本發(fā)明涉及一種全人源單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種抗DDX5的全人源單克隆抗體及其制備方法和在檢測(cè)DDX5表達(dá)以及預(yù)防或治療DDX5相關(guān)的疾病中的用途，本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

DDX5(DEAD-Box Helicase 5)隸屬于DEAD box家族，又稱為p68，是一種ATP依賴的RNA解旋酶，最初被認(rèn)為是一種參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的核蛋白。RNA解旋酶(RNA helicases)是一個(gè)包含了與RNA代謝(翻譯起始、核糖體形成、前mRNA拼接和mRNA降解)許多方面有關(guān)的蛋白質(zhì)家族。RNA解旋酶是由水解ATP供給能量來(lái)解開(kāi)RNA的酶。它們常常依賴于單鏈的存在，并能識(shí)別復(fù)制單鏈結(jié)構(gòu)。一般在RNA復(fù)制過(guò)程中起到催化雙鏈RNA解旋的作用。DDX5同時(shí)具有依賴于RNA的ATPase活性，它與SV40大T抗原有交叉免疫反應(yīng)。

DDX5在RNA代謝的各個(gè)方面發(fā)揮重要作用，參與mRNA前體加工、RNA反轉(zhuǎn)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體的合成和翻譯以及RNA降解等過(guò)程。同時(shí)DDX5轉(zhuǎn)錄后的磷酸化也參與了腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。例如，蛋白的SUMO(sumoylation)修飾可以直接影響DDX5的蛋白穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄功能。DDX5與HDAC1結(jié)合能夠抑制轉(zhuǎn)錄，這種轉(zhuǎn)錄抑制的過(guò)程能夠被SUMO修飾所調(diào)節(jié)。DDX5還能與Runx2,p53,Smad3,CBP以及p300相互作用。

已有研究表明，DDX5在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、急性髓性白血病等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，抑制DDX5的表達(dá)能夠抑制這些種類腫瘤細(xì)胞的增殖。DDX5在調(diào)控丙型肝炎病毒復(fù)制過(guò)程中亦發(fā)揮一定作用，說(shuō)明DDX5的監(jiān)測(cè)和調(diào)控在實(shí)現(xiàn)腫瘤和感染性疾病的精準(zhǔn)診斷和治療中具有重要價(jià)值。

目前全人源單克隆抗體是治療性抗體發(fā)展的主要方向，本發(fā)明通過(guò)人源雜交瘤技術(shù)獲得了全人源抗體克隆庫(kù)，為抗體的制備篩選提供了良好的技術(shù)平臺(tái)，篩選出來(lái)的抗體為人體內(nèi)自然產(chǎn)生的抗體，避免了人源化過(guò)程引入的人為加工因素，更符合人體內(nèi)的自然生理過(guò)程，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抗DDX5的全人源單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

(1)抗DDX5單克隆抗體的初步篩選，通過(guò)ELISA技術(shù)對(duì)全人源雜交瘤抗體庫(kù)中的抗體進(jìn)行篩選，獲得了一種親和力較高的抗體。

(2)擴(kuò)大培養(yǎng)篩選到的人源雜交瘤細(xì)胞株，親和層析純化單克隆抗體，通過(guò)免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)篩選到的抗體與DDX5純化蛋白之間的親和力；

(3)對(duì)篩選到的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行抗體全基因測(cè)序，構(gòu)建抗體DNA重組表達(dá)質(zhì)粒。

(4)抗體DNA重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)并純化單克隆抗體，進(jìn)行親和力鑒定和比較。

(5)將上述(2)、(4)中獲得的單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞作用進(jìn)行生物學(xué)功能鑒定和比較。

在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明篩選得到一株能夠特異性結(jié)合DDX5的全人源單克隆抗體，其由輕鏈和重鏈組成，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO.6所示，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO.8所示。

其中，輕鏈1G3-L1的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示；LCDR1序列為QSVSSN，LCDR2序列為GAS，LCDR3序列為QQYNNWPRT。其中，重鏈1G3-H1的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；HCDR1序列為GFTFSDYS，HCDR2序列為ITSSSGYT，HCDR3序列為ARVRSSWGPIDS。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的特異性結(jié)合DDX5的全人源單克隆抗體中，輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉的是，抗體中的保守性氨基酸替換并不會(huì)實(shí)質(zhì)性地影響抗體的親和力和結(jié)構(gòu)，尤其是所述保守性替換發(fā)生在恒定區(qū)時(shí)。因此，若氨基酸的變化發(fā)生在恒定區(qū)且變化后并不影響抗體的生物學(xué)活性，那么該抗體也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了包含所述全人源單克隆抗體的單個(gè)重鏈和/或單個(gè)輕鏈的單域抗體、嵌合抗體、抗體融合蛋白抗體、抗體/抗體片段-因子融合蛋白或抗體/抗體片段-化學(xué)偶聯(lián)物。以及

所述的全人源單克隆抗體的抗原結(jié)合片段，其中，所述抗原結(jié)合片段可選自Fab、Fab'、F(ab')₂、scFv、Fv、dsFv、雙抗體、Fd和Fd'片段。

再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種分離的DNA分子，其為編碼所述的抗體或所述的抗原結(jié)合片段的核苷酸序列，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，更優(yōu)選的，所述的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

含有所述的核苷酸序列或其組合的重組DNA表達(dá)載體以及含有所述的核苷酸序列或所述的重組DNA表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞選自原核細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞選自HEK293F細(xì)胞、CHO細(xì)胞或NSO細(xì)胞。

所述HEK293F細(xì)胞為人胚腎293F細(xì)胞(human embryonic kidney 293F cell)；CHO細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(chinese hamster ovary cell)；NSO細(xì)胞為小鼠NSO胸腺瘤細(xì)胞(mouse thymoma NSO cells)。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的抗體、所述的抗原結(jié)合片段、所述的核苷酸序列、所述的載體以及所述的宿主細(xì)胞在制備用于預(yù)防或治療與DDX5相關(guān)的腫瘤、感染性疾病或免疫系統(tǒng)疾病，其中，優(yōu)選的，所述腫瘤包括但不限于膠質(zhì)瘤、霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴癌、黑色素瘤、急性或慢性白血病、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、皮膚癌、鱗狀細(xì)胞癌、骨癌、頭頸癌、結(jié)直腸癌、實(shí)體瘤；所述感染性疾病包括不限于HIV病毒感染、A型，B型或C型肝炎病毒感染、皰疹病毒感染、流感病毒感染；所述免疫系統(tǒng)疾病包括不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、硬皮病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、Wegener肉芽腫病。以及

所述的抗體、所述的抗原結(jié)合片段、所述的核苷酸序列、所述的載體以及所述的宿主細(xì)胞在制備DDX5檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了制備所述特異性結(jié)合DDX5的全人源單克隆抗體的方法，包括如下步驟：

(1)提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有編碼所述抗體或所述抗原結(jié)合片段的DNA分子，以及與所述DNA分子可操作相連的表達(dá)調(diào)控序列；

(2)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；

(3)在適合表達(dá)所述抗體的條件下，培養(yǎng)含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；

(4)分離純化獲得所述的單克隆抗體；

其中，優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體為含有抗體分泌信號(hào)肽序列的真核表達(dá)載體pcDNA3.4，所述的宿主細(xì)胞為HEK293F細(xì)胞。

本發(fā)明提供的單克隆抗體可以通過(guò)消除、抑制DDX5活性來(lái)預(yù)防、診斷和治療疾病，本發(fā)明提供的抗DDX5蛋白單克隆抗體是全人源的，與其它動(dòng)物源性(如鼠源性)的抗DDX5抗體相比，因物種差異導(dǎo)致的免疫原性大大減少，且特異性好、親和力高，如果用于臨床將大大降低副作用。此外，由于本發(fā)明中的單克隆抗體可以和DDX5抗原特異性結(jié)合，在DDX5的診斷和檢測(cè)方面也具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為pcDNA3.4質(zhì)粒圖譜；

圖2為雜交瘤細(xì)胞抗體表達(dá)蛋白電泳圖；

圖3為抗體DNA重組表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中蛋白表達(dá)電泳圖；

圖4為單克隆抗體與DDX5在分子水平上的結(jié)合實(shí)驗(yàn)；

圖5為單克隆抗體ELISA鑒定的親和力；

圖6為抗DDX5的單克隆抗體細(xì)胞內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)；

圖7為抗DDX5的單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明詳細(xì)的實(shí)施方法參見(jiàn)實(shí)施例，實(shí)施例中所述的實(shí)驗(yàn)方法和試劑，若無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法和試劑。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1、抗DDX5單克隆抗體篩選

采用人源B細(xì)胞克隆技術(shù)建立全人源單克隆抗體庫(kù)。以純化的DDX5蛋白為抗原包被ELISA反應(yīng)板，4℃包被過(guò)夜。再用4％的BSA/PBST封閉反應(yīng)板，室溫1小時(shí)。封閉后向反應(yīng)板中加入抗體庫(kù)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，室溫反應(yīng)1小時(shí)。PBST洗3次，每次5分鐘。加入山羊抗人辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫1小時(shí)。PBST-PBS洗3次，每次5分鐘。顯色篩選陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1G3。

實(shí)施例2、抗DDX5的單克隆抗體純化

實(shí)施例1得到的與DDX5蛋白反應(yīng)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株1G3進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)上清，蛋白電泳檢測(cè)抗體表達(dá)，如圖2。經(jīng)過(guò)protein A親和柱純化，脫鹽和濃縮，獲得純化的單克隆抗體。

實(shí)施例3、抗體DNA重組質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)

將實(shí)施例1得到的與DDX5反應(yīng)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞1G3進(jìn)行抗體全基因測(cè)序，獲得抗體輕鏈和重鏈的基因序列：所述輕鏈(1G3-L1)的核苷酸序列為SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述重鏈(1G3-H1)的核苷酸序列為SEQ ID NO.2，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，輕鏈可變區(qū)核苷酸酸序列為SEQ ID NO.5，對(duì)應(yīng)氨基酸序列為SEQ ID NO.6。輕鏈1G3-L1的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示；LCDR1序列為QSVSSN，LCDR2序列為GAS，LCDR3序列為QQYNNWPRT。

其中，重鏈可變區(qū)核苷酸酸序列為SEQ ID NO.7，對(duì)應(yīng)氨基酸序列為SEQ ID NO.8。重鏈1G3-H1的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；HCDR1序列為GFTFSDYS，HCDR2序列為ITSSSGYT，HCDR3序列為ARVRSSWGPIDS。

將上述輕鏈和重鏈基因分別克隆至裝有抗體分泌信號(hào)肽序列的真核表達(dá)載體pcDNA3.4(圖1)中。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞，進(jìn)行全抗體表達(dá)，蛋白電泳檢測(cè)抗體表達(dá)，如圖3。使用protein A親和柱純化獲得抗體蛋白。

實(shí)施例4、對(duì)篩選出的單克隆抗體與DDX5在分子水平上進(jìn)行結(jié)合檢測(cè)

DDX5純化蛋白經(jīng)10％SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，5％脫脂奶粉封閉，室溫1小時(shí)。將實(shí)施例2純化后的單克隆抗體用PBST稀釋到1ng/μL，室溫與膜孵育1小時(shí)。PBST洗3遍，每次5分鐘。用anti-human Fc-HRP二抗孵育，室溫1小時(shí)。PBST-PBS洗3遍。ECL顯色，結(jié)果如圖4。圖4結(jié)果表明，實(shí)施例2純化后的單克隆抗體能夠與DDX5純化蛋白結(jié)合。

實(shí)施例5、對(duì)篩選出的抗DDX5的單克隆抗體進(jìn)行體外親和力檢測(cè)

ELISA檢測(cè)實(shí)施例2純化后的單克隆抗體與DDX5的親和力，反應(yīng)板包被純化蛋白DDX5，4％BSA/PBST封閉4℃過(guò)夜，與不同濃度(1000ng/mL～0.001ng/mL)的單克隆抗體孵育，室溫1小時(shí)。PBST洗3遍，每次5分鐘。加入anti-human Fc-HRP二抗孵育，室溫1小時(shí)。PBST-PBS洗3遍，每次5分鐘。DAB顯色，酶標(biāo)儀讀取OD450吸收值，結(jié)果如圖5。圖5結(jié)果表明，隨著單克隆抗體濃度的下降，OD450吸收值也隨之降低，說(shuō)明純化后的單克隆抗體能夠與DDX5純化蛋白結(jié)合。

實(shí)施例6、抗DDX5的單克隆抗體細(xì)胞內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)

常規(guī)培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，1×10⁴cell/孔接種細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過(guò)夜，多聚甲醛固定，加入實(shí)施例2純化后的抗DDX5的單克隆抗體，37℃反應(yīng)1小時(shí)。PBST洗3次每次5分鐘。加入Anti-human Fc-FITC二抗37℃反應(yīng)1小時(shí)。PBST洗3次,每次5分鐘。共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖6。圖6結(jié)果表明，純化后的單克隆抗體能夠與人膠質(zhì)瘤細(xì)胞結(jié)合。

實(shí)施例7、抗DDX5的單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)

常規(guī)培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，1×10⁴cell/孔接種細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過(guò)夜，加入實(shí)施例2純化后的抗DDX5的單克隆抗體使其終濃度達(dá)到30μg/μL，培養(yǎng)不同時(shí)間取細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。如圖7。圖7結(jié)果表明，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力下降，說(shuō)明純化后的單克隆抗體能夠抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及生長(zhǎng)。

對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，具體實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采取了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種非實(shí)質(zhì)性改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其他場(chǎng)合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種抗DDX5的全人源單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用

<130> KLPI170019

<160> 8

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 1G3-L1

<400> 1

atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 180

ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 240

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctcggac gttcggccaa 360

gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 702

<210> 2

<211> 1404

<212> DNA

<213> 1G3-H1

<400> 2

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctatta taaaaggtgt ccagtgtcag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggagacttg gtcaagcctg gagggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac cttcagtgac tactccatga actgggtccg ccagactcca 180

gggaaggggc tggagtggct ttcatacatc actagtagta gtgggtacac aaattatgta 240

gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg 300

caaatgaata gcctgagagc cgaggacacg gctgtctact actgtgcgag agtgaggagt 360

agctggggac ctattgactc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gagggtctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctccggg taaa 1404

<210> 3

<211> 234

<212> PRT

<213> 1G3-L1

<400> 3

1 MET Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu

16 Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val MET Thr Gln Ser Pro Ala Thr

31 Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

46 Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

61 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala

76 Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu

91 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val

106 Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln

121 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

136 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala

151 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

166 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

181 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

196 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

211 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

226 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

<210> 4

<211> 468

<212> PRT

<213> 1G3-H1

<400> 4

1 MET Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys

16 Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu

31 Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

46 Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ser MET Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro

61 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ser Tyr Ile Thr Ser Ser Ser Gly

76 Tyr Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

91 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln MET Asn Ser Leu

106 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Ser

121 Ser Trp Gly Pro Ile Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

136 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

151 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

166 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

181 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

196 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

211 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

226 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

241 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

256 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

271 Thr Leu MET Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

286 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

301 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

316 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

331 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

346 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

361 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

376 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

391 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

406 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

421 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

436 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val MET His

451 Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

466 Pro Gly Lys

<210> 5

<211> 291

<212> DNA

<213> 1G3-L1可變區(qū)

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gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctcggac g 291

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<212> PRT

<213> 1G3-L1可變區(qū)

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1 Glu Ile Val MET Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro

16 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser

31 Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

46 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

61 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile

76 Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

91 Tyr Asn Asn Trp Pro Arg Thr

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<212> DNA

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tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactcca tgaactgggt ccgccagact 120

ccagggaagg ggctggagtg gctttcatac atcactagta gtagtgggta cacaaattat 180

gtagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtct actactgtgc gagagtgagg 300

agtagctggg gacctattga ctcc 324

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46 Glu Trp Leu Ser Tyr Ile Thr Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr

61 Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

76 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln MET Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

91 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Ser Ser Trp Gly Pro

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