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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及可用于治療癌癥的組合療法。特別地，本發(fā)明涉及包含特異性結(jié)合人CC趨化因子受體4(CCR4)的抗體和4-1BB蛋白的激動(dòng)劑的組合療法。

發(fā)明背景

已經(jīng)認(rèn)識到趨化因子是正常免疫監(jiān)視和應(yīng)答所必需的以及血細(xì)胞生成、血管生成、病毒感染的控制和T細(xì)胞分化中的幾種其它功能所必需的基礎(chǔ)白細(xì)胞運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵組分(Baggiolini等人，Ann.Rev.Immunol.15：675(1997)；Zou等人，Nature 393：595(1998)；Tachibana等人，Nature 393：591(1998))。生物活性的這種多樣陣列，包括對白細(xì)胞的一系列促炎效應(yīng)的介導(dǎo)，例如趨化性的觸發(fā)、脫顆粒、脂質(zhì)介質(zhì)的合成和整聯(lián)蛋白活化，以及它們在炎性疾病的引發(fā)和維持中的關(guān)鍵作用，已經(jīng)使趨化因子和趨化因子受體成為有吸引力的新的一組治療靶標(biāo)。

趨化因子受體4(CCR4)由Power等人鑒定(J.Biol.Chem.270：19495-19500(1995)；Genbank登錄號X85740)和Meyer等人(J.Biol.Chem.271(24)：14445-14451(1996)；Genbank登錄號X94151)。CCR4是七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，并在Th2細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上選擇性表達(dá)(D'Ambrosio等人，J.Immunol.161：5111-5115(1998))。正常細(xì)胞例如Th2細(xì)胞上的CCR4表達(dá)可以被配體，特別是巨噬細(xì)胞衍生的趨化因子(MDC)部分調(diào)節(jié)(Mariani等人，Eur.J.Immunol.34：231-240(2004))，而癌細(xì)胞上的配體的調(diào)節(jié)還不清楚。已經(jīng)表明，抗CCR4單克隆抗體選擇性地耗竭效應(yīng)子型FoxP3⁺CD4⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而引發(fā)人中的抗腫瘤免疫應(yīng)答(Sugiyama等人，Proc.Nat.Acad.Sci.110(44)：17945-17950(2003))。

KW-0761(莫加利珠單抗或POTELIGEO^TM)在日本被批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)性或難治性CCR4陽性成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤和復(fù)發(fā)性或難治性CCR4陽性外周T細(xì)胞淋巴瘤(PTCL)和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)。KW-0761是免疫球蛋白G亞類1(IgG1)κ同種型的人源化單克隆抗體，其靶向CCR4表達(dá)細(xì)胞并已顯示通過ADCC耗竭表達(dá)CCR4的T淋巴細(xì)胞的能力。KW-0761由于在恒定(Fc)區(qū)從復(fù)合型寡糖的去巖藻糖基化而具有增強(qiáng)的ADCC活性。(Ishii等人，Clinical Cancer Research 16：1520-31(2010)；Shitara等人，Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof，美國專利號7,504,104；美國專利號8,491,901)。

最初被鑒定為在活化的T細(xì)胞上表達(dá)的誘導(dǎo)型共刺激受體的4-1BB(CD137和TNFRSF9)是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的跨膜糖蛋白。對4-1BB的當(dāng)前理解指出表達(dá)通常是活化依賴性的，并且涵蓋免疫細(xì)胞的廣泛子集，包括活化的NK和NKT細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞(DC)包括濾泡DC，刺激的肥大細(xì)胞，分化髓樣細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞(Wang等人，Immunol Rev.229(1)：192-215(2009))，和活化的B細(xì)胞(Zhang等人，J Immunol.184(2)：787-795(2010))。也已經(jīng)在腫瘤脈管系統(tǒng)(Broll K等人，Am J Clin Pathol.115(4)：543-549(2001)；Seaman等人，Cancer Cell 11(6)：539-554(2007))和動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮(Olofsson等，Circulation 117(10)：1292-1301(2008))上證實(shí)了4-1BB表達(dá)。刺激4-1BB(4-1BBL)的配體在活化的抗原呈遞細(xì)胞(APC)、骨髓祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞上表達(dá)。

在B細(xì)胞受體結(jié)合時(shí)，激活的正常人B細(xì)胞上的4-1BB與其配體的相互作用刺激增殖并增強(qiáng)存活(Zhang等人，J Immunol.184(2)：787-795(2010))。在兩項(xiàng)已發(fā)表的研究中研究了4-1BB結(jié)合在B細(xì)胞淋巴瘤中的潛在影響。幾種類型的人原代NHL樣品的評價(jià)表明，4-1BB主要在浸潤性T細(xì)胞而不是淋巴瘤細(xì)胞上表達(dá)(Houot等人，Blood 114(16)：3431-3438(2009))。將4-1BB激動(dòng)劑加入具有利妥昔單抗和NK細(xì)胞的B淋巴瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)物導(dǎo)致增加的淋巴瘤殺傷(Kohrt等人，Blood 117(8)：2423-2432(2011))。此外，在食蟹猴中以0.001-100mg/kg的劑量使用PF-05082566(抗4-1BB激發(fā)型單克隆抗體)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了B細(xì)胞免疫分型；在這些實(shí)驗(yàn)中，外周血B細(xì)胞數(shù)量不變或減少。

4-1BB在幼稚T細(xì)胞的表面上是不可檢測的，但是在激活時(shí)表達(dá)增加。在4-1BB激活時(shí)，作為TNFR相關(guān)因子(TRAF)家族的促存活成員的TRAF-1和TRAF-2被募集到4-1BB胞質(zhì)尾區(qū)，導(dǎo)致NFκB和有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶級聯(lián)(包括ERK，JNK和p38MAP激酶)的下游激活。NFκB活化導(dǎo)致Bfl-1和Bcl-XL(Bcl-2家族的促存活成員)的上調(diào)。促凋亡蛋白Bim以TRAF-1和ERK依賴性方式下調(diào)(Sabbagh等人，J Immunol.180(12)：8093-8101(2008))。

報(bào)道已經(jīng)顯示，4-1BB激發(fā)型mAb增加共刺激分子表達(dá)并顯著增強(qiáng)溶細(xì)胞T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致在多種模型中的抗腫瘤功效。4-1BB激發(fā)型mAb已經(jīng)在單一療法和組合療法的預(yù)防和治療設(shè)置中表現(xiàn)出功效，并且已經(jīng)建立了持久的抗腫瘤保護(hù)性T細(xì)胞記憶應(yīng)答(Lynch等人，Immunol Rev.222：277-286(2008))。4-1BB激動(dòng)劑還在多種自身免疫模型中抑制自身免疫應(yīng)答(Vinay等人，J Mol Med 84(9)：726-736(2006))。

概述

本文提供了用于治療個(gè)體中的癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括向個(gè)體施用抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑。

還提供了藥物。在一些實(shí)施方案中，所述藥物包含與4-1BB激動(dòng)劑組合用于治療癌癥的抗CCR4抗體。在其它實(shí)施方案中，藥物包含與抗CCR4抗體組合用于治療癌癥的4-1BB激動(dòng)劑。

其它實(shí)施方案提供了抗CCR4抗體在制備用于當(dāng)與4-1BB激動(dòng)劑組合施用時(shí)治療個(gè)體中的癌癥的藥物中的用途，以及4-1BB激動(dòng)劑在制備用于當(dāng)與抗CCR4抗體組合施用時(shí)治療個(gè)體中的癌癥的藥物中的用途。

其它實(shí)施方案提供了抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑在制備用于治療個(gè)體中的癌癥的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，藥物包括試劑盒，并且試劑盒還包括包裝插頁，其包含用于將抗CCR4抗體與4-1BB激動(dòng)劑組合使用以治療個(gè)體中的癌癥的說明書。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括向個(gè)體施用包含耗竭CD4⁺T細(xì)胞的試劑和4-1BB激動(dòng)劑的組合療法。在一些實(shí)施方案中，CD4⁺T細(xì)胞是FoxP3⁺CD4⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，耗竭CD4⁺T細(xì)胞的試劑選擇性地耗竭FoxP3⁺CD4⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括向個(gè)體施用包含耗竭CD4⁺T細(xì)胞的試劑、4-1BB激動(dòng)劑和PD-1拮抗劑的組合療法。在一些實(shí)施方案中，耗竭CD4⁺T細(xì)胞的試劑是抗CCR4抗體或抗CD4抗體。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括向個(gè)體施用包含抗CCR4抗體、4-1BB激動(dòng)劑和PD-1拮抗劑的組合療法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括向個(gè)體施用包含抗CD4抗體、4-1BB激動(dòng)劑和PD-1拮抗劑的組合療法。在一些實(shí)施方案中，PD-1拮抗劑抑制PD-L1與PD-1的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，PD-1拮抗劑還抑制PD-L2與PD-1的結(jié)合。在上述治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，PD-1拮抗劑是特異性結(jié)合PD-1或PD-L1并阻斷PD-L1與PD-1結(jié)合的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

組合療法還可以包含一種或多種另外的治療劑。另外的治療劑可以是例如化療劑，生物治療劑(包括但不限于針對VEGF，VEGFR，EGFR，Her2/neu，其它生長因子受體，CD20,CD40,CD-40L,CTLA-4,OX-40,4-1BB,PD-1,TIM-3,LAG-3,GITR,CD137,ICOS,CD28,CD27,HVEM,BTLA,VISTA,CCR8,TIGIT,CD4,ARHGEF6,IKZF1,PTPRC,DOCK2,CCR4,CCR5,IL21R,IL2RB,NCKAP1L,SLAMF1,ITGAL,IL10RA,P2RY10,IL2RA,FMNL1,DOCK10,ITK,SASH3,KIAA0748,LCP2,TNFRSF9(4-1BB，CD137)，CYBB和CTLA4)，免疫原性劑(例如，減毒的癌細(xì)胞，腫瘤抗原，抗原呈遞細(xì)胞，例如用腫瘤衍生的抗原或核酸脈沖的樹突細(xì)胞，免疫刺激細(xì)胞因子(例如IL-2，IFNα2，GM-CSF)，和用編碼免疫刺激細(xì)胞因子例如但不限于GM-CSF的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)。

在一些實(shí)施方案中，抗CCR4抗體特異性結(jié)合人CCR4。在一些實(shí)施方案中，抗CCR4抗體可以選擇性地耗竭CD4⁺T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，抗CCR4抗體可以包含重鏈和輕鏈，其中重鏈和輕鏈包含圖4中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)，前提是SEQ ID NO：15的C末端賴氨酸殘基任選不存在。

在所述治療方法、藥物和用途的所有上述實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑與4-1BB的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且能夠激動(dòng)4-1BB。在上述治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

在一些實(shí)施方案中，所述分離的抗體在位于SEQ ID NO：26的氨基酸殘基115-156中的表位處結(jié)合人4-1BB。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含SEQ ID NO：27的H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：28的H-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：29的H-CDR3氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述4-1BB激動(dòng)劑是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含SEQ ID NO：30的L-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：31的L-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：32的L-CDR3氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含如SEQ ID NO：19所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含如SEQ ID NO：20所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含如SEQ ID NO：19所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列，并且還包含如SEQ ID NO：20所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含如SEQ ID NO：21所示的重鏈氨基酸序列，并且還包含如SEQ ID NO：22所示的輕鏈氨基酸序列，條件是SEQ ID NO：21的C末端賴氨酸殘基任選不存在。

在本發(fā)明的上述治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體是人，并且癌癥是實(shí)體瘤，并且在一些實(shí)施方案中，實(shí)體瘤是膀胱癌，乳腺癌，透明細(xì)胞腎癌，結(jié)腸癌，頭/頸鱗狀細(xì)胞癌，直腸癌，肺鱗狀細(xì)胞癌，甲狀腺癌，膀胱癌，宮頸癌，子宮癌，子宮內(nèi)膜癌，肺腺癌，卵巢癌，乳頭狀腎癌，惡性黑素瘤，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，腎細(xì)胞癌，小細(xì)胞肺癌(SCLC)或三陰性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥是晚期實(shí)體瘤惡性腫瘤。

在本發(fā)明的上述治療方法、藥物和用途的其它實(shí)施方案中，所述個(gè)體是人，并且所述癌癥是血紅素惡性腫瘤，并且在一些實(shí)施方案中，所述血紅素惡性腫瘤是急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性成淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病(CML)，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)，EBV陽性DLBCL，原發(fā)性縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤，T細(xì)胞/組織細(xì)胞富集大B細(xì)胞淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(HL)，套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)，多發(fā)性骨髓瘤(MM)，骨髓細(xì)胞白血病-1蛋白(Mcl-1)，骨髓增生異常綜合征(MDS)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，或小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)。

在任何上述治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，癌癥對于CCR4的表達(dá)測試為陽性。在一些實(shí)施方案中，癌癥具有升高的CCR4表達(dá)。

在任何上述治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體是人，并且所述癌癥是對人CCR4測試為陽性的晚期實(shí)體瘤。

附圖簡述

圖1描述了用于本發(fā)明的示例性抗CCR4單克隆抗體的輕鏈和重鏈CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-6)。

圖2描述了用于本發(fā)明的另一個(gè)示例性抗CCR4單克隆抗體的輕鏈和重鏈CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO：7-12)。

圖3描述了用于本發(fā)明的示例性抗CCR4單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)。

圖4描述了抗CCR4單克隆抗體KW-0761的全長重鏈和輕鏈的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：15和16)，以及抗CCR4單克隆抗體KW-0761的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：17和18)。

圖5描述了抗-PD-1抗體納武單抗(nivolumab)的重鏈和輕鏈的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：23和24)。

圖6描述了4-1BB激發(fā)型抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：19和20)。

圖7描述了4-1BB激發(fā)型抗體的重鏈CDR序列(SEQ ID NO：27、28和29)和輕鏈CDR序列(SEQ ID NO：30、31和32)的氨基酸序列。

圖8描述了PF-05082566的重鏈和輕鏈的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：21和22)。

圖9描繪了顯示在B16黑素瘤模型中CD4⁺T細(xì)胞耗竭對4-1BB激發(fā)型抗體治療、PD-1拮抗劑抗體治療和組合治療的影響的圖。

圖10描述了顯示在CT26結(jié)腸腫瘤模型中CD4⁺T細(xì)胞耗竭對4-1BB激發(fā)型抗體治療、PD-1拮抗劑抗體治療和組合治療的影響的圖。

詳述

縮寫。在本發(fā)明的詳細(xì)描述和實(shí)施例中，將使用以下縮寫：

BID 一個(gè)劑量，每日兩次

CDR 互補(bǔ)決定區(qū)

CHO 中華倉鼠卵巢

DFS 無疾病存活

DLT 劑量限制性毒性

FFPE 經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的

FR 構(gòu)架區(qū)

HNSC 頭/頸鱗狀細(xì)胞癌。

IgG 免疫球蛋白G

IHC 免疫組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)的

MDSC 髓源性抑制細(xì)胞

MTD 最大耐受劑量

NCBI 國家生物技術(shù)信息中心

NCI 國家癌癥研究所

OR 總體反應(yīng)

OS 總體存活

PD 進(jìn)行性疾病

PFS 無進(jìn)展存活

PR 部分反應(yīng)

Q1W 每一周一個(gè)劑量

Q2W 每兩周一個(gè)劑量

Q3W 每三周一個(gè)劑量

Q4W 每四周一個(gè)劑量

QD 每天一個(gè)劑量

RECIST 實(shí)體腫瘤中的應(yīng)答評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

SD 病情穩(wěn)定

VH 免疫球蛋白重鏈可變區(qū)

VK 免疫球蛋白κ輕鏈可變區(qū)

I.定義

為了使本發(fā)明更容易理解，某些技術(shù)和科學(xué)術(shù)語在下面具體定義。除非在本文的其它地方具體定義，否則本文使用的所有其它技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。

當(dāng)用于修飾數(shù)字限定的參數(shù)(例如，抗CCR4抗體或4-1BB激動(dòng)劑的劑量或本文所述的組合治療的治療時(shí)間的長度)時(shí)，“約”意指參數(shù)可以在該參數(shù)的規(guī)定數(shù)值之上或之下多至10％上變化。例如，約5mg/kg的劑量可以在4.5mg/kg和5.5mg/kg之間變化。

如本文包括所附權(quán)利要求書中所使用的，除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)形式的詞例如“一種”、“一個(gè)”和“該”包括它們相應(yīng)的復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)應(yīng)用于動(dòng)物、人、實(shí)驗(yàn)受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體時(shí)，“施用”和“治療”是指外源藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動(dòng)物、人、受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體接觸。細(xì)胞的處理包括試劑與細(xì)胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中流體與細(xì)胞接觸?！笆┯谩焙汀爸委煛边€指通過試劑、診斷劑、結(jié)合化合物或通過另一種細(xì)胞體外和離體處理例如細(xì)胞。術(shù)語“受試者”包括任何生物體，優(yōu)選動(dòng)物，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物(例如大鼠，小鼠，狗，貓，兔)，最優(yōu)選人。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指適合用于遞送結(jié)合分子的制劑中的任何無活性物質(zhì)。載體可以是抗粘附劑，粘合劑，包衣，崩解劑，填充劑或稀釋劑，防腐劑(例如抗氧化劑，抗細(xì)菌劑或抗真菌劑)，甜味劑，吸收延遲劑，潤濕劑，乳化劑，緩沖劑等。合適的藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)右旋糖，植物油(例如橄欖油)，鹽水，緩沖液，緩沖鹽水，和等滲劑，例如糖，多元醇，山梨醇和氯化鈉。

如本文所用，術(shù)語“抗體”是指表現(xiàn)出所需生物或結(jié)合活性的任何形式的免疫球蛋白分子。因此，其以最廣泛的含義使用，并且具體涵蓋但不限于單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，人源化、完全人抗體，嵌合抗體和駱駝化單域抗體。“親本抗體”是通過在針對預(yù)期用途修飾抗體(例如用作人類治療劑的抗體的人源化)之前將免疫系統(tǒng)暴露于抗原而獲得的抗體。如本文所用，術(shù)語“抗體”不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且除非另有說明，還包括與完整抗體競爭特異性結(jié)合的其任何抗原結(jié)合部分，包含抗原結(jié)合部分的融合蛋白，以及包含抗原識別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構(gòu)型?？乖Y(jié)合部分包括例如Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')₂，F(xiàn)d，F(xiàn)v，結(jié)構(gòu)域抗體(dAb，例如鯊魚和駱駝抗體)，包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的片段，單鏈可變片段抗體(scFv)，最大抗體，微型抗體，胞內(nèi)抗體，雙抗體，三抗體，四抗體，v-NAR和雙scFv，以及含有免疫球蛋白的至少一部分(足以賦予多肽特異性的抗原結(jié)合)的多肽?？贵w包括任何類別的抗體，例如IgG，IgA或IgM(或其亞類)，并且抗體不需要是任何特定類別。取決于其重鏈恒定區(qū)的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可以歸于不同類別。有五種主要類別的免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中幾種可以進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgG₁,IgG₂,IgG₃,IgG₄,IgA₁和IgA₂。對應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α，δ，ε，γ和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的。

本文所用的術(shù)語“4-1BB抗體”是指能夠結(jié)合人4-1BB受體的如本文定義的抗體。

如本文所用的“可變區(qū)”或“V區(qū)”或“V鏈”是指在不同抗體之間在序列上可變的IgG鏈的區(qū)段。它延伸到輕鏈中的Kabat殘基109和重鏈中的Kabat殘基113?？贵w的“可變區(qū)”指單獨(dú)或組合的抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)。通常，重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含位于相對保守的構(gòu)架區(qū)(FR)內(nèi)的三個(gè)高變區(qū)，也稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。CDR通常通過構(gòu)架區(qū)排列，以使得能夠結(jié)合特定表位。一般來說，從N末端到C末端，輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域都包含F(xiàn)R1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4。通常，每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸的分配符合Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；5^th ed.；NIH出版號91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat,等人,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia,等人,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia,等人,(1989)Nature 342:878-883的定義。

如本文所用，術(shù)語“高變區(qū)”是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的CDRL1，CDRL2和CDRL3以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的CDRH1，CDRH2和CDRH3)的氨基酸殘基。參見Kabat等人.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed。Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(通過序列定義抗體的CDR區(qū))；也參見Chothia和Lesk(1987)Biol.196：901-917(通過結(jié)構(gòu)定義抗體的CDR區(qū))。如本文所用，術(shù)語“構(gòu)架”或“FR”殘基指除本文定義為CDR殘基的高變區(qū)殘基外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。

除非另有說明，否則本文所用的“抗體片段”或“抗原結(jié)合片段”是指抗體的抗原結(jié)合片段，即保留特異性結(jié)合由全長抗體結(jié)合的抗原的能力的抗體片段，例如保留一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的片段?？贵w結(jié)合片段的實(shí)例包括但不限于Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')₂和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；由抗體片段形成的多特異性抗體和納米抗體。

“特異性結(jié)合”特定靶蛋白的抗體是與其它蛋白相比顯示優(yōu)先結(jié)合該靶的抗體，但該特異性不需要絕對的結(jié)合特異性。如果其結(jié)合決定了樣品中靶蛋白的存在，例如沒有產(chǎn)生不希望的結(jié)果如假陽性，則抗體被認(rèn)為針對其預(yù)期靶是“特異性”的。本發(fā)明中有用的抗體將以是與非靶蛋白的親和力的至少2倍，優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少20倍，最優(yōu)選至少100倍的親和力結(jié)合靶蛋白。如本文所用，抗體被認(rèn)為特異性結(jié)合包含給定的氨基酸序列例如成熟人PD-1或人PD-L1分子的氨基酸序列的多肽，前提是其結(jié)合包含該序列的多肽但不結(jié)合缺少該序列的蛋白質(zhì)。

“嵌合抗體”是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種(例如，人)或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與衍生自另一物種(例如小鼠)或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源的抗體，以及此類抗體的片段，只要它們顯示出所需的生物活性。

“人抗體”是指僅包含人免疫球蛋白序列的抗體。如果在小鼠、小鼠細(xì)胞或源自小鼠細(xì)胞的雜交瘤中產(chǎn)生，人抗體可以包含鼠碳水化合物鏈。類似地，“小鼠抗體”或“大鼠抗體”是指分別僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗體。

“人源化抗體”是指包含來自非人(例如鼠)抗體以及人抗體的序列的抗體形式。這樣的抗體含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗體將包含基本上所有至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。當(dāng)必要時(shí)將前綴“hum”，“hu”或“h”添加到抗體克隆名稱中，以將人源化抗體與親本嚙齒動(dòng)物抗體區(qū)分開。嚙齒動(dòng)物抗體的人源化形式通常包含親本嚙齒動(dòng)物抗體的相同CDR序列，盡管可包括某些氨基酸取代以增加親和力，增加人源化抗體的穩(wěn)定性或出于其它原因。

術(shù)語“癌癥”、“癌性”或“惡性”是指或描述哺乳動(dòng)物中通常特征在于不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長的生理狀況。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌，淋巴瘤，白血病，胚細(xì)胞瘤和肉瘤。這種癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌，肺腺癌，頭/頸鱗狀細(xì)胞癌，骨髓瘤，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，急性骨髓性白血病(AML)，多發(fā)性骨髓瘤，胃腸(道)癌，直腸癌，腎癌，卵巢癌，肝癌，成淋巴細(xì)胞白血病，淋巴細(xì)胞性白血病，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌，腎癌，前列腺癌，甲狀腺癌，黑素瘤，軟骨肉瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，胰腺癌，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，骨癌，尤因氏肉瘤，宮頸癌，腦癌，胃癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，子宮癌，卵巢癌和頭頸癌。涉及4-1BB或CCR4的多種癌癥，無論是惡性的還是良性的，無論是原發(fā)性還是繼發(fā)性的，可以通過本公開內(nèi)容提供的方法治療或預(yù)防?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療的特別優(yōu)選的癌癥包括特征為在測試的組織樣品中表達(dá)CCR4的那些癌癥。

“生物治療劑”是指在支持腫瘤維持和/或生長或抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的任何生物學(xué)途徑中阻斷配體/受體信號傳導(dǎo)的生物分子，例如抗體或融合蛋白。

除非另有說明，本文所用的“CDR”是指使用Kabat編號系統(tǒng)定義的免疫球蛋白可變區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)。

“化療劑”是指可以引起癌細(xì)胞死亡或干擾癌細(xì)胞的生長、分裂、修復(fù)和/或功能的化學(xué)或生物物質(zhì)?；焺┑膶?shí)例包括公開于WO 2006/129163和US 20060153808中的那些，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。化療劑的類別包括但不限于：烷化劑，抗代謝物，激酶抑制劑，紡錘體毒物植物生物堿，細(xì)胞毒性/抗腫瘤抗生素，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，光敏劑，抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，抗孕酮，雌激素受體下調(diào)劑(ERD)，雌激素受體拮抗劑，黃體生成素釋放激素激動(dòng)劑，抗雄激素，芳香酶抑制劑，EGFR抑制劑，VEGF抑制劑，抑制與異常細(xì)胞增殖或腫瘤生長相關(guān)的基因的表達(dá)的反義寡核苷酸。可用于本發(fā)明的治療方法的化療劑包括細(xì)胞抑制劑和/或細(xì)胞毒劑。

本公開內(nèi)容提供的抗體和組合物可以通過任何合適的腸內(nèi)施用途徑或胃腸外施用途徑施用。術(shù)語施用的“腸內(nèi)途徑”是指經(jīng)由胃腸道的任何部分的施用。腸內(nèi)途徑的實(shí)例包括口服、粘膜、頰和直腸途徑或胃內(nèi)途徑?！澳c胃外途徑”是指腸內(nèi)途徑以外的施用途徑。腸胃外施用途徑的實(shí)例包括靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮內(nèi)，腹膜內(nèi)，腫瘤內(nèi)，膀胱內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，鞘內(nèi)，囊內(nèi)，眶內(nèi)，心內(nèi)，經(jīng)氣管，關(guān)節(jié)內(nèi)，囊下，蛛網(wǎng)膜下，脊柱內(nèi)，硬膜外和胸骨內(nèi)，皮下或局部施用。本公開內(nèi)容的抗體和組合物可以使用任何合適的方法施用，例如通過口服攝取，鼻胃管，胃造口術(shù)管，注射，輸注，可植入輸注泵和滲透泵。施用的合適途徑和方法可以根據(jù)許多因素而變化，所述因素例如是所用的特異性抗體，所需的吸收速率，所用的具體制劑或劑型，所治療疾病的類型或嚴(yán)重程度，作用的具體位點(diǎn)，和患者的狀況，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇。

本文所用的關(guān)于藥物施用的術(shù)語“同時(shí)施用”是指施用藥物，以使得個(gè)體藥物同時(shí)存在于受試者體內(nèi)。除了同時(shí)施用藥物(通過相同或替代途徑)外，同時(shí)施用還可包括在不同時(shí)間施用藥物(通過相同或替代途徑)。

具有效應(yīng)A和B的兩種單一化合物的Bliss獨(dú)立組合反應(yīng)C為C＝A+B-A*B，其中每種效應(yīng)表示為0和1之間的分?jǐn)?shù)抑制。(參考：Bliss(1939)Annals of Applied Biology)被定義為實(shí)驗(yàn)響應(yīng)和計(jì)算的Bliss獨(dú)立值之間的差的Bliss值表明組合的兩種化合物是否是加性的或協(xié)同的。

零(0)的Bliss值被認(rèn)為是加性的。術(shù)語“加性的”是指兩種靶向試劑的組合的結(jié)果是單獨(dú)每種試劑的總和。

本文所用的“Chothia”是指在Al-Lazikani等，JMB 273：927-948(1997)中描述的抗體編號系統(tǒng)。

“保守性修飾的變體”或“保守性取代”是指用具有相似特征(例如電荷，側(cè)鏈大小，疏水性/親水性，骨架構(gòu)象和剛性等)的其它氨基酸取代蛋白質(zhì)中的氨基酸，以使得可以頻繁地進(jìn)行改變而不改變蛋白質(zhì)的生物活性或其它所需性質(zhì)，例如抗原親和力和/或特異性。通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，多肽的非必需區(qū)域中的單個(gè)氨基酸取代基本上不改變生物活性(參見例如Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(第4版))。此外，結(jié)構(gòu)上或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破壞生物活性。示例性保守取代列于下表1中。

表1.示例性保守氨基酸取代

在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中使用的“基本上由...組成”及其變體，例如“基本由...組成”或“大體上由...組成”表示包括任何列舉的元素或元素組，以及任選地包括與所列舉的元素具有相似或不同性質(zhì)的其它元素，其不會(huì)實(shí)質(zhì)上改變所指定的劑量方案、方法或組合物的基本或新穎性質(zhì)。作為非限制性實(shí)例，基本上由所列舉的氨基酸序列組成的抗CCR4抗體還可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸(包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代)，其不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響結(jié)合化合物的性質(zhì)。

“抗CCR4抗體”是指特異性結(jié)合CCR4的抗體。

如本文所用，抗人CCR4是指特異性結(jié)合人CCR4的抗體。一個(gè)示例性人CCR4分子由以下序列組成：

MNPTDIADTT LDESIYSNYY LYESIPKPCT KEGIKAFGEL FLPPLYSLVF VFGLLGNSVV VLVLFKYKRL RSMTDVYLLN LAISDLLFVF SLPFWGYYAA DQWVFGLGLC KMISWMYLVG FYSGIFFVML MSIDRYLAIV HAVFSLRART LTYGVITSLA TWSVAVFASL PGFLFSTCYT ERNHTYCKTK YSLNSTTWKV LSSLEINILG LVIPLGIMLF CYSMIIRTLQ HCKNEKKNKA VKMIFAVVVL FLGFWTPYNI VLFLETLVEL EVLQDCTFER YLDYAIQATE TLAFVHCCLN PIIYFFLGEK FRKYILQLFK TCRGLFVLCQ YCGLLQIYSA DTPSSSYTQS TMDHDLHDAL (SEQ ID NO：25)(UniProtKB/SWISS-PROT：P51679.1；GenBank登錄號NM_005508.2)。

本文所用的“構(gòu)架區(qū)”或“FR”是指排除CDR區(qū)的免疫球蛋白可變區(qū)。

“同源性”是指兩個(gè)多肽序列在最佳比對時(shí)的序列相似性。當(dāng)兩個(gè)比較的序列兩者中的位置被相同的氨基酸單體亞單位占據(jù)時(shí)，例如，如果兩個(gè)不同Ab的輕鏈CDR中的一個(gè)位置被丙氨酸占據(jù)，則兩個(gè)Ab在該位置是同源的。同源性百分比是由兩個(gè)序列共有的同源位置的數(shù)目除以比較的位置的總數(shù)再×100。例如，如果兩個(gè)序列中10個(gè)位置中的8個(gè)在序列最佳比對時(shí)匹配或同源，則兩個(gè)序列是80％同源的。通常，當(dāng)兩個(gè)序列比對以產(chǎn)生最大百分比同源性時(shí)進(jìn)行比較。例如，可以通過BLAST算法執(zhí)行比較，其中選擇算法的參數(shù)以在各個(gè)參考序列的整個(gè)長度上給出各個(gè)序列之間的最大匹配。

以下參考文獻(xiàn)涉及經(jīng)常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul,S.F.,等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.,等人,(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden,T.L.,等人,(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.,等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.,等人,(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.,等人,(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.等人,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.,等人,"A model of evolutionary change in proteins."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.,等人,"Matrices for detecting distant relationships."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3."M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.,等人,(1991)Methods 3:66-70；Henikoff,S.,等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；Altschul,S.F.,等人,(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.,等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Karlin,S.,等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877；Dembo,A.,等人,(1994)Ann.Prob.22:2022-2039；和Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments."in Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai,ed.),(1997)pp.1-14,Plenum,New York。

“分離的抗體”和“分離的抗體片段”是指純化狀態(tài)，并且在這樣的上下文中是指所述分子基本上不含其它生物分子，例如核酸，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，碳水化合物或其它材料，例如細(xì)胞碎片和生長介質(zhì)。通常，術(shù)語“分離的”不意指完全不存在這樣的物質(zhì)或不存在水、緩沖液或鹽，除非它們以基本上干擾如本文所述的結(jié)合化合物的實(shí)驗(yàn)或治療用途的量存在。

本文所用的“Kabat”是指由Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)開創(chuàng)的免疫球蛋白比對和編號系統(tǒng)。

如本文所使用的，“單克隆抗體”或“mAb”或“Mab”是指基本上同質(zhì)的抗體群，即包含在氨基酸序列上除了可能的可少量存在的天然存在的突變以外是相同的群體的抗體分子。相比之下，常規(guī)(多克隆)抗體制備物通常包括在其可變結(jié)構(gòu)域特別是其CDR中具有不同氨基酸序列的多種不同抗體，其通常特異于不同表位。修飾語“單克隆”表示如從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體的特征，并且不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過Kohler等人(1975)Nature 256：495首先描述的雜交瘤方法制備，或者可以通過重組DNA方法制備(參見例如美國專利號4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可以使用例如Clackson等人(1991)Nature 352：624-628和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。還參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731。

“患者”或“受試者”是指需要治療或正參與臨床試驗(yàn)、流行病學(xué)研究或用作對照的任何單個(gè)受試者，包括人和哺乳動(dòng)物獸醫(yī)患者，例如牛、馬、狗和貓。

結(jié)合人CCR4并且可用于本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的mAb的實(shí)例描述于例如US8491902和US20110171210中。在本發(fā)明的治療方法、藥物和用途中用作抗CCR4抗體的特異性抗人CCR4 mAb包括：KW-0761，其具有CAS登記號1159266-37-1的人源化IgG1 mAb，并且包含圖4所示的重鏈和輕鏈氨基酸序列；和US20110171210中描述的人源化抗體huCCR4，其包含圖3所示的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。

在本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，抗CCR4抗體是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含：(a)輕鏈CDR SEQ ID NO：1、2和3以及重鏈CDR SEQ ID NO：4、5和6；或(b)輕鏈CDR SEQ ID NO：7、8和9以及重鏈CDR SEQ ID NO：10、11和12。

在本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，抗CCR4抗體是特異性結(jié)合人CCR4的單克隆抗體，并且包含(a)包含SEQ ID NO：13的重鏈可變區(qū)和(b)包含SEQ ID NO：14的輕鏈可變區(qū)。

在本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，抗CCR4抗體是特異性結(jié)合人CCR4的單克隆抗體，并且包含(a)包含SEQ ID NO：15的重鏈和(b)包含SEQ ID NO：16的輕鏈。

下表2提供了用于本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的示例性抗CCR4 mAb的氨基酸序列的列表，并且序列顯示在圖1-4中。

“持續(xù)反應(yīng)”意指在停止用治療劑或本文所述的組合療法治療后的持續(xù)治療效果。在一些實(shí)施方案中，持續(xù)反應(yīng)具有至少與治療持續(xù)時(shí)間相同的持續(xù)時(shí)間，或?yàn)橹委煶掷m(xù)時(shí)間的至少約1.5、2.0、2.5或3倍。

術(shù)語“協(xié)同作用”或“協(xié)同的”用于表示兩種藥劑的組合的反應(yīng)大于每種藥劑的單獨(dú)反應(yīng)的總和。更具體地，在體外設(shè)置中，協(xié)同作用的一種量度被稱為“Bliss協(xié)同作用”。Bliss協(xié)同作用是指“超過Bliss獨(dú)立性的過量(excess over Bliss independence)”，如通過上述Bliss值所確定的。當(dāng)Bliss值大于零(0)，或更優(yōu)選大于0.2時(shí)，認(rèn)為其表示協(xié)同作用。當(dāng)然，本文中“協(xié)同作用”的使用還包括通過其它和/或替代方法測量的體外協(xié)同作用。本文提及的組合的體外生物效應(yīng)(包括但不限于抗癌作用，其大于或等于組合的單獨(dú)組分的總和)可與Bliss值相關(guān)。此外，本文中的“協(xié)同作用”，包括組分的組合是否表現(xiàn)出等于或大于單獨(dú)組分的總和的活性，可以通過另外的和/或替代的方法測量，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或?qū)⑹敲黠@的。

“組織切片”是指組織樣品的單個(gè)部分或塊，例如從正常組織或腫瘤的樣品切割的薄切片組織。

本文所用的“治療”或“醫(yī)治”癌癥是指對患有癌癥或被診斷患有癌癥的受試者施用抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑的組合療法，以實(shí)現(xiàn)至少一種積極的治療效果，例如癌細(xì)胞數(shù)目減少，腫瘤尺寸減小，癌細(xì)胞浸潤到外周器官中的速率降低或腫瘤轉(zhuǎn)移或腫瘤生長速率降低。癌癥中的積極治療效果可以以多種方式測量(參見，W.A.Weber，J.Nucl.Med.50：1S-10S(2009))。例如，對于腫瘤生長抑制，根據(jù)NCI標(biāo)準(zhǔn)，T/C≤42％是抗腫瘤活性的最低水平。T/C<10％被認(rèn)為是高抗腫瘤活性水平，其中T/C(％)＝治療的中值腫瘤體積/對照的中值腫瘤體積×100。在一些實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的組合實(shí)現(xiàn)的治療是PR、CR、OR、PFS、DFS和OS中的任一種。PFS(也稱為“腫瘤進(jìn)展時(shí)間”)表示治療期間和之后癌癥不生長的時(shí)間長度，并且包括患者經(jīng)歷CR或PR的時(shí)間量，以及患者經(jīng)歷SD的時(shí)間量。DFS是指治療期間和治療后患者保持無疾病的時(shí)間長度。OS是指與未處理或未治療的個(gè)體或患者相比，壽命預(yù)期的延長。在一些實(shí)施方案中，對本發(fā)明組合的反應(yīng)是使用RECIST 1.1反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)評估的PR、CR、PFS、DFS、OR或OS中的任一種。用于本發(fā)明的組合的有效治療癌癥患者的治療方案可以根據(jù)諸如患者的疾病狀態(tài)、年齡和體重的因素以及治療在受試者中引起抗癌反應(yīng)的能力而變化。雖然本發(fā)明的任何方面的實(shí)施方案可能不能有效地在每個(gè)受試者中獲得積極的治療效果，但是它應(yīng)該在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著數(shù)量的受試者中如此，如通過本領(lǐng)域已知的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)測試所確定的，例如學(xué)生氏t檢驗(yàn)，chi²-檢驗(yàn)，根據(jù)Mann和Whitney的U檢驗(yàn)，Kruskal-Wallis檢驗(yàn)(H檢驗(yàn))，Jonckheere-Terpstra檢驗(yàn)和Wilcoxon檢驗(yàn)。

術(shù)語“治療方案”、“給藥方案”和“施用方案”可互換使用來指本發(fā)明的組合中的每種治療劑的施用劑量和時(shí)間。

當(dāng)應(yīng)用于診斷患有或懷疑患有癌癥的受試者時(shí)，“腫瘤”是指任何大小的惡性或潛在惡性腫瘤或組織塊，并且包括原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性腫瘤。實(shí)體瘤是通常不包含囊腫或液體區(qū)域的異常生長的組織塊。不同類型的實(shí)體瘤根據(jù)形成它們的細(xì)胞類型來命名。實(shí)體瘤的實(shí)例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液癌癥)通常不形成實(shí)體瘤(National Cancer Institute，Dictionary of Cancer Terms)。

“腫瘤負(fù)荷”也稱為“腫瘤負(fù)擔(dān)”，是指分布在整個(gè)身體中的腫瘤物質(zhì)的總量。腫瘤負(fù)荷是指在整個(gè)身體包括淋巴結(jié)和骨髓中的癌細(xì)胞的總數(shù)或腫瘤的總大小?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種方法測定腫瘤負(fù)荷，例如，通過在從受試者移除后測量腫瘤的尺寸，例如使用測徑器，或通過在體內(nèi)時(shí)使用成像技術(shù)(例如超聲，骨掃描，計(jì)算機(jī)斷層攝影(CT)或磁共振成像(MRI)掃描)。

術(shù)語“腫瘤大小”是指可被測量為腫瘤的長度和寬度的腫瘤的總大小。腫瘤大小可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法測定，例如，通過在從受試者移除后測量腫瘤的尺寸，例如使用測徑器，或通過在體內(nèi)時(shí)使用成像技術(shù)(例如骨掃描，超聲，CT或MRI掃描)。

4-1BB包含信號序列(氨基酸殘基1-17)，其后是胞外結(jié)構(gòu)域(169個(gè)氨基酸)，跨膜區(qū)(27個(gè)氨基酸)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(42個(gè)氨基酸)(Cheuk ATC等人,2004Cancer Gene Therapy 11：215-226)。受體在細(xì)胞表面上以單體和二聚體形式表達(dá)，并且可能與4-1BB配體三聚化以傳導(dǎo)信號。

在幼稚T細(xì)胞的表面上不能檢測到4-1BB，但是在激活時(shí)表達(dá)增加。在4-1BB激活時(shí)，作為TNFR相關(guān)因子(TRAF)家族的促存活成員的TRAF-1和TRAF-2被募集到4-1BB胞質(zhì)尾區(qū)，從而導(dǎo)致NFκB和有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶級聯(lián)(包括ERK，JNK和p38MAP激酶)的下游激活。NFκB活化導(dǎo)致Bcl-2家族的促存活成員Bfl-1和Bcl-XL的上調(diào)。促凋亡蛋白Bim以TRAF1和Erk依賴性方式下調(diào)(24)。

術(shù)語“4-1BB”和“4-1BB受體”在本申請中可互換使用，并且指任何形式的4-1BB受體，以及保留4-1BB受體的至少部分活性的其變體、同種型和物種同源物。因此，如本文定義和公開的結(jié)合分子也可以結(jié)合來自除人之外的物種的4-1BB。在其它情況下，結(jié)合分子可以完全特異于人4-1BB并且可不表現(xiàn)物種或其它類型的交叉反應(yīng)性。除非另有說明，例如通過特別提及人4-1BB，否則4-1BB包括天然序列4-1BB的所有哺乳動(dòng)物物種(例如人，犬，貓，馬和牛)。一個(gè)示例性人4-1BB是255個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(登錄號NM_001561；NP_001552)。完整的人4-1BB氨基酸序列的一個(gè)實(shí)施方案提供于SEQ ID NO：26。

本文所用的“4-1BB激動(dòng)劑”是指本文定義的任何化學(xué)化合物或生物分子，其在結(jié)合4-1BB時(shí)，(1)刺激或激活4-1BB，(2)增強(qiáng)、增加、促進(jìn)、誘導(dǎo)或延長4-1BB的活性、功能或存在，或(3)增強(qiáng)、增加、促進(jìn)或誘導(dǎo)4-1BB的表達(dá)。

可用于本發(fā)明的任何治療方法、藥物和用途的4-1BB激動(dòng)劑包括特異性結(jié)合4-1BB的單克隆抗體(mAb)或其抗原結(jié)合片段。4-1BB的替代名稱或同義詞包括CD137和TNFRSF9。在其中治療人類個(gè)體的本發(fā)明的任何治療方法、藥物和用途中，4-1BB激動(dòng)劑增加4-1BB介導(dǎo)的反應(yīng)。在本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑顯著增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，從而在幾種模型中導(dǎo)致抗腫瘤活性。

mAb可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，并且可以包含人恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，人恒定區(qū)選自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4恒定區(qū)，并且在一些實(shí)施方案中，人恒定區(qū)是IgG1或IgG4恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段選自Fab，F(xiàn)ab'-SH，F(xiàn)(ab')₂，scFv和Fv片段。

結(jié)合人4-1BB并且可用于本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的mAb的實(shí)例描述于US 8,337,850和US 2013-0078240中。在本發(fā)明的治療方法、藥物和用途中用作4-1BB激動(dòng)劑的特異性抗人4-1BB mAb包括PF-05082566。PF-05082566是靶向4-1BB的完全人源化IgG2激發(fā)型單克隆抗體。

在本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含：(a)輕鏈CDR SEQ ID NO：30、31和32以及重鏈CDR SEQ ID NO：27、28和29。

在本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑是特異性結(jié)合人4-1BB的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，并且包含(a)包含SEQ ID NO：19的重鏈可變區(qū)或其變體，和(b)包含選自SEQ ID NO：20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)或其變體。重鏈可變區(qū)序列的變體與參照序列相同，除了在構(gòu)架區(qū)(即，CDR外部)具有高達(dá)17個(gè)保守氨基酸取代，并且在構(gòu)架區(qū)中優(yōu)選具有少于十，九，八，七，六或五個(gè)保守氨基酸取代。輕鏈可變區(qū)序列的變體與參照序列相同，除了在構(gòu)架區(qū)(即，CDR外部)具有多達(dá)五個(gè)保守氨基酸取代，并且在構(gòu)架區(qū)中優(yōu)選具有少于四個(gè)，三個(gè)或兩個(gè)保守氨基酸取代。

在本發(fā)明的治療方法、藥物和用途的一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑是特異性結(jié)合人4-1BB的單克隆抗體，并且包含(a)如SEQ ID NO：21中所示的重鏈氨基酸序列和(b)如SEQ ID NO：22所示的輕鏈氨基酸序列，條件是SEQ ID NO：21的C末端賴氨酸殘基任選不存在。

“PD-1拮抗劑”是指阻斷癌細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1與免疫細(xì)胞(T細(xì)胞，B細(xì)胞或NKT細(xì)胞)上表達(dá)的PD-1結(jié)合的任何化學(xué)化合物或生物分子，其優(yōu)選還阻斷癌細(xì)胞上表達(dá)的PD-L2與免疫細(xì)胞表達(dá)的PD-1的結(jié)合。PD-1及其配體的替代名稱或同義詞包括：對于PD-1的PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；對于PD-1的PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；和對于PD-2的PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。在其中治療人類個(gè)體的本發(fā)明的任何治療方法、藥物和用途中，抗PD-1抗體阻斷人PD-L1與人PD-1的結(jié)合，并且優(yōu)選阻斷人PD-L1和PD-L2結(jié)合人PD1。示例性人PD-1氨基酸序列可以在NCBI Locus No.:NP_005009中找到。示例性人PD-L1和PD-L2氨基酸序列可以分別在NCBI Locus No.:NP_054862和NP_079515中找到。

可用于本發(fā)明的任何治療方法、藥物和用途的PD-1拮抗劑包括特異性結(jié)合PD-1或PD-L1以及優(yōu)選特異性結(jié)合人PD-1或人PD-L1的單克隆抗體(mAb)或其抗原結(jié)合片段。mAb可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，并且可以包括人恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，人恒定區(qū)選自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4恒定區(qū)，并且在一些實(shí)施方案中，人恒定區(qū)是IgG1或IgG4恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段選自Fab，F(xiàn)ab'-SH，F(xiàn)(ab')₂，scFv和Fv片段。

應(yīng)當(dāng)理解，無論何處在本文中用語言“包括”描述實(shí)施方案，否則也提供以術(shù)語“由......組成”和/或“基本上由......組成”描述的類似實(shí)施方案。

在本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓桨敢择R庫什組或其它替代分組描述時(shí)，本發(fā)明不僅包括作為整體列出的整個(gè)組，而且單獨(dú)地包括該組的每個(gè)成員和主要組的所有可能的亞組，以及沒有一個(gè)或多個(gè)組成員的主要組。本發(fā)明還設(shè)想明確排除所要求保護(hù)的發(fā)明中的任何組成員中的一個(gè)或多個(gè)。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，詞語“包括”或其變形例如“含有”或“包含”將被理解為暗示包括所述的整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。除非上下文另有要求，否則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。術(shù)語“例如”或“諸如”之后的任何實(shí)例不意味著是窮盡的或限制性的。

本文描述了示例性方法和材料，盡管與本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試中。材料、方法和實(shí)例僅是舉例說明性的，而不是限制性的。

II.方法、用途和藥物

本文提供了用于治療個(gè)體中癌癥的方法，包括向個(gè)體施用包含抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑的組合療法。在一些實(shí)施方案中，組合療法包括抗CCR4抗體、4-1BB激動(dòng)劑和PD-1拮抗劑。

組合療法還可以包含一種或多種另外的治療劑。另外的治療劑可以是例如化療劑，生物治療劑(包括但不限于針對VEGF，VEGFR，EGFR，Her2/neu，其它生長因子受體，CD20,CD40,CD-40L,CTLA-4,OX-40,4-1BB,PD-1,TIM-3,LAG-3,GITR,CD137,ICOS,CD28,CD27,HVEM,BTLA,VISTA,CCR8,TIGIT,CD4,ARHGEF6,IKZF1,PTPRC,DOCK2,CCR4,CCR5,IL21R,IL2RB,NCKAP1L,SLAMF1,ITGAL,IL10RA,P2RY10,IL2RA,FMNL1,DOCK10,ITK,SASH3,KIAA0748,LCP2,TNFRSF9(4-1BB，CD137)，CYBB和CTLA4)，免疫原性劑(例如，減毒的癌細(xì)胞，腫瘤抗原，抗原呈遞細(xì)胞，例如用腫瘤衍生的抗原或核酸脈沖的樹突細(xì)胞，免疫刺激細(xì)胞因子(例如IL-2，IFNα2，GM-CSF)，和用編碼免疫刺激細(xì)胞因子例如但不限于GM-CSF的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)。

化療劑的實(shí)例包括烷化劑，例如塞替派和環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽，例如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶類，例如苯并多巴，卡波醌，meturedopa和uredopa；乙烯亞胺和甲基蜜胺類包括六甲蜜胺，三乙撐蜜胺，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基三聚氰胺；番荔枝內(nèi)酯類(特別是?；遣莅泛筒嫉啬切?；喜樹堿(包括合成類似物托泊替康)；苔蘚抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；cryptophycin(特別是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他?。欢嗫顾?包括合成類似物KW-2189和CBI-TMI)；電穿孔素；水鬼蕉堿；sarcodictyin；海綿抑制素；氮芥，例如苯丁酸氮芥，萘氮芥，氯磷酰胺，雌莫司汀，異環(huán)磷酰胺，氮芥，鹽酸氧化氮芥，美法侖，諾維本，膽甾醇對苯乙酸氮芥，潑尼莫司汀，曲磷胺，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲如卡莫司汀，氯唑菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司??；抗生素如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特別是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素參見例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl。，33：183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicin A；雙膦酸鹽，例如氯屈膦酸鹽；埃斯波霉素；以及新制癌菌素發(fā)色團(tuán)及相關(guān)色蛋白烯二炔抗生素發(fā)色團(tuán))，aclacinomysins，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博萊霉素，放線菌素c，卡拉霉素，caminomycin，嗜癌霉素，色霉素，放線菌素D，柔紅霉素，地托比星，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(包括嗎啉代-多柔比星，氰嗎啉代-多柔比星，2-吡咯啉5-多柔比星和脫氧多柔比星)，表柔比星，依索比星，伊達(dá)比星，麻西羅霉素，絲裂霉素如絲裂霉素C，霉酚酸，諾加霉素，橄欖霉素，培霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑菌素，鏈脲菌素，殺結(jié)核菌素，烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星；抗代謝物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物例如二甲葉酸，甲氨蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱，阿扎胞苷，6-氮尿嘧啶，卡莫氟，阿糖胞苷，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氟尿苷；雄激素如卡普睪酮，丙酸甲雄烷酮，環(huán)硫雄醇，美雄烷，睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥如氨魯米特，米托坦，曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑如糠酸；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋銨；愛波喜龍；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；美登木素生物堿如美坦辛和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；硝氨丙吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼；丙卡巴肼；丙亞胺；根瘤菌素；西佐呋喃；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；單端孢霉烯(特別是T-2毒素，鞣花素A，桿孢菌素A和anguidine)；氨基甲酸乙酯；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；塞替哌；紫杉烷類，例如紫杉醇和多西他賽；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾肖林；替尼泊苷；依達(dá)曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維生素例如視黃酸；卡培他濱；以及任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽，酸或衍生物。還包括用于調(diào)節(jié)或抑制對腫瘤的激素作用的抗激素劑，例如抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬，雷洛昔芬，LY117018，奧那司酮和托瑞米芬(Fareston)；抑制芳香酶(其調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素產(chǎn)生)的芳香酶抑制劑，例如4(5)-咪唑，氨魯米特，乙酸甲地孕酮，依西美坦，福美斯坦，法曲唑，伏羅唑，來曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽，酸或衍生物。

本發(fā)明的組合療法中的每種治療劑可以單獨(dú)或在藥物(也稱為藥物組合物)中施用，所述藥物包含治療劑和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和稀釋劑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐。

本發(fā)明的組合療法中的每種治療劑可以同時(shí)(即，在相同的藥物中)、并行(即，在以任何順序一個(gè)接一個(gè)地施用的單獨(dú)的藥物中)或以任何順序相繼施用。當(dāng)組合治療中的治療劑是不同劑型(一種藥劑是片劑或膠囊，另一種藥劑是無菌液體)和/或以不同的給藥方案(，例如至少每天施用的化療劑和以更低頻率例如每周一次、每兩周一次或每三周一次施用的生物治療劑)施用時(shí)，相繼施用是特別有用的。

劑量單位可以以mg/kg(即mg/kg體重)或mg/m²表示。mg/m²劑量單位是指以毫克/平方米體表面積表示的量。

在一些情況下，將抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑組合或共配制在單一劑型中。

盡管可以在治療或預(yù)防的整個(gè)期間維持抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑的同時(shí)施用，但是也可以通過隨后單獨(dú)施用一種化合物實(shí)現(xiàn)抗癌活性(例如，在組合治療后，在沒有4-1BB激動(dòng)劑的情況下施用抗CCR4抗體，或者替代地，在組合治療后，在沒有抗CCR4抗體的情況下施用4-1BB激動(dòng)劑)。

在一些實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑在施用抗CCR4抗體之前施用，而在其它實(shí)施方案中，4-1BB激動(dòng)劑在施用抗CCR4抗體之后施用。

在一些實(shí)施方案中，組合治療中的至少一種治療劑使用當(dāng)藥劑用作治療相同癌癥的單一療法時(shí)通常使用的相同劑量方案(劑量，頻率和治療持續(xù)時(shí)間)來施用。在其它實(shí)施方案中，患者在組合治療中接受至少一種治療劑的比當(dāng)藥劑用作單一療法時(shí)的更低的總量，例如較小劑量、較低頻率的劑量和/或較短的治療持續(xù)時(shí)間。

本發(fā)明的組合治療可以在手術(shù)除去腫瘤之前或之后使用，并且可以在放射治療之前、期間或之后使用。

在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的組合治療施用于先前未用生物治療劑或化療劑治療的患者(即，是第一次治療的)。在其它實(shí)施方案中，將組合療法施用給在用生物治療劑或化療劑進(jìn)行預(yù)先治療后未能實(shí)現(xiàn)持續(xù)反應(yīng)的患者(即，是經(jīng)歷了治療的)。

本發(fā)明的組合療法通常用于治療足夠大以通過觸診或通過本領(lǐng)域熟知的成像技術(shù)例如MRI、超聲或CAT掃描發(fā)現(xiàn)的腫瘤。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合治療用于治療尺寸為至少約200mm³，300mm³，400mm³，500mm³，750mm³或高達(dá)1000mm³的晚期腫瘤。

本發(fā)明的組合治療優(yōu)選施用于患有對CCR4表達(dá)測試為陽性的癌癥的人類患者。在一些實(shí)施方案中，在免疫組織化學(xué)(IHC)測定中，使用診斷性抗人CCR4抗體在從患者取出的腫瘤樣品的FFPE或冷凍組織切片上檢測CCR4表達(dá)。通常，患者的醫(yī)生將進(jìn)行診斷測試以在開始用抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑治療之前確定從患者取出的腫瘤組織樣品中的CCR4表達(dá)，但是設(shè)想了醫(yī)生可以在開始治療之后的任何時(shí)間(例如在治療周期完成后)進(jìn)行第一次或隨后的診斷測試。

在一個(gè)實(shí)施方案中，以對于任何治療是常規(guī)的方式來定制劑量方案以適應(yīng)特定患者的病況、反應(yīng)和聯(lián)合治療，并且劑量方案可能需要響應(yīng)于病況的變化和/或鑒于其它臨床條件來調(diào)整。

在一些實(shí)施方案中，為本發(fā)明的組合治療選擇劑量方案(本文中也稱為施用方案)取決于若干因素，包括實(shí)體的血清或組織周轉(zhuǎn)率，癥狀水平，實(shí)體的免疫原性，以及被治療個(gè)體中靶細(xì)胞、組織或器官的可及性。優(yōu)選地，劑量方案使遞送給患者的每種治療劑的量最大化，與可接受的副作用水平一致。因此，組合中每種生物治療劑和化療劑的劑量和給藥頻率部分地取決于特定的治療劑、所治療的癌癥的嚴(yán)重程度和患者特征。選擇適當(dāng)劑量的抗體、細(xì)胞因子和小分子的指導(dǎo)是可獲得的。參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602；Physicians'Desk Reference 2003(Physicians'Desk Reference,57th Ed)；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(November 2002)。合適的劑量方案的確定可以由臨床醫(yī)生例如使用本領(lǐng)域已知或懷疑影響治療或預(yù)測影響治療的參數(shù)或因素進(jìn)行，并且將取決于例如患者的臨床病史(例如，先前的治療)、待治療的癌癥的類型和階段以及在組合治療中對一種或多種治療劑的反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

本發(fā)明的組合療法中的生物治療劑可以通過連續(xù)輸注施用，或以例如每天、每隔一天、每周三次或每周、每兩周、每三周、每月、每兩月一次等的間隔的劑量施用?？偟拿恐軇┝客ǔ橹辽偌s0.05μg/kg，0.2μg/kg，0.5μg/kg，1μg/kg，10μg/kg，100μg/kg，0.2mg/kg，1.0mg/kg，2.0mg/kg，10mg/kg，25mg/kg，50mg/kg體重或更多。參見，例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:133-144。

在采用抗人CCR4 mAb作為組合治療中的抗CCR4抗體的一些實(shí)施方案中，施用方案將包括在整個(gè)治療過程中以約7天(±2天)或14天(±2天)或約21天(±2天)或約30天(±2天)的間隔施用約0.5、1、2、3、5或10mg/kg劑量的抗人CCR4 mAb。

在使用抗人CCR4 mAb作為組合治療中的抗CCR4抗體的一些實(shí)施方案中，施用方案將包括以約0.005mg/kg至約10mg/kg的劑量施用抗人CCR4 mAb，其中患者內(nèi)劑量逐漸上升。在其它遞增劑量實(shí)施方案中，劑量之間的間隔將逐漸縮短，例如第一和第二劑量之間約30天(±2天)，第二和第三劑量之間約14天(±2天)。在某些實(shí)施方案中，對于第二劑量之后的劑量，施用間隔將是約14天(±2天)。在某些實(shí)施方案中，對于第二劑量后的劑量，施用間隔為約7天(±2天)。

在一些實(shí)施方案中，將向受試者靜脈內(nèi)(IV)輸注包含本文所述的任何抗CCR4抗體的藥物。

在一些實(shí)施方案中，組合治療中的抗CCR4抗體是KW-0761，其以選自以下的劑量靜脈內(nèi)施用：約0.5mg/kg Q2W,1mg/kg Q2W,2mg/kg Q2W,3mg/kg Q2W,5mg/kg Q2W,10mg/kg Q2W,1mg/kg Q3W,2mg/kg Q3W,3mg/kg Q3W,5mg/kg Q3W和10mg/kg Q3W。在一些實(shí)施方案中，抗CCR4抗體作為液體藥物施用，其包含在pH 4-7的0.1-50mM檸檬酸鹽緩沖液中的0.01-150mg/mL KW-0761、10-30mg/mL甘氨酸，并且所選藥物劑量通過在約2小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)溶解在200-250mL鹽水中的IV輸注來施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗CCR4抗體作為液體藥物施用，其包含在pH 5.2-5.8的檸檬酸鹽緩沖液中的4mg/mL KW-0761、22.5mg/mL甘氨酸、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，并且所選藥物劑量通過在約2小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)溶解在200-250mL鹽水中的IV輸注來施用。

在一些實(shí)施方案中，組合治療中的抗CCR4抗體是KW-0761，其在液體藥物中以選自下列的劑量施用：0.5mg/kg Q1W,0.5mg/kg Q2W,1mg/kg Q1W,1mg/kg Q2W,2mg/kg Q2W,3mg/kg Q2W,5mg/kg Q2W,10mg/kg Q2W,1mg/kg Q3W,2mg/kg Q3W,3mg/kg Q3W,5mg/kg Q3W和10mg/kg Q3W。在一些實(shí)施方案中，KW-0761作為液體藥物施用，其包含在pH 5.5的10mM組氨酸緩沖液中的25mg/mL KW-0761、7％(w/v)蔗糖、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，并且所選的藥物劑量通過在約30分鐘的時(shí)間段內(nèi)靜脈內(nèi)輸注來施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，KW-0761作為液體藥物施用，其包含在pH 4-7的0.1-50mM檸檬酸鹽緩沖液中的0.01-150mg/mL KW-0761、10-30mg/mL甘氨酸，并且所選擇的藥物劑量通過在約2小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)溶解在200-250mL鹽水中的IV輸注來施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，KW-0761作為液體藥物施用，其包含在pH 5.2-5.8的檸檬酸鹽緩沖液中的4mg/mL KW-0761、22.5mg/mL甘氨酸、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，并且所選的藥物劑量通過溶解在200-250mL鹽水中的IV輸注在約2小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)施用。

在一些實(shí)施方案中，組合治療中的4-1BB激動(dòng)劑是PF-05082566，其在液體藥物中以選自下列的劑量施用：0.24mg/ml Q2W,1.2mg/kg Q2W,2.4mg/kg Q2W,3mg/kg Q2W,5mg/kg Q2W,10mg Q2W,0.24mg/ml Q3W,1.2mg/kg Q3W,2.4mg/kg Q3W,3mg/kg Q3W,5mg/kg Q3W和10mg Q3W，包括等效的固定劑量。在一些實(shí)施方案中，PF-05082566作為液體藥物施用，并且所選劑量的藥物通過IV輸注在約60分鐘的時(shí)間段內(nèi)施用。

KW-0761與PF-05082566組合的最佳劑量可以通過這些藥劑中的一種或兩種的劑量遞增來鑒定。

在一個(gè)實(shí)施方案中，KW-0761以1.0mg/kg Q2W的起始劑量施用，PF-05082566以0.24mg/kg，0.3mg/kg，0.6mg/kg，1.2mg//kg，2.4mg/kg，5mg/kg，10mg/kg或等效的固定劑量Q4W施用。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，KW-0761以0.5mg/kg Q3W的起始劑量施用，PF-05082566以0.3mg/kg，0.6mg/kg，1.2mg/kg，2.4mg/kg，5mg/kg或10mg/kg的起始劑量Q3W施用。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，PF-05082566以0.3mg/kg Q4W的起始劑量施用，并且KW-0761以1mg/kg Q2W的起始劑量施用，并且如果患者對起始劑量組合不耐受，則KW-0761的劑量減少至0.5mg/kg Q2W和/或PF-05082566的劑量減少至0.3mg/kg Q4W。

在一些實(shí)施方案中，以4周的周期施用治療。在一些實(shí)施方案中，在每個(gè)周期的第1天每4周(Q4W)施用PF-05082566。在一些實(shí)施方案中，PF-05082566作為1小時(shí)靜脈內(nèi)(IV)輸注施用。在一些實(shí)施方案中，PF-05082566的起始劑量為1.2mg/kg。

在一些實(shí)施方案中，每周(QW)施用KW-0761進(jìn)行連續(xù)4周(第1、8、15和22天)，隨后每兩周一次施用(第1和15天)，劑量為1mg/kg。在一些實(shí)施方案中，PF-05082566作為1小時(shí)IV輸注施用。

在一些實(shí)施方案中，在其中共同施用藥物的每個(gè)給藥周期的第1天，KW-0761輸注在PF-05082566輸注完成后30分鐘(±10分鐘)并且在抽取PF-05082566后和KW-0761前的PK血樣后開始。

在一些實(shí)施方案中，在第一周期中，每周施用KW-0761作為1小時(shí)靜脈內(nèi)輸注(即，在第1、8、15、22天)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從周期2開始，每2周施用KW-0761(即，在每個(gè)周期的第1天和第15天)。在一些實(shí)施方案中，在第1天，在PF-05082566輸注完成后30分鐘(±10分鐘)并且在抽取PF-05082566后和KW-0761前的藥代動(dòng)力學(xué)血樣后開始KW-0761輸注。

在一些實(shí)施方案中，劑量方案是下表3中所示的劑量組合之一。

表3

在一些實(shí)施方案中，使用研究藥物的治療持續(xù)直到完成24個(gè)月的治療(大約24個(gè)周期)、證實(shí)的疾病進(jìn)展、患者拒絕、不可接受的毒性(無論哪個(gè)首先發(fā)生)，研究可能過早地終止。

在顯著毒性的情況下，給藥可以延遲和/或減少。在一些實(shí)施方案中，劑量修改可以在一個(gè)周期內(nèi)發(fā)生。例如，可以中斷給藥直到足夠的恢復(fù)，并且如果需要，在給定的治療周期期間可以減少給藥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在周期之間修改給藥。例如，當(dāng)新周期應(yīng)該開始時(shí)，下一周期施用可能由于持續(xù)毒性而延遲。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在下一個(gè)周期中改變給藥。例如，在后續(xù)周期中可能需要基于先前周期中經(jīng)歷的毒性減少劑量。在一些實(shí)施方案中，在所有毒性恢復(fù)到本文所述的限度內(nèi)之后，可以恢復(fù)用PF-05082566和/或KW-0761的治療。

在一些實(shí)施方案中，低于前述范圍的下限的劑量水平可能是足夠的，而在其它情況下，可以使用如本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的更大的劑量。

在一些實(shí)施方案中，治療周期從組合治療的第一天開始，持續(xù)3周或4周。在共同施用藥物的治療周期的任何一天，KW-0761 IV輸注優(yōu)選在PF-05082566輸注完成后30分鐘開始?；蛘?，在PF-05082566輸注完成后通過IV輸注施用KW-0761。本發(fā)明還考慮了PF-05082566和KW-0761的同時(shí)IV輸注。

在一些實(shí)施方案中，組合療法優(yōu)選在患者實(shí)現(xiàn)CR后施用至少12周(3個(gè)4周周期或4個(gè)3周周期)，更優(yōu)選至少24周，甚至更優(yōu)選至少2至4周。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用RECIST 1.1版和irRC評估對組合療法的反應(yīng)。腫瘤評估將包括所有已知或疑似的疾病部位。在一個(gè)實(shí)施方案中，成像可包括胸部、腹部和骨盆CT或MRI掃描；腦CT或MRI掃描和骨掃描(如果需要)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用造影劑進(jìn)行CT掃描，除非由于醫(yī)學(xué)原因而禁忌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于在基線處表征每個(gè)被識別和報(bào)告的損傷的相同成像技術(shù)用于以下腫瘤評估。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過在基線處，然后每3個(gè)月以及當(dāng)懷疑有疾病進(jìn)展(例如，癥狀惡化)時(shí)進(jìn)行放射學(xué)腫瘤評估來評估每8周至多1年的治療的抗腫瘤活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在初始反應(yīng)后至少4周進(jìn)行反應(yīng)確認(rèn)(CR/PR)。在一些實(shí)施方案中，從C1D1開始，用于疾病評估的可允許時(shí)間窗口為對于篩選的至多-7天(即，篩選時(shí)間窗口為登記之前至多35天)和對于治療的±7天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，時(shí)間選擇遵循日歷日，并且不應(yīng)針對周期開始中的延遲進(jìn)行調(diào)整。

在一些實(shí)施方案中，選擇用本發(fā)明的組合療法治療的患者已被診斷為晚期實(shí)體惡性腫瘤。優(yōu)選地，患者沒有接受晚期腫瘤的先前全身治療。

本發(fā)明還提供了包含如上所述的抗CCR4抗體和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物。當(dāng)抗CCR4抗體是生物治療劑(例如mAb)時(shí)，可以使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和回收/純化技術(shù)在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生拮抗劑。

在一些實(shí)施方案中，包含抗CCR4抗體作為抗CCR4抗體的藥物可以作為液體制劑提供或通過在使用前用無菌注射用水重構(gòu)凍干粉末來制備。在一些實(shí)施方案中，在包含約50mg KW-0761的玻璃小瓶中提供包含KW-0761的藥物。

本發(fā)明還提供了包含4-1BB激發(fā)型抗體和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物。4-1BB激發(fā)型抗體可以如美國專利號8,337,850中所述制備。

在一些實(shí)施方案中，4-1BB激發(fā)型抗體可以以10mg/mL的濃度配制以允許靜脈內(nèi)(IV)。商業(yè)制劑可以包含pH5.5的具有α,α-海藻糖二水合物、乙二胺四乙酸二鈉二水合物和聚山梨醇酯80的L-組氨酸緩沖液。

本文所述的抗CCR4和4-1BB藥物可以作為試劑盒提供，所述試劑盒包括第一容器和第二容器以及包裝插頁。第一容器含有至少一個(gè)劑量的包含抗CCR4抗體的藥物，第二容器含有至少一個(gè)劑量的包含4-1BB激動(dòng)劑的藥物，以及包裝插頁或標(biāo)簽(其包括用于使用藥物治療患者的癌癥的說明書)。第一和第二容器可以包括相同或不同的形狀(例如，小瓶，注射器和瓶)和/或材料(例如塑料或玻璃)。試劑盒可以進(jìn)一步包含可用于施用藥物的其它材料，例如稀釋劑，過濾器，IV袋和線，針和注射器。在試劑盒的一些實(shí)施方案中，抗CCR4抗體是KW-0761，并且說明書指出，所述藥物旨在用于治療患有對CCR4表達(dá)測試為陽性的癌癥的患者。

本發(fā)明的這些和其它方面，包括下面列出的示例性具體實(shí)施方案，根據(jù)本文所包含的教導(dǎo)將是明顯的。

本發(fā)明的示例性具體實(shí)施方案

1.一種治療個(gè)體中的癌癥的方法，包括向所述個(gè)體施用包含抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑的組合療法。

2.包含抗CCR4抗體的藥物，用于與4-1BB激動(dòng)劑組合用于治療個(gè)體中的癌癥。

3.包含4-1BB激動(dòng)劑的藥物，用于與抗CCR4抗體組合用于治療個(gè)體中的癌癥。

4.實(shí)施方案3或4的藥物，其還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。

5.抗CCR4抗體在制備用于當(dāng)與4-1BB激動(dòng)劑組合施用時(shí)治療個(gè)體中的癌癥的藥物中的用途。

6.4-1BB激動(dòng)劑化合物在制備用于當(dāng)與抗CCR4抗體組合施用時(shí)治療個(gè)體中的癌癥的藥物中的用途。

7.抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑在制備用于治療個(gè)體中的癌癥的藥物中的用途。

8.一種試劑盒，其包括第一容器、第二容器和包裝插頁，其中所述第一容器包含至少一個(gè)劑量的包含抗CCR4抗體的藥物，所述第二容器包含至少一個(gè)劑量的包含4-1BB激動(dòng)劑的藥物，并且所述包裝插頁包含用于使用所述藥物治療個(gè)體的癌癥的說明書。

9.根據(jù)實(shí)施方案8所述的試劑盒，其中所述說明書指出，所述藥物旨在用于治療具有對CCR4表達(dá)測試為陽性(通過例如免疫組織化學(xué)(IHC)測定)的癌癥的個(gè)體。

10.實(shí)施方案1至9中任一項(xiàng)的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述個(gè)體是人，并且所述抗CCR4抗體是特異性結(jié)合人CCR4并耗竭CD4⁺細(xì)胞的單克隆抗體。

11.實(shí)施方案9的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體是KW-0761或huCCR4。

12.實(shí)施方案1至9中任一項(xiàng)的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述個(gè)體是人，并且所述抗CCR4抗體是特異性結(jié)合人CCR4的單克隆抗體。

13.實(shí)施方案12的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體耗竭CD4⁺細(xì)胞。

14.實(shí)施方案13的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含：(a)SEQ ID NO：1、2和3的輕鏈CDR和SEQ ID NO：4、5和6的重鏈CDR；或(b)SEQ ID NO：7、8和9的輕鏈CDR和SEQ ID NO：10、11和12的重鏈CDR。

15.實(shí)施方案13的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ ID NO：7、8和9的輕鏈CDR和SEQ ID NO：10，11和12的重鏈CDR。

16.實(shí)施方案13的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體包含重鏈和輕鏈，并且其中所述重鏈包含SEQ ID NO：15，所述輕鏈包含SEQ ID NO：16。

17.實(shí)施方案13的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，并且其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO：17，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO：18。

18.實(shí)施方案10-17中任一項(xiàng)的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述癌癥是實(shí)體瘤。

19.實(shí)施方案10-17中任一項(xiàng)的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述癌癥是膀胱癌，乳腺癌，透明細(xì)胞腎癌，頭/頸鱗狀細(xì)胞癌，直腸癌，肺鱗狀細(xì)胞癌，惡性黑素瘤，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，腎細(xì)胞癌，小細(xì)胞肺癌(SCLC)或三陰性乳腺癌。

20.實(shí)施方案10-17中任一項(xiàng)的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述個(gè)體先前未曾針對晚期實(shí)體惡性腫瘤進(jìn)行治療。

21.實(shí)施方案10-17中任一項(xiàng)的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述癌癥是急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，慢性成淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，慢性髓性白血病(CML)，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)，濾泡性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(HL)，套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)，多發(fā)性骨髓瘤(MM)，骨髓細(xì)胞白血病-1蛋白(Mcl-1)，骨髓增生異常綜合征(MDS)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)。

22.實(shí)施方案10-21中任一個(gè)的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述4-1BB激動(dòng)劑是單克隆抗體，其包含分別地SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的重鏈和輕鏈可變區(qū)。

23.實(shí)施方案10-21的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述4-1BB激動(dòng)劑是單克隆抗體，其包含SEQ ID NO：30、31和32的輕鏈CDR和SEQ ID NO：27、28和29的重鏈CDR。

24.實(shí)施方案10-21的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述4-1BB激動(dòng)劑是包含重鏈和輕鏈的單克隆抗體，并且其中所述重鏈包含SEQ ID NO：21，輕鏈包含SEQ ID NO：22。

25.實(shí)施方案10-22中任一項(xiàng)的方法、藥物、用途或試劑盒，所述癌癥對人CCR4測試為陽性。

26.實(shí)施方案23的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述人CCR4表達(dá)升高。

27.實(shí)施方案14的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體是KW-0761或huCCR4。

28.實(shí)施方案25的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述KW-0761配制為液體藥物，其包含在pH 5.2-5.8的檸檬酸鹽緩沖液中的4mg/mL抗CCR4抗體，22.5mg/mL甘氨酸，0.02％(w/v)聚山梨醇酯80。

29.實(shí)施方案1至26中任一項(xiàng)的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述4-1BB激動(dòng)劑是PF-05082566。

30.實(shí)施方案1至26中任一項(xiàng)的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體以約0.5、1、2、3、5或10mg/kg的劑量施用。

31.實(shí)施方案1至26中任一項(xiàng)的試劑盒的方法、藥物、用途，其中所述抗CCR4抗體是KW-0761，所述4-1BB激動(dòng)劑是PF-05082566，所述個(gè)體被診斷患有晚期惡性實(shí)體瘤，并且抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑的劑量選自下表中的組合之一：

表4

一般方法

分子生物學(xué)中的標(biāo)準(zhǔn)方法描述于Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982&1989第2版,2001第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3^rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)中。標(biāo)準(zhǔn)方法也出現(xiàn)在Ausbel,等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述了在細(xì)菌細(xì)胞中的克隆和DNA誘變(第1卷)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母中的克隆(第2卷)，糖綴合物和蛋白質(zhì)表達(dá)(第3卷)和生物信息學(xué)(第4卷)。

描述了蛋白質(zhì)純化方法，包括免疫沉淀，層析，電泳，離心和結(jié)晶(Coligan,等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述了化學(xué)分析，化學(xué)修飾，翻譯后修飾，融合蛋白的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)的糖基化(參見例如Coligan,等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel,等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和單克隆抗體的生產(chǎn)、純化和片段化(Coligan,等人(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow and Lane，同上)。用于表征配體/受體相互作用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是可獲得的(參見例如Coligan,等人(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New York)。

可以制備單克隆、多克隆和人源化抗體(參見例如Sheperd and Dean(eds.)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann and Dubel(eds.)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow and Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter,等人(2000)J.Immunol.165:6205；He,等人(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；Foote and Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美國專利號6、329、511)。

人源化的替代方案是使用在噬菌體上展示的人抗體文庫或在轉(zhuǎn)基因小鼠中的人抗體文庫(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)Nature Medicine 1:837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom and Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等人(2001)Phage Display:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。

抗原的純化對于產(chǎn)生抗體不是必需的?？梢杂脭y帶目標(biāo)抗原的細(xì)胞免疫動(dòng)物。然后可以從免疫的動(dòng)物中分離脾細(xì)胞，并且脾細(xì)胞可以與骨髓瘤細(xì)胞系融合以產(chǎn)生雜交瘤(參見例如Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290；Wright等人(2000)Immunity 13:233-242；Preston等人,同上；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。

抗體可以綴合至例如小藥物分子、酶、脂質(zhì)體、聚乙二醇(PEG)?？贵w可用于治療、診斷、試劑盒或其它目的，并且包括偶聯(lián)至例如染料、放射性同位素、酶或金屬(例如膠體金)的抗體(參見例如Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing and Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168:883-889)。

用于流式細(xì)胞術(shù)的方法，包括熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，是可獲得的(參見例如Owens,等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,2^nd ed.；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。適用于修飾用于例如作為診斷試劑的核酸(包括核酸引物和探針)、多肽和抗體的熒光試劑是可獲得的(Molecular Probesy(2003)Catalog，Molecular Probes，Inc.，Eugene，-Aldrich(2003)Catalogue，St.Louis，MO)。

描述了免疫系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法(參見例如Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt,等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis,等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。

用于確定例如抗原片段、前導(dǎo)序列、蛋白質(zhì)折疊、功能結(jié)構(gòu)域、糖基化位點(diǎn)和序列比對的軟件包和數(shù)據(jù)庫是可獲得的(參見例如GenBank,VectorSuite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne,等人(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne,等人(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren,等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。

實(shí)施例

實(shí)施例1.組合治療

本實(shí)施例舉例說明了CD4⁺T細(xì)胞耗竭對4-1BB激發(fā)型抗體在動(dòng)物癌癥模型中的抗腫瘤活性的影響。

為了評價(jià)組合免疫治療對建立的B16F10腫瘤的抗腫瘤功效，基于在CT26模型中顯示功效的先前研究選擇抗4-1BB給藥方案(Escuin-Ordinas等人，J Immunother Cancer，2013；1：14)和如先前報(bào)道選擇抗PD-1和抗LAG-3給藥方案(Woo等人，Cancer Research，2012；72：917-27；Curran等人，PloS One.2011；6：e19499)。與公開的結(jié)果一致，當(dāng)這些單一藥劑治療在50-154mm³大小的腫瘤中開始時(shí)，單獨(dú)的抗4-1BB、抗PD-1或抗LAG-3不能一致地抑制B16F10腫瘤生長(數(shù)據(jù)未顯示)。組合抗PD-1與抗LAG-3相對于同種型對照導(dǎo)致54％的腫瘤生長抑制(TGI)(p<0.001)，盡管在該治療后沒有小鼠是無腫瘤的。相比之下，當(dāng)動(dòng)物同時(shí)施用抗4-1BB和抗PD-1抗體時(shí)，相對于同種型對照，產(chǎn)生85％TGI的顯著效力(p<0.0001)，并且10只治療的動(dòng)物中有7只無腫瘤(數(shù)據(jù)未顯示)。這種顯著的組合效力是可重復(fù)的：在不同實(shí)驗(yàn)者的獨(dú)立研究(腫瘤大小在64-209mm³之間)中，組合治療組中的平均腫瘤負(fù)荷降低，2/10只動(dòng)物完全無腫瘤，4/10只動(dòng)物在研究結(jié)束時(shí)具有正在進(jìn)行的部分消退(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，當(dāng)對非常大的腫瘤(大小在126-350mm³之間)進(jìn)行治療時(shí)，僅觀察到抗4-1BB/抗PD-1組合的顯著TGI(相對于對照組為51％，p<0.0001)，而抗PD-1/抗LAG-3組合無效(數(shù)據(jù)未顯示)。

同樣，在MC38結(jié)腸癌模型中觀察到抗4-1BB/抗PD-1組合的強(qiáng)健抗腫瘤效果(數(shù)據(jù)未顯示)。在研究結(jié)束時(shí)(腫瘤植入后第21天)，組合治療的TGI相對于PBS對照為63％。當(dāng)與單一試劑單獨(dú)治療相比時(shí)，抑制也是顯著的(p<0.05相對于單獨(dú)的抗4-1BB，和p<0.001相對于單獨(dú)的抗-PD-1)。

為了測定抗4-1BB/抗-PD-1組合治療所需的免疫細(xì)胞亞群，使用抗體同時(shí)耗竭具有B16F10的小鼠中的CD4⁺T細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞或CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞。在第0天，將C57BL/6小鼠皮下接種1×10⁶B16F10。將小鼠隨機(jī)分成每組10只動(dòng)物的組，平均腫瘤體積為約80mm³(第10天)。如先前所述(Butler等，Nature Immunology，2012；13：188-95)，具有B16F10的小鼠接受抗CD4(GK1.5，BioXcell)和/或抗CD8(53.5.8，BioXcell)。簡言之，在第11、16和21天腹膜內(nèi)施用一百(100)μg同種型對照IgG或抗CD4和/或抗CD8mAb。在第12、17和22天給予抗4-1BB(1mg/kg)/抗PD-1(10mg/kg)mAb。每周2-3次測量腫瘤尺寸。

比較抗4-1BB激發(fā)型抗體+抗-PD-1拮抗型抗體組合治療后的腫瘤生長(圖9)。每個(gè)治療組的平均值±SEM顯示于圖9中。在不存在CD8⁺T細(xì)胞時(shí)，腫瘤抑制完全消除。有趣的是，CD4⁺T細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致增強(qiáng)的抗腫瘤活性(p<0.05，相對于抗4-1BB/抗PD-1組)。這些數(shù)據(jù)表明Treg細(xì)胞耗竭增強(qiáng)4-1BB激動(dòng)劑的抗腫瘤活性。

在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，評估了在CT26結(jié)腸腫瘤模型中CD4⁺T細(xì)胞耗盡對抗4-1BB/抗PD-1組合治療的影響(圖10)。在不存在CD8⁺T細(xì)胞的情況下，腫瘤抑制被完全消除。如在B16黑素瘤模型中的，CD4⁺T細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致增強(qiáng)的抗腫瘤活性。

這些結(jié)果證明4-1BB激發(fā)型抗體的抗腫瘤活性可以通過腫瘤模型中Treg細(xì)胞或CD4⁺T細(xì)胞的耗竭來增強(qiáng)。

材料和方法

小鼠。6至8周齡的雌性C57BL/6小鼠購自The Jackson Laboratories。根據(jù)由Institutional Animal Care and Use Committee of Rinat,South San Francisco和Worldwide Research and Development(WRD),La Jolla,Pfizer Inc.批準(zhǔn)的方案批準(zhǔn)的方案維持小鼠和進(jìn)行所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞系。B16F10黑素瘤細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。MC38結(jié)腸癌細(xì)胞系由UCLA,Los Angeles,California的Antoni Ribas博士友情提供。在37℃，在5％CO₂的空氣氛圍中，在補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并在Research Animal Diagnostic Laboratory(RADIL)(Columbia，MO)進(jìn)行測試病原體的IMPACT。收獲在指數(shù)生長期生長的無病原體細(xì)胞并用于腫瘤接種。

用于免疫治療和流式細(xì)胞術(shù)的抗體。治療性大鼠抗小鼠4-1BB mAb(克隆MAB9371)購自R&D systems。大鼠抗小鼠PD-1mAb(克隆RMP1-14)和大鼠IgG2a同種型對照購自BioXcell。大鼠抗小鼠LAG-3 mAb(克隆eBioC9B7W)購自eBioscience。

用于細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)染色的單克隆抗體購自BD Biosciences或eBioscience。用于表征T細(xì)胞的單克隆抗體是倉鼠抗小鼠CD3ε-Alexa Fluor 488(克隆145-2C11)，大鼠抗小鼠CD4-PerCP-Cy5.5(克隆RM4-5)，大鼠抗小鼠CD8α-APC-H7(克隆53-6.7)，大鼠抗小鼠CD25-BD Horizon V450(克隆PC61)，倉鼠抗小鼠CD137(4-1BB)-APC(克隆17B5)，倉鼠抗小鼠CD279(PD-1)-BD Horizon PE-CF594(克隆J43)，大鼠抗小鼠FoxP3-Alexa Fluor 700(克隆FJK-16s)，大鼠抗小鼠Eomes-PE(克隆：Dan11mag)，倉鼠抗小鼠KLRG1-PerCP-Cy5.5(克隆2F1)和大鼠抗小鼠NK-1.1-PE-Cy7(克隆PK136)。對于MDSC表征，mAb是大鼠抗小鼠CD45-APC-Cy7(克隆30-F11)，大鼠抗小鼠CD11b-Alexa Fluor 488(克隆M1/70)，大鼠抗小鼠Ly-6G(Gr-1)-PerCP-花青5.5(克隆RB6-8C5)和大鼠抗小鼠F4/80-PE(克隆BM8)。使用LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain試劑盒(Invitrogen)將活細(xì)胞與死細(xì)胞分離。

使用流式細(xì)胞術(shù)的免疫細(xì)胞分型。收獲來自荷瘤小鼠的脾，并在冰冷的PBS中機(jī)械解離為單細(xì)胞懸浮液。脾細(xì)胞用紅血細(xì)胞裂解緩沖液Hybri-Max(Sigma-Aldrich)處理以除去紅血細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，并重懸浮于補(bǔ)充有2％FBS和0.9％NaN₃的PBS中。將～1×10⁶個(gè)脾細(xì)胞的等分試樣與10μg/mL的小鼠BD Fc Block(BD Biosciences)預(yù)溫育10分鐘，之后加入分型mAb混合物以特異性染色免疫細(xì)胞。

使用小鼠腫瘤解離試劑盒和GentleMACS Dissociator根據(jù)制造商的說明(Miltenyi Biotec)制備腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞。

通過在4℃孵育細(xì)胞30分鐘來標(biāo)記細(xì)胞表面抗原。使用根據(jù)制造商的方案(eBioscience)設(shè)定的FoxP3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。使用LSR Fortessa(BD Biosciences)獲得流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)并使用FlowJo(TreeStar Inc.)分析。

體內(nèi)腫瘤功效研究。C57BL/6小鼠在右側(cè)皮下接種在0.1ml無血清DMEM培養(yǎng)基或PBS中的1×10⁶個(gè)B16F10或MC38細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到50-154mm³的尺寸時(shí)開始治療。單獨(dú)或組合的針對4-1BB(1mg/kg)、PD-1(10mg/kg)和LAG-3(10mg/kg)的抗體腹膜內(nèi)(i.p.)施用兩次，間隔5天。在治療較大腫瘤(范圍為126-350mm³)的研究中，腹膜內(nèi)給予抗體四次，間隔為3天。使用測徑器在二維中測量腫瘤大小，并且使用下式以mm³表示體積：V＝0.5L×W²其中L和W分別是腫瘤的長徑和短徑。

實(shí)施例2.基因表達(dá)分析：在人腫瘤中分析與FOXP3 mRNA相關(guān)的人基因

本實(shí)施例舉例說明人腫瘤中CCR4 mRNA與FOXP3 mRNA的相關(guān)性。

分析來自癌癥基因組集(TCGA)的RNA-Seq數(shù)據(jù)以鑒定人腫瘤中人基因和FOXP3 mRNA之間的相關(guān)性。下表5提供了人基因的列表，其按照在三種腫瘤類型中其與FOXP3 mRNA(腫瘤RNAseq數(shù)據(jù))的平均相關(guān)系數(shù)的順序列出。更高的相關(guān)系數(shù)值表明在耗竭Treg中潛在更高的功效。黑體表示的基因是與活化的Treg細(xì)胞相關(guān)的公知基因。

基于來自TCGA的跨多個(gè)實(shí)體腫瘤RNA-Seq數(shù)據(jù)的與FOXP3的相關(guān)性分析，CCR4被鑒定為用于耗竭Treg細(xì)胞的有吸引力的靶標(biāo)。CCR4在HNSC腫瘤、結(jié)腸腫瘤和直腸腫瘤中分別具有0.857、0.837和0.856的相對高的FOXP3相關(guān)系數(shù)值(表5)。在本研究中鑒定的用于耗竭Treg細(xì)胞的其它靶包括：CCR8,ICOS,TIGIT,CD4,CD28,ARHGEF6,IKZF1,PTPRC,DOCK2,CCR4,CCR5,IL21R,IL2RB,NCKAP1L,SLAMF1,ITGAL,IL10RA,P2RY10,IL2RA,FMNL1,DOCK10,ITK,SASH3,KIAA0748,LCP2,TNFRSF9(4-1BB,CD137),CYBB和CTLA4。

表5

實(shí)施例3.基因表達(dá)分析：適用于抗CCR4抗體的治療的癌癥類型的鑒定

本實(shí)施例舉例說明了人類腫瘤中人基因mRNA和FOXP3 mRNA的相關(guān)性。

分析來自癌癥基因組集(TCGA)的RNA-Seq數(shù)據(jù)以鑒定人腫瘤中CCR4 mRNA與FOXP3 mRNA以及CTLA4 mRNA與FOXP3 mRNA之間的相關(guān)性。下表6提供了在TCGA中可獲得的所有腫瘤類型中的相關(guān)系數(shù)。

基于該分析，指示用抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑治療的癌癥類型包括：頭/頸鱗狀細(xì)胞癌，直腸癌，結(jié)腸癌，鱗狀細(xì)胞肺癌，甲狀腺癌，膀胱癌，黑素瘤，宮頸癌，前列腺癌，乳腺癌，子宮/子宮內(nèi)膜癌，胰腺癌，肺腺癌，卵巢癌和乳頭狀腎癌。

表6

實(shí)施例4.將抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑并行施用至荷瘤小鼠。

本實(shí)施例舉例說明在動(dòng)物癌癥模型中與4-1BB激動(dòng)劑組合的抗CCR4抗體治療。

在一項(xiàng)研究中，C57BL6小鼠皮下植入1×10⁶個(gè)MC38鼠結(jié)腸癌細(xì)胞。監(jiān)測腫瘤生長，當(dāng)腫瘤達(dá)到150mm³的平均大小將動(dòng)物隨機(jī)化至4個(gè)8只動(dòng)物的組，并且腹膜內(nèi)給予同種型對照、1mg/kg大鼠抗小鼠4-1BB激發(fā)型單克隆抗體(R&D Systems#MAB9371)、10mg/kg抗小鼠CCR4抗體或兩者的同時(shí)組合，每5天一次，共兩次劑量。使用卡尺在兩個(gè)維度上測量腫瘤大小，并且使用下式以mm³表示體積：V＝0.5L×W²其中L和W分別是腫瘤的長徑和短徑。當(dāng)對照的腫瘤大小達(dá)到1000mm³時(shí)，終止研究。通過比較用4-1BB激發(fā)型單克隆抗體、抗小鼠CCR4抗體或兩者的同時(shí)組合治療的動(dòng)物來評價(jià)組合治療的功效。

實(shí)施例5.優(yōu)先指示：追求患者選擇策略

本實(shí)施例舉例說明了用于抗CCR4抗體/4-1BB激動(dòng)劑組合治療的患者選擇的策略。

抗CCR4治療耗竭抑制抗腫瘤反應(yīng)的Treg。4-1BB擴(kuò)大抗腫瘤T細(xì)胞活性?；谏鲜鰧?shí)施例1證明的效果，抗CCR4抗體與4-1BB激動(dòng)劑組合將導(dǎo)致比單一藥劑更強(qiáng)的反應(yīng)。

這些研究優(yōu)先考慮具有高Treg(FOXP3+)含量的腫瘤。通過在配對的給藥前和給藥后新鮮活檢中評估腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)來選擇患者。進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析以確定腫瘤浸潤性T細(xì)胞位置和活化狀態(tài)。在基線和治療后評估4-1BB/CCR4比率。平行評估CD4、CD8、FoxP3、PD-1和PD-L1。

表7提供了序列表中的序列的簡要描述。

表7

實(shí)施例6.組合治療

本實(shí)施例舉例說明了使用抗CCR4抗體/4-1BB激動(dòng)劑的組合治療。

在每個(gè)周期的第1天，PF-05082566將作為1小時(shí)靜脈內(nèi)(IV)輸注每4周(Q4W)施用。PF-05082566的起始劑量為1.2mg/kg。

KW-0761將作為1小時(shí)IV輸注每周(QW)施用，進(jìn)行連續(xù)4周(第1、8、15和22天)，隨后每兩周一次給藥(第1和15天)，劑量為1mg/kg。

在其中共同施用藥物的每個(gè)給藥周期的第1天，KW-0761輸注將在PF-05082566輸注完成后30分鐘(±10分鐘)并且在抽取PF-05082566后和KW-0761前PK血液樣品后開始。

本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用并入，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的出版物、數(shù)據(jù)庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請或?qū)＠痪唧w地和單獨(dú)地指明通過引用并入。根據(jù)37C.F.R.§1.57(b)(1)，申請人旨在將此通過引用并入的聲明涉及每一個(gè)單獨(dú)的出版物、數(shù)據(jù)庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請或?qū)＠?，其每一個(gè)都按照37C.F.R.§1.57(b)(2)清楚指出，即使這種引用與通過引用并入的專門聲明不直接相鄰。在說明書中包括通過引用并入的專門聲明(如果有的話)不以任何方式削弱通過引用并入的該一般聲明。本文引用的參考文獻(xiàn)不意在承認(rèn)該參考文獻(xiàn)是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，也不構(gòu)成對這些出版物或文獻(xiàn)的內(nèi)容或日期的任何承認(rèn)。

序列

<110> PFIZER INC.

KYOWA HAKKO KIRIN, CO., LTD.

<120> 用于治療癌癥的抗CCR4抗體和4-1BB激動(dòng)劑的組合

<130> PC72128A

<150> 62/001,534

<151> 2014-05-21

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 1

Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 2

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 3

Phe Gln Gly Ser Leu Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 4

Asn Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 5

Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 6

His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 7

Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 8

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 9

His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 10

Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 11

Trp Ile Asn Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 12

Ser Thr Tyr Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr

1 5

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 14

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 16

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 16

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile

20 25 30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 17

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 18

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile

20 25 30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 20

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu

85 90 95

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 21

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

340 345 350

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 22

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 22

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu

85 90 95

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 23

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 24

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 24

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 25

<211> 360

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr

1 5 10 15

Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu

20 25 30

Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu

35 40 45

Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu

50 55 60

Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn

65 70 75 80

Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly

85 90 95

Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met

100 105 110

Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val

115 120 125

Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe

130 135 140

Ser Leu Arg Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ala

145 150 155 160

Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe Ser

165 170 175

Thr Cys Tyr Thr Glu Arg Asn His Thr Tyr Cys Lys Thr Lys Tyr Ser

180 185 190

Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile

195 200 205

Leu Gly Leu Val Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met

210 215 220

Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala

225 230 235 240

Val Lys Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr

245 250 255

Pro Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val

260 265 270

Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala

275 280 285

Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Ile Tyr

290 295 300

Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Leu Gln Leu Phe Lys

305 310 315 320

Thr Cys Arg Gly Leu Phe Val Leu Cys Gln Tyr Cys Gly Leu Leu Gln

325 330 335

Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met

340 345 350

Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu

355 360

<210> 26

<211> 255

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245 250 255

<210> 27

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 27

Ser Thr Tyr Trp Ile Ser

1 5

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 28

Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>合成的構(gòu)建體

<400>29

Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr

1 5

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 30

Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His

1 5 10

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 31

Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 32

Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val

1 5 10