；

探針P5：5'-CAGCTGCAGGGCCCATAG-3'；

探針P6：5'-CTTCTCGTCTCCGGTAGGC-Z4-3'；

探針P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；

所述PCR反應(yīng)液B包括如下引物和探針：

引物G2F2：5'-GACCTACACAAGCAGCATC-3'；

引物G2R2：5'-TTCAGCAGGATGCAAATTCCAGACAC-3'；

引物G3F1：5'-AGTTCCTCTTCCTCTACCTG-3'；

引物G3R1：5'-CACAGATGGTGAGTACGATGCAGACG-3'；

引物SF1：5'-AAATACCGAGTCAAGGAATG-3'；

引物SR1：5'-GCCTTGAAGGGTAAGCAACCATCTGTC-3'；

引物SF2：5'-GAACACTTTCTCGTATCCAGCAGC-3'；

引物SR2：5'-TCCATCTATATTTTACTTGTAAGTTC-3'；

引物SF3：5'-CACAGCTAAAGATTGTCCTC-3'；

引物SR3：5'-CCATCCCTGGAGCAAGAAGCAACAC-3'；

內(nèi)參引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；

內(nèi)參引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；探針P7：5'-AGGCGTTCGTTGCACTTCACCA-3'；

探針P8：5'-CTTCTTGGTAGGTCGGGCAAT-3'；

探針P9：5'-TAGCCCAATACTAACTCCCG-3'；

探針P10：5'-CCTGACTCTGCTGGTTGGAAT-Z4-3'；

探針P11：5'-GATAATAGGGAGAACTCCATTGT-3'；

探針P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；所述PCR反應(yīng)液C包括如下引物和探針：

引物SF4：5'-CTGGATTGCTCACCATTGTCGTCTG-3'；

引物SR4：5'-GTACTAAGAGGAACACCACAC-3'；

引物SF5：5'-TCATCCAGTCTCTTCCTTAG-3'；

引物SR5：5'-AGCCTTCCTCTGTTGCCATTCCTC-3'；

引物SF6：5'-GAGCAATGCGGGTTCTTTGACGAC-3'；

引物SR6：5'-TCTTGAGATTTCACTTGGTTC-3'；

內(nèi)參引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；

內(nèi)參引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；探針P12：5'-TTTGTTTTATTTCAGACGAT-3'；

探針P13：5'-CCTGAGAAGATGTTGCTGAT-3'；

探針P14：5'-GCCGTGCGGGAAAGAGCAGTG-3'；

探針P15：5'-TTTGATGGTCCATGATGC-Z4-3'；

探針P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；

所述PCR反應(yīng)液D包括如下引物和探針：

引物SF7：5'-AGATTCTTAGATTTTCCAGTCC-3'；

引物SR7：5'-AGAGGGTCTAGGGCCTATTCCTGATTG-3'；

引物SF8：5'-GTGAACGTTCCCAAAGTGCCAATCC-3'；

引物SR8：5'-ATACTGGACAACCCACATC-3'；

引物MF1：5'-CGCGGTCACACGATTAACCCAAGTC-3'；

引物MR1：5'-TGTTAAGCTACACTCTGGTTC-3'；

內(nèi)參引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；

內(nèi)參引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；

探針P16：5'-ATAAAATACTTACTGTGGACTT-3'；

探針P17：5'-TCCATAGCCTTCTGCTTGACTGTG-Z4-3'；

探針P18：5'-GAGATCACAGCGGGTGGTAAG-3'；

探針P19：5'-ATCACCCCCTCCCCAATA-3'；

探針P20：5'-CCACTATGCTTAGCCCTA-3'；

探針P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；

所述PCR反應(yīng)液E包括如下引物和探針：

引物MF1：5'-CGCGGTCACACGATTAACCCAAGTC-3'；

引物MR1：5'-TGTTAAGCTACACTCTGGTTC-3'；

引物MF2：5'-AGGCTCATTCATTTCTCTAAC-3'；

引物MR2：5'-CATGGGGTTGGCTTGAAACCAGC-3'；

引物MF3：5'-CCACAACACAATGGGGCTCACTCAC-3'；

引物MR3：5'-AGGGTGGTTATAGTAGTGTG-3'；

內(nèi)參引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；

內(nèi)參引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；

探針P21：5'-ACCGCCCGTCACCCTCCTCAA-3'；

探針P22：5'-TAGAGGAGACAAGTCGTAACAT-3'；

探針P23：5'-TTTGCCTAGATTTTATGTATACG-3'；

探針P24：5'-CGACCCCTTATTTACCGA-Z4-3'；

探針P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；

其中，探針序列中包含Z4的探針代表此探針為ZNA^TM探針，堿基下方設(shè)有下劃線的為鎖核酸修飾的堿基。

優(yōu)選的，上述的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒中，所述探針的5’設(shè)有熒光基團(tuán)，3’設(shè)有淬滅基團(tuán)，所述的熒光基團(tuán)為FAM、TET、CY5、HEX或ROX中的一種；所述的淬滅基團(tuán)為能與熒光基團(tuán)配套的BHQ1、BHQ2或BHQ3基團(tuán)中的一種。

優(yōu)選的，上述的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒中，所述PCR反應(yīng)液包括：MgCl₂、PCR Buffer、dNTP混合物、Taq酶和UNG酶。

本發(fā)明有益效果在于：本發(fā)明試劑盒可一次同時檢測與遺傳性耳聾相關(guān)的四個熱點(diǎn)基因中的30個突變位點(diǎn)，其能快速、穩(wěn)定的對上述各個位點(diǎn)基因型進(jìn)行診斷。使用本發(fā)明的檢測試劑盒，能更全面和更早發(fā)現(xiàn)攜帶耳聾基因的患兒，特別是遲發(fā)性聽力缺陷患兒，降低市面上已有常見耳聾基因檢測試劑盒造成的基因缺陷漏檢率，有助于及時采取干預(yù)措施預(yù)防言語障礙的發(fā)生，有效地降低聾啞發(fā)病率，同時該產(chǎn)品也可以應(yīng)用于產(chǎn)前基因診斷并以此為依據(jù)，通過人為干預(yù)可以避免新生聾人的增加。

本發(fā)明試劑盒利用文獻(xiàn)報道的各種突變位點(diǎn)的序列設(shè)計特異擴(kuò)增的LATE-PCR專用引物，以應(yīng)用多重不對稱PCR對多種基因型進(jìn)行同管檢測(共五管)，采用鎖核酸修飾的ZNA^TM探針，對SNP的區(qū)分能力更強(qiáng)，熒光背景低并且能完全區(qū)分同一管反應(yīng)液中同一熒光標(biāo)記的兩條探針，使最少管的反應(yīng)液檢測最多的位點(diǎn)。本發(fā)明設(shè)計的引物和探針的組合，可一次實驗檢測與遺傳性耳聾相關(guān)的四個熱點(diǎn)基因中的30個突變位點(diǎn)且試劑盒中的PCR反應(yīng)液A、B、C、D、E可使用同一擴(kuò)增程序在同一臺熒光PCR儀上進(jìn)行測試，滿足臨床快速、方便檢測耳聾的需求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明具體實施方式實施例1中的ZNA^TM探針的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2a為本發(fā)明具體實施方式實施例1中的使用ZNA^TM探針的熔解曲線結(jié)果圖；

圖2b為本發(fā)明具體實施方式實施例1中的使用ZNA^TM探針的熔解曲線結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明具體實施方式實施例1中的ZNA^TM探針的作用機(jī)理圖；

圖4為本發(fā)明具體實施方式實施例1中的鎖核酸結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為本發(fā)明具體實施方式的實施例2中使用遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測得到的熔解曲線結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明具體實施方式的實施例2中使用遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測得到的熔解曲線結(jié)果圖；

圖7為本發(fā)明具體實施方式的實施例2中使用遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測得到的熔解曲線結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明具體實施方式的實施例2中使用遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測得到的熔解曲線結(jié)果圖；

具體實施方式

為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附圖詳予說明。

本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：可一次實驗檢測與遺傳性耳聾相關(guān)的四個熱點(diǎn)基因中的30個突變位點(diǎn)，且試劑盒中的PCR反應(yīng)液A、B、C、D、E可使用同一擴(kuò)增程序在同一臺熒光PCR儀上進(jìn)行測試，滿足臨床快速、方便檢測耳聾的需求。

實施例1

本發(fā)明試劑盒可一次同時檢測與遺傳性耳聾相關(guān)的四個熱點(diǎn)基因中的30個突變位點(diǎn)即GJB2(35delG、109G>A、155delTCTG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT、512insAACG)、GJB3(538C>T、547G>A)、SLC26A4(281C>T、589G>A、749T>C、754T>C、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、IVS15+5G>A、2162C>T、2168A>G)、mtDNA(961T>G、1095T>C、1494C>T、1555A>G、7444G>A、7445A>G、12201T>C)。

1、引物的設(shè)計及篩選

先利用文獻(xiàn)報道的各種突變位點(diǎn)的序列設(shè)計特異擴(kuò)增的LATE-PCR專用引物，以應(yīng)用多重不對稱PCR對多種基因型進(jìn)行同管檢測為目的(共五管)，通過隨機(jī)組合不同引物，優(yōu)化退火溫度梯度，最終選擇一批特異性好的引物，能滿足臨床快速、方便檢測耳聾的需求。

這里的LATE-PCR是不對稱PCR(asymmetric PCR)的高級形式。要求兩條引物的Tm值之間至少要相差5℃上，其中這里的Tm值是指經(jīng)過濃度修正后的Tm值，低濃度引物即限制性引物的Tm^L值要比高濃度引物即非限制性引物的Tm^X值要高，從而保證在指數(shù)擴(kuò)增階段，即在較高的退火溫度下，這里的較高退火溫度要盡量低于Tm^L從而保證限制性引物的有效使用，同時要足夠高于Tm^X來減少由高濃度的非限制性引物帶來的干擾，使這一階段的擴(kuò)增具有更高的擴(kuò)增效率，同時減少非特異擴(kuò)增，得到更多可用于下一步模板的雙鏈DNA；在線性擴(kuò)增期時使用比較低的更適合非限制性引物的退火溫度，從而提高了這一階段的擴(kuò)增效率，這一階段的擴(kuò)增效率是由非限制性引物(Tm^X)和擴(kuò)增子(Tm^A)的退火溫度決定，Tm^A和Tm^X不能相差太大，Tm^A－Tm^X≤15℃。各個突變位點(diǎn)的擴(kuò)增引物優(yōu)選組合序列見表1。

表1耳聾各基因型檢測引物序列

2、探針的設(shè)計及篩選

2.1 ZNA^TM探針

ZNA^TM探針是由一段寡核苷酸序列連接了一段重復(fù)的陽離子精胺單元組成，結(jié)構(gòu)如圖1所示。這里的陽離子精胺單元可以根據(jù)需要連接多個。ZNA^TM探針的優(yōu)點(diǎn)是可以提高探針的Tm值同時可以降低熒光背景信號，因為連接的這段陽離子精胺單元是帶有正電荷的，而靶標(biāo)核苷酸由于含有磷酸骨架而帶負(fù)電荷，帶有正電荷的陽離子精胺單元可以減少其與靶標(biāo)DNA之間的“靜電排斥”作用，使探針與靶標(biāo)DNA結(jié)合得更牢固，從而提高了探針的Tm值；ZNA^TM探針具有更低的熒光背景信號可能是因為寡聚陽離子這一端會向陰性寡核苷酸鏈方向折疊，縮短了由于探針內(nèi)部的靜電排斥作用形成的兩末端距離即熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離，這樣熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光就能完全被淬滅基團(tuán)所吸收。

在SNP基因分型時發(fā)現(xiàn)探針越短，其區(qū)分能力越強(qiáng)，但是隨著長度的變短，探針的Tm值就會降低，使探針在循環(huán)過程中的結(jié)合效率降低。在運(yùn)用多色探針熔解曲線分析時發(fā)現(xiàn)，如果一個熒光通道檢測兩條探針，那么在雙雜合子的情況下，是應(yīng)該有四個熔解峰出現(xiàn)即有四個Tm值，但是在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在很多情況下，都存在Tm值的交叉，造成無法判讀結(jié)果。因此，我們在同一管使用同一種熒光標(biāo)記的兩條探針時，其中一條使用ZNA^TM探針，這樣就能完全區(qū)分四個Tm值，如圖2表示的是同一個檢測通道的兩條檢測探針，圖2a中的兩條探針都沒有采用ZNA^TM探針，發(fā)現(xiàn)中間的兩個峰Tm值只相差2.5℃，在檢測臨床樣本時由于Tm值會有一個波動范圍，因此，會造成這兩個峰的重疊，不利于結(jié)果的判讀；而圖2b的其中一條探針是采用ZNA^TM探針，發(fā)現(xiàn)黃色那條探針的Tm值整體都提高了，可以和另外一條探針的熔解峰完全區(qū)分開。

ZNA^TM探針的作用原理如圖3所示：在沒有靶序列存在的條件下，ZNA^TM探針自由卷曲，這時由于熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)離得比較近，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)所吸收，此時只能檢測到微弱的熒光信號；當(dāng)反應(yīng)體系中有互補(bǔ)的靶序列存在時，在整個熔解曲線過程中，低溫時ZNA^TM探針與靶序列雜交，形成剛性和穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)雜交體，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離比較遠(yuǎn)，這時熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光不能被淬滅基團(tuán)所吸收，因而可以檢測到很強(qiáng)的熒光信號；隨著溫度的升高，雙鏈雜交體逐漸解鏈，達(dá)到熔點(diǎn)時，熒光迅速下降，熒光變化最強(qiáng)的點(diǎn)對應(yīng)的溫度即是探針與靶序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)的熔點(diǎn)(Tm)。ZNA^TM探針與不同的靶序列雜交形成的雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性不同，因而具有不同的熔點(diǎn)，從熔點(diǎn)的差異就可以判斷靶序列的差異。

2.2鎖核酸修飾探針

鎖核酸是一種雙環(huán)狀核酸衍生物，核糖的2’-O位和4’-C位通過縮水作用形成氧亞甲基橋，并連接成環(huán)形，這個環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，鎖核酸的具體結(jié)構(gòu)見圖4。鎖核酸具有序列特異性，它比常規(guī)的核酸能更好地區(qū)分正確配對和錯誤配對序列，含有錯配堿基的LNA-DNA雜交分子比含有錯配堿基的DNA-DNA雜交分子更加不穩(wěn)定，在LNA-DNA雙螺旋中的一個錯配堿基至少使Tm值下降20℃，而在相應(yīng)的DNA-DNA雙螺旋中，一個錯配堿基使Tm值下降4-l6℃。本發(fā)明采用鎖核酸對那些野生和突變型區(qū)分能力弱的探針進(jìn)行修飾，有的直接對檢測位點(diǎn)進(jìn)行修飾，有的是對檢測位點(diǎn)及相鄰的堿基進(jìn)行修飾，從而達(dá)到對單堿基錯配的識別能力。

表2為本發(fā)明遺傳性耳聾各位點(diǎn)的檢測探針序列，其中包含Z4的代表此探針為ZNA^TM探針，堿基下方設(shè)有下劃線的為鎖核酸修飾的堿基。

表2

3.引物濃度、探針濃度以及反應(yīng)體系其他組分確定

本發(fā)明遺傳性耳聾基因檢測試劑盒包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括PCR反應(yīng)液A、PCR反應(yīng)液B、PCR反應(yīng)液C、PCR反應(yīng)液D和PCR反應(yīng)液E；其中的引物及探針為上述1、2兩點(diǎn)所述序列，引物及探針儲存液的濃度范圍在0.1～1μmol/L，MgCl2終濃度選擇1.5mM-9mM，等濃度的四種脫氧三磷酸腺苷(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合液dNTP終濃度選擇100nM-300nM，脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)終濃度選擇100nM-300nM，DNA聚合酶終濃度選擇1-7.5U/反應(yīng)，利用正交試驗方法，通過大量實驗對比，最終確定最優(yōu)的PCR反應(yīng)體系見表3PCR反應(yīng)液A配方、表4PCR反應(yīng)液B配方、表5PCR反應(yīng)液C配方、表6PCR反應(yīng)液D配方和表7PCR反應(yīng)液E配方。

表3

表4

表5

表6

表7

注：DNA加樣量為3μL，總反應(yīng)體積為25μL。

引物、探針的篩選和體系優(yōu)化是本發(fā)明的重點(diǎn)，由于反應(yīng)體系A(chǔ)、B、C、D、E都是多重不對稱PCR且還包含了多條探針，多重PCR容易產(chǎn)生各擴(kuò)增片段的相互抑制，而且部分基因GC含量高、同源性高且二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致擴(kuò)增不穩(wěn)定，而探針之間及探針與引物之間如果形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)也會影響后續(xù)熔解曲線的結(jié)果，直接造成沒有熔解峰出現(xiàn)。經(jīng)過大量摸索實驗，才優(yōu)化出上述的五個反應(yīng)體系。

3.PCR反應(yīng)條件的確定

本發(fā)明遺傳性耳聾基因檢測試劑盒采用兩段式PCR體系。反應(yīng)條件分以下步驟優(yōu)化：

經(jīng)過大量實驗對比優(yōu)化，反應(yīng)液A、B、C、D、E可使用同一擴(kuò)增程序在同一臺熒光PCR儀上進(jìn)行測試，最佳反應(yīng)條件為：

退火溫度和退火時間對PCR擴(kuò)增效率和特異性擴(kuò)增影響較大，上述條件優(yōu)化結(jié)果顯示退火溫度偏低會有非特異性擴(kuò)增條帶，導(dǎo)致假陽性結(jié)果；溫度偏高擴(kuò)增效率偏低，靈敏度下降。本實驗通過控制退火溫度和退火時間可以做到對所有基因型無非特異性擴(kuò)增，特異性好，擴(kuò)增效率高，靈敏度高。

4、本發(fā)明遺傳性耳聾基因檢測試劑盒用于非綜合征遺傳性耳聾基因型的檢測過程依次包括如下步驟：

(1)提取待檢測樣品DNA：從外周血提取基因組DNA，濃度在5～200ng。

(2)熒光PCR擴(kuò)增：以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，獲得熔解曲線結(jié)果。

(3)結(jié)果判讀：根據(jù)多色探針熔解曲線結(jié)果即待檢樣本與標(biāo)準(zhǔn)對照在各通道熔解峰的Tm差值的變化判讀待檢樣本是否含有相應(yīng)基因突變，以及基因突變類型。標(biāo)準(zhǔn)對照是野生型質(zhì)粒，可用于校正外部條件造成的實驗誤差。結(jié)果判讀步驟為：首先，讀取各檢測通道中標(biāo)準(zhǔn)對照的Tm值；其次，讀取待檢樣本在各檢測通道的Tm值；最后，將待檢樣本在各檢測通道中的Tm值減去標(biāo)準(zhǔn)對照在各檢測通道對應(yīng)的Tm值，得到各檢測通道的ΔTm值，參照表10判斷待檢樣本是否存在突變及突變的類型。

5、本發(fā)明試劑盒的有益效果

1)本發(fā)明采用多重LATE-PCR技術(shù)結(jié)合多色熒光探針熔解曲線技術(shù)可同時檢測GJB2基因上8種突變、GJB3基因上2種突變、SLC26A4基因上13種突變及mtDNA基因上7種突變。與現(xiàn)有的檢測耳聾基因突變的同類專利相比，本發(fā)明增加了155delTCTG、512insAACG、281C>T、589G>A、1095T>C及12201T>C的檢測，155delTCTG與512insAACG突變會引起先天性中重度感音神經(jīng)性耳聾，281C>T與589G>A會引起大前庭水管綜合征和先天或后天中重度感音神經(jīng)性耳聾，1095T>C及12201T>C會引起母系遺傳遲發(fā)性耳聾，若不進(jìn)行檢測有可能會導(dǎo)致漏檢，增加耳聾患兒的出生概率，給家庭和社會帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。現(xiàn)有檢測耳聾的同類專利，均不能實現(xiàn)以上30種耳聾基因突變的檢測。使用本發(fā)明試劑盒，可以一次試驗就完成與遺傳性耳聾相關(guān)的四個熱點(diǎn)基因中30種突變的檢測，大大節(jié)約了成本和節(jié)省了時間；

2)簡便快速、可同時檢測多個基因突變位點(diǎn)、耗時短：本發(fā)明的用于檢測耳聾基因突變的試劑盒可在五管PCR反應(yīng)液中完成與遺傳性耳聾相關(guān)的四個基因上的30種突變檢測，通過簡單的加樣上機(jī)，整個操作只需2.5～3h即可完成，操作步驟少、耗時短；

3)檢測通量高：本發(fā)明所采用的多色探針熔解曲線方法主要分為兩部分，一是PCR擴(kuò)增，二是熔解曲線分析，因此，這兩部分即可同時在熒光PCR儀上完成，也可以在普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，然后在熒光PCR儀上進(jìn)行熔解曲線分析，通過一臺熒光PCR儀配合多臺普通PCR儀進(jìn)行檢測，可大大提高檢測通量；

4)特異性好、檢測結(jié)果準(zhǔn)確：本發(fā)明所采用的鎖核酸修飾的ZNA^TM探針，對SNP的區(qū)分能力更強(qiáng)，熒光背景低并且能完全區(qū)分同一管反應(yīng)液中同一熒光標(biāo)記的兩條探針，使最少管的反應(yīng)液檢測最多的位點(diǎn)。

5)均相檢測、閉管操作：本發(fā)明為均相檢測體系，添加模板后PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析都在同一封閉的反應(yīng)管中完成，無需PCR后處理，減少了PCR產(chǎn)物污染的幾率。

實施例2

本發(fā)明遺傳性耳聾基因檢測試劑盒采用LATE-PCR和多色熒光探針PCR熔解曲線技術(shù)。在需要檢測的突變區(qū)域設(shè)計相應(yīng)的探針，并在設(shè)計好的探針外圍設(shè)計一條上游引物和一條下游引物，用該上游引物和下游引物PCR擴(kuò)增含有待檢測區(qū)域的片段，PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。將待檢樣本在各檢測通道中的Tm值減去標(biāo)準(zhǔn)對照在各檢測通道對應(yīng)的Tm值，得到各檢測通道的ΔTm值，根據(jù)這個ΔTm值來判斷待檢樣本是否存在突變及突變的類型。

1、本發(fā)明遺傳性耳聾基因檢測試劑盒主要組成如表8，其中的引物與探針為實施例1中對應(yīng)的序列限定。

表8

2、適用儀器

本發(fā)明試劑盒適用于帶有FAM、HEX、ROX和CY5檢測通道且具有熔解曲線分析功能的實時PCR擴(kuò)增儀，型號為Bio-Rad CFX96和Roche LightCycler480Ⅱ。

3、儲存條件及有效期

試劑盒置于-18℃以下避光保存，有效期為6個月。

試劑盒需低溫保存運(yùn)輸，在途時限不宜超過5天。

試劑盒在37℃保存不宜超過5天。

試劑盒反復(fù)凍融不宜超過10次。

試劑盒開瓶后-18℃以下儲存，在效期內(nèi)性能穩(wěn)定。

生產(chǎn)批號、生產(chǎn)日期、失效日期：見標(biāo)簽。

4、樣本要求

1)適用樣本：本試劑盒樣本來源為外周抗凝全血，所用抗凝劑為枸櫞酸鈉或EDTA，不能使用肝素抗凝。

2)樣本采集：抽取靜脈血5mL放入含有抗凝劑的管中，標(biāo)記好樣本的姓名和編號等樣本信息。

3)血樣保存：抗凝全血在室溫(15～25℃)放置不超過24小時，2～8℃保存不超過一個月，-18℃以下保存不超過兩年，-70℃可長期保存，冷凍保存時應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4)血樣運(yùn)輸：抗凝全血運(yùn)輸時需用泡沫箱加冰袋密封，且在途時限不宜超過72小時。

5、檢驗方法

1)DNA的提取：推薦使用亞能公司的“核酸提取試劑”提取人基因組DNA。PCR擴(kuò)增前，可采用核酸定量儀或紫外分光光度計對模板DNA濃度和純度進(jìn)行測定。本試劑盒要求待檢基因組DNA的濃度為5～200ng/μL，純度(A260/A280)為1.7～2.1。

2)反應(yīng)液準(zhǔn)備：從試劑盒中取出所有組分置于室溫融化并震蕩混勻，于5000rpm短暫離心。

各管反應(yīng)液的需求量＝待檢樣本數(shù)N+1個野生型對照+1個陰性對照。

用微量加樣器向八聯(lián)管或者96孔板中的每個孔加入22μL的反應(yīng)液。

3)加樣

用微量加樣器分別向每個孔加入3μL的待檢樣本、野生型對照和陰性對照，蓋緊管蓋，5000rpm短暫離心。

4)PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增程序如表9。

表9

6、參考值(參考范圍)

野生型對照在各體系及各通道中的熔點(diǎn)(Tm)值范圍詳見下表10。

表10

7、檢驗結(jié)果的解釋

通過比較待檢樣本在A、B、C、D和E體系中共20個檢測通道與野生型對照之間熔點(diǎn)(ΔTm值)的差異判斷樣本是否發(fā)生突變。當(dāng)樣本熔解峰與野生型對照熔解峰差異(ΔTm值)在±1℃以內(nèi)的即為野生型峰，差異超過±2℃的即為突變型峰，詳情見附表11、12和13，其為檢測的突變類型及各突變類型在對應(yīng)通道的ΔTm值，具體情況如下：

(1)若待檢樣本20個檢測通道只有野生型峰出現(xiàn)，則樣本為野生型。

(2)若待檢樣本在某個通道既有野生型峰又有突變型峰，而其他通道為野生型峰，則樣本為該種突變的雜合型，通過計算對應(yīng)野生型與突變型峰熔點(diǎn)的差異(ΔTm值)，判斷其突變的類型。

(3)若待檢樣本在某個通道只有一個突變型峰，而其他通道為野生型峰，則樣本為該種突變的純合型，通過計算對應(yīng)野生型與突變型峰熔點(diǎn)的差異(ΔTm值)，判斷其突變的類型。

(4)若樣本在兩個通道有兩個突變型峰，而其它通道為野生型峰，則樣本為這兩種突變的雙雜合型，通過計算對應(yīng)野生型與突變型峰熔點(diǎn)的差異(ΔTm值)，判斷其突變的類型。

表11

表12

表13

8、檢驗方法的局限性

該試劑盒采用的是探針熒光熔解曲線法，該方法可以檢測探針覆蓋范圍的序列變異，故可能檢測到除本試劑盒30個位點(diǎn)外的突變。

由于線粒體突變屬于異質(zhì)性突變，其存在不同程度的突變水平(0-100％)。應(yīng)通過與對應(yīng)野生型峰的形狀進(jìn)行區(qū)分辨別，對于線粒體的7個檢測位點(diǎn)，其檢測限為20％以上。

9、注意事項

(1)試劑盒必須嚴(yán)格按照所要求的保存條件保存，各組分使用前請充分融化、混勻并短暫離心后再開蓋使用，以保證反應(yīng)體系體積完整及防止?jié)撛诘奈廴尽?/p>

(2)請嚴(yán)格分區(qū)操作實驗，各區(qū)物品均為與用，實驗室環(huán)境污染、試劑污染、樣本交叉污染可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；試劑運(yùn)輸、保存不當(dāng)或試劑配置不準(zhǔn)確可能會引起試劑檢測效能下降、出現(xiàn)假陰性或檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果。

(3)為保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性，請務(wù)必在擴(kuò)增前測定DNA濃度和純度，確保樣本符合本試劑的檢測要求后再進(jìn)行后續(xù)實驗。

(4)本試劑盒適用樣本為外周枸櫞酸鈉戒EDTA抗凝全血，若使用其他類型的樣本，出現(xiàn)檢測結(jié)果差異與本試劑盒質(zhì)量無關(guān)。

(5)反應(yīng)液配置、分裝及加樣的操作過程中應(yīng)盡量避光，加樣后盡快蓋緊管蓋并短暫離心。

(6)每次實驗應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制。

(7)檢測樣本應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求。

(8)實驗中使用的吸頭請直接打入盛有消毒劑的廢液缸內(nèi)，并與其他廢棄物一同滅菌后方可丟棄。

(9)本試劑盒僅用于體外診斷。

10、使用本發(fā)明遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測樣本的結(jié)果

圖5為本發(fā)明試劑盒反應(yīng)體系E中ROX通道的熔解曲線結(jié)果圖，其中標(biāo)準(zhǔn)對照是代表野生型峰，另外一個峰代表是突變型峰，所以這個待測樣本是1494雜合型；

圖6為本發(fā)明試劑盒反應(yīng)體系C中CY5通道的熔解曲線結(jié)果圖，其中標(biāo)準(zhǔn)對照是代表野生型峰，另外一個峰代表是突變型峰，所以這個待測樣本是1174純合突變型；

圖7為本發(fā)明試劑盒反應(yīng)體系A(chǔ)中FAM通道的熔解曲線結(jié)果圖，其中標(biāo)準(zhǔn)對照1是代表109G>A野生型峰，標(biāo)準(zhǔn)對照2代表35delG野生型峰，待測樣本1代表109G>A突變型峰，待檢樣本2代表的是35delG突變型峰，所以待測樣本1是109純合突變型，待測樣本2是35delG純合突變型；

圖8為本發(fā)明試劑盒反應(yīng)體系C中ROX通道的熔解曲線結(jié)果圖，其中標(biāo)準(zhǔn)對照是代表野生型峰，待測樣本1代表的是1226G>A突變型峰，待測樣本2代表的是1229C>T突變型峰，待測樣本3即有野生型峰又有1226G>A突變型峰，所以是1226G>A雜合突變型，待測樣本4既有野生型峰又有1229C>T突變型峰，所以是1229C>T雜合突變型。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司

<120> 一種遺傳性耳聾基因檢測試劑盒

<160> 55

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagtgattcc tgtgttgtgt g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agccttcgat gcggaccttc tg 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacctacaca agcagcatc 19

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcagcagga tgcaaattcc agacac 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agttcctctt cctctacctg 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cacagatggt gagtacgatg cagacg 26

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaataccgag tcaaggaatg 20

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gccttgaagg gtaagcaacc atctgtc 27

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaacactttc tcgtatccag cagc 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tccatctata ttttacttgt aagttc 26

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cacagctaaa gattgtcctc 20

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccatccctgg agcaagaagc aacac 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctggattgct caccattgtc gtctg 25

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtactaagag gaacaccaca c 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcatccagtc tcttccttag 20

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agccttcctc tgttgccatt cctc 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gagcaatgcg ggttctttga cgac 24

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tcttgagatt tcacttggtt c 21

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agattcttag attttccagt cc 22

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agagggtcta gggcctattc ctgattg 27

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtgaacgttc ccaaagtgcc aatcc 25

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atactggaca acccacatc 19

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cgcggtcaca cgattaaccc aagtc 25

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tgttaagcta cactctggtt c 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

aggctcattc atttctctaa c 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

catggggttg gcttgaaacc agc 23

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ccacaacaca atggggctca ctcac 25

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

agggtggtta tagtagtgtg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctatgactta gttgcgttac 20

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gagaagtggg gtggctttta ggatgg 26

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gtttgttcac accccccagg a 21

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cagccacaat gaggatc 17

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgcagacaaa gtcggcct 18

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tagcacacgt tcttgcagcc tggctgcag 29

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cagctgcagg gcccatag 18

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cttctcgtct ccggtaggc 19

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

aggcgttcgt tgcacttcac ca 22

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cttcttggta ggtcgggcaa t 21

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tagcccaata ctaactcccg 20

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cctgactctg ctggttggaa t 21

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gataataggg agaactccat tgt 23

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tttgttttat ttcagacgat 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

cctgagaaga tgttgctgat 20

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gccgtgcggg aaagagcagt g 21

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tttgatggtc catgatgc 18

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ataaaatact tactgtggac tt 22

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tccatagcct tctgcttgac tgtg 24

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gagatcacag cgggtggtaa g 21

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

atcaccccct ccccaata 18

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

ccactatgct tagcccta 18

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

accgcccgtc accctcctca a 21

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tagaggagac aagtcgtaac at 22

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tttgcctaga ttttatgtat acg 23

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

cgacccctta tttaccga 18

<210> 55

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

cgctccaacc gactgctgtc accttcac 28