本發(fā)明涉及一種骨髓蛋白質和多肽的超濾膜制備方法及其應用，是利用新疆資源豐富的骨骼為原料制備的具有抗菌活性的蛋白質，具有抗細菌、抗真菌等生物活性，在醫(yī)藥、食品領域具有很好的應用前景。

背景技術：

我國是個畜禽消費大國，但多集中于畜禽肉類的消費"大量的畜禽骨骼得不到利用"既浪費了這種營養(yǎng)成分豐富且比例合理的資源"又在骨處理的問題上污染了環(huán)境"造成一定的環(huán)境壓力。

畜禽骨骼中蛋白質的利用，骨蛋白，骨中的蛋白質含量很高"且屬較為全價的可溶性蛋白質"生物價高我國的蛋白質資源一直比較緊張"這種資源的開發(fā)利用對緩解我，

畜禽骨骼由骨膜，骨質，骨髓構成，是蛋白質和鈣質組成的網狀結構"再構成管狀"管內充滿了含多種營養(yǎng)物質的骨髓，如構成腦組織的磷脂及防止老化的骨膠原，軟骨素等，鮮骨中含有蛋白質，脂肪，礦物質，如鈣，磷，鐵等，骨膠原，軟骨素以及維生素等，尤其是的鈣磷比非常接近人體鈣吸收的最佳比例"是理想的天然鈣源，

骨髓是動物器官中十分重要的一個部分，造血干細胞就由骨髓供應，俗話說骨髓補血，骨髓不僅味道好，營養(yǎng)價值確實不錯。尤其是骨髓化到湯里后變白的湯最有營養(yǎng)，最香,是動物當中最有營養(yǎng)的動物的骨頭中含有多種對人體有營養(yǎng)、滋補和保健功能的物質，具有添骨髓、增血液、減緩衰老、延年益壽的保健功效。

動物骨髓中富含有利于智力發(fā)育的磷脂質、磷蛋白等，骨頭中含有豐富的鈣質，都是很有營養(yǎng)的食物，一般人都可以食用，骨髓中脂肪含量較高，肥胖、高脂血癥等病人不宜過多食用。骨頭中的鈣需要長時間的熬制，使鈣質充分溶出，才容易被人體利用；

化學成份：牛髓每100g含水3g，蛋白質0.5g，脂肪95.8g，灰分0.3g，硫胺素(thiamine)微量，核黃素(riboflavine)0.01mg，煙酸(nicotinic acid)0.05mg。其脂肪酸含率如次：月桂酸(lauricacid)0.1％，肉豆蔻酸(myristicacid)2.6％，棕櫚酸(cetylic acid)32.3％，硬脂酸(stearic acid)15.5％，十四(碳)烯酸(tetradecenicacid)0.7％，十六(碳)烯酸(hexadecenicacid)3.0％，油酸(oleic acid)43.2％，亞油酸(linoleic acid)2.6％，不皂化物0.5-0.6％。

目前，我國還沒有利用超濾膜回收骨髓中蛋白質資源中有效方法，因此建立高效，低成本，綠色的回收蛋白質的方法很必要；

本發(fā)明通過研究發(fā)現，骨髓中含有豐富的蛋白質和多肽類成分，根據來源蛋白質含量有差異，平均含量可以達到2-5％。我區(qū)畜牧業(yè)總產值達到318.37億元，占農業(yè)產值的24.5％，低于全國平均水平。主要畜產品產量快速增長，2009年畜產品總量達到305.15萬t。肉類總產量達到115.4萬t，占到畜產品總量的43.7％，肉類人均占有量居全國第17位，其中羊肉人均占有量居全國第3位，牛肉人均占有量居全國第3位。奶類產量125.24萬t，占到畜產品總量的47.5％，人均占有量居全國第6位。蛋類產量23.2萬t，占到畜產品總量的8.8％。禽肉產量8.1萬t，占到畜產品總量的3.0％。反應出新疆羊肉、牛肉和奶業(yè)依然是畜產品中競爭力比較強的主要產品。

將新疆、內蒙古、西藏、青海、甘肅五大牧業(yè)省區(qū)主要畜產品產量數據經過計算取得相關比較參數，即可得到各省區(qū)主要畜產品競爭力的比較值。新疆主要畜產品競爭力(參數)由強到弱的排序為：羊肉(5.93176)—牛肉(2.12851)—奶類(1.76865)—禽肉(0.26783)—豬肉(0.23718)—禽蛋(0.12540)。我國是個畜禽消費大國，但多集中于畜禽肉類的消費"大量的畜禽骨骼得不到利用"既浪費了這種營養(yǎng)成分豐富且比例合理的資源"又在骨處理的問題上污染了環(huán)境"造成一定的環(huán)境壓力。

因此，提取回收骨髓中的蛋白質和多肽，結合這個特色豐富的營養(yǎng)成分開發(fā)具有抗微生物功能的多肽粉是很有現實意義。

膜分離技術是一門建立在高分子材料學基礎上的新興邊緣學科。由于分離過程中不受熱，無相態(tài)和化學變化，兼有過程簡單、易于自動化控制等特性，已廣泛應用于金屬、紡織、制革、造紙、化工、食品、生化、醫(yī)藥、保健、水處理和國防等工業(yè)，成為當今分離科學中最重要的手段之一。膜分離是一種利用天然或人工合成的，具有選擇透過性的高分子薄膜，借助不同的推動力，在膜相際之間進行傳質，以達到不同組分的分離、分級、提純和濃縮的技術。膜分離過程根據推動力的不同，大體可分為兩類。一類是以壓力為推動力的膜進程，如超濾；另一類是以電力為推動力的膜進程，在乳品工業(yè)領域，主要應用的是以壓力為推動力的膜分離過程。以壓力為推動力的膜分離過程，根據膜對不同組分的截留能力可以分為：反滲透(RO)、納米過濾(NF)、超濾(UF)、微濾(MF)。根據分離物的大小可選用不同孔徑或截留分子量的膜。

本發(fā)明建立利用現代綠色膜分離工藝技術分離純化，并通過噴霧干燥實現產業(yè)化生產和應用；該骨髓蛋白質是由肉類加工企業(yè)生產中產生的骨頭廢料為原料，利用綠色環(huán)保膜分離和噴霧干燥技術相結合，經過獨特的工藝精制而成的天然蛋白質。

技術實現要素：

本發(fā)明目的在于，提供一種骨髓蛋白質和多肽的超濾膜制備方法及其應用，該方法以牛、羊、馬、駱駝或其它動物屠宰場的動物骨骼里面的新鮮骨髓為原料，采用骨髓與骨頭分類，清水清理、液氮冷凍粉粹得到骨髓粉，利用溫水溶液提取，油脂成分充分脫脂，再利用現代超濾膜技術制備了截留分子量為10KDa的蛋白質，再利用現代噴霧干燥技術或冷凍干燥精制而成。該骨髓蛋白質被驗證其抗細菌和真菌活性，不但是具有廣泛的抗微生物活性，同時具有增強體液免疫及全身免疫的功能，富含人體易消化和吸收的純天然植物來源多肽和蛋白質。該蛋白質的特點是既保留了骨髓原有的蛋白質的同時還實現變廢為寶和資源充分利用的目的；該蛋白質作為天然抗菌劑、食品添劑或藥物，可用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。

本發(fā)明所述的一種骨髓蛋白質和多肽的超濾膜制備方法，該方法以牛、羊、馬、駱駝或其它動物屠宰場的動物骨骼里面的新鮮骨髓為原料，具體操作按下列步驟進行：

a、取新鮮骨髓100g，清洗3次，去掉骨頭砸碎和血跡，切碎小分塊，按重量比為1:5加入液氮粉碎，反復粉碎3-4次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、將步驟a中清洗好的骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸餾水，置磁力攪拌器上提取3-4小時，溫度30-40℃，每次提取2-3次，減壓抽濾，合并提取液，分離雜物，得到提取液備用；

c、將步驟b得到的提取液，置溫度4℃過夜，使油水層分離，取出上層油層，將下層提取層置分液漏斗，按料液體積比為1:5加入石油醚或正己烷，不停搖進行脫脂，靜止3-5h至上層未見無油狀物，得到脫脂的粗提液；

d、將步驟c得到的粗提液，濃縮，并在12000轉/分下，溫度4℃離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白提取液；

e、將步驟d得到的骨髓蛋白粗提取液，采用截留分子量為10KDa的再生纖維素平板膜，在壓力0.10MPa，溫度25℃，流速35m/s，進行大分子和小分子成分的分離和濃縮，將骨髓蛋白質滯留和滲透液分別收集，得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液；

f、將步驟e得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液，分別利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3-5倍，依次離心，上清液噴霧干燥或冷凍干燥，過篩，紫外滅菌，包裝，即可得到分別為10KD載留蛋白部分骨髓蛋白質和10KD濾過多肽部分。

所述方法獲得的骨髓蛋白質在制備抗細菌生物活性的藥物中的用途。

所述方法獲得的骨髓蛋白質在制備抗真菌生物活性的食品中的用途。

所述方法獲得的骨髓蛋白質在制備食品添加劑中的用途。

本發(fā)明所述的一種骨髓蛋白質和多肽的超濾膜制備方法及其應用，該方法中的原料為肉類加工企業(yè)或畜牧屠宰場產生的骨頭廢料，采用水清洗前處理之后的新鮮骨髓利用蒸餾水水浴水攪拌提取，其中的脂質成分利用石油醚或正己烷萃取其沒有脂質成分在水溶部分，適當濃縮、離心，其上清液用采用截留分子量為10KDa的再生纖維素平板膜分離，其滯留和滲透溶液分別濃縮，并利用現代噴霧干燥技術或冷凍干燥精制而成的骨髓蛋白質與多肽粉；骨髓蛋白質與多肽粉的成分利用液質聯用(LC/MS)儀器驗證證實，其含有分10KDa截留蛋白部分分子量為11382.83、11448.82、12664.58、15063.90、15064.11、18997.11；10KDa濾過多肽部分分子量為1718.20、2037.50、2066.45、2108.59、2140.07 2454.12、2570.24、2586.26、2673.65、3110.94、3111.95、3118.87、4222.14、4223.14、4289.27、6290.66、6504.00、6589.84、7787.93、8685.97、9285.85；該骨髓蛋白質被驗證其抗細菌和真菌活性，具有廣泛的抗微生物活性，同時具有增強體液免疫及全身免疫的功能，富含人體易消化和吸收的純天然來源多肽和蛋白質。其蛋白質和多肽純度高、生物活性強，而且提取方法簡單可行，提取全程在低溫環(huán)境下操作，更好的保留了骨髓提取物的活性成分，該蛋白粉部位的特點是既保留了骨髓蛋白質營養(yǎng)的同時還實現變廢為寶和資源充分利用的目的；該骨髓蛋白質與多肽粉作為天然抗菌劑，可應用于作為治療或預防各種骨科病相關的藥物或保健品的制備原料，可用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明BCA法測定蛋白質濃度的標準曲線，其中方程式為：y＝247.22x²+427.9x-91.604，相關系數為0.9989。

圖2為本發(fā)明蛋白質濃度測定結果對比圖，其中1為水作為提取液的骨髓蛋白、2為骨髓液氮冷凍研磨水提的蛋白、3為液氮研磨水提超濾膜分離10KD以上部分、4為液氮研磨水提超濾膜分離10KDa以下部分。

圖3為本發(fā)明聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)-考馬斯亮藍染色圖，其中1為水作為提取液的骨髓蛋白、2為骨髓液氮研磨水提的骨髓蛋白。

圖4為本發(fā)明聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)-考馬斯亮藍染色圖，其中1為液氮研磨水提超濾膜10KDa載留部分、2為液氮研磨水提超濾膜分離10KDa濾過部分。

圖5為本發(fā)明提取的四種蛋白質與多肽抑菌活性對比圖，其中—◆—系列1中，1為水作為提取液的骨髓蛋白、2為骨髓液氮研磨水提的骨髓蛋白、3為液氮研磨水提超濾膜10KDa載留部分、4為液氮研磨水提超濾膜分離10KDa濾過部分對白色念球菌的抑止活性；—■—系列2中，1為水作為提取液的骨髓蛋白、2為骨髓液氮研磨水提的骨髓蛋白、3為液氮研磨水提超濾膜10KDa載留部分、4為液氮研磨水提超濾膜分離10KDa濾過部分對大腸桿菌的抑止活性。

圖6為本發(fā)明10KDa載留部分液質聯用(LC/MS)圖譜。

圖7為本發(fā)明10KDa濾過部分液質聯用(LC/MS)圖譜。

具體實施方式

實施例1

a、取新鮮骨髓100g，清洗3次，去掉骨頭砸碎和血跡，預冷，切碎小分塊，按重量比為1:5加入液氮粉碎，反復粉碎3-4次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、將步驟a粉碎好好的骨髓樣品中加入重量比1:10的蒸餾水，置磁力攪拌器上提取2小時，溫度30℃，每次提取2次，減壓抽濾，合并提取液，分離雜物，得到提取液備用；

c、將步驟b得到的提取液，置溫度4℃過夜，使油水層分離，取出上層油層，將下層提取層置分液漏斗，按料液體積比為1∶5加入石油醚，不停搖進行脫脂，靜止3h至上層未見油狀物，得到脫脂的粗提取液；

d、將步驟c得到的粗提取液，在12000轉/分下,溫度4℃離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白粗提取液；

e、將步驟d得到的骨髓蛋白粗提取液，采用截留分子量為10KDa的再生纖維素平板膜，在壓力0.10MPa，溫度25℃，流速35m/s，進行大分子和小分子成分的分離和濃縮，將骨髓蛋白質滯留和滲透液分別收集，得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液；

f、將步驟e得到的10KD載留蛋白質液和10KD濾過液，分別利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3-5倍，依次離心，上清液噴霧干燥，過篩，紫外滅菌，包裝，得到10KD載留骨髓蛋白粉(0.96g)和10KD濾過多肽部分(0.28g)，骨髓活性蛋白提取率為48％，多肽提取率14％。

實施例2

a、取新鮮骨髓100g，清洗3次，使去掉骨頭砸碎和血跡，切碎小分塊，按重量比為1:5加入液氮粉碎，反復粉碎3-4次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、將步驟a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸餾水，置磁力攪拌器上提取4小時，溫度40℃，每次提取3次，減壓抽濾，合并提取液，分離雜物，得到提取液備用；

c、將步驟b得到的提取液，置溫度4℃過夜，使油水層分離，取出上層油層，將下層提取層置分液漏斗，按料液體積比為1∶5加入正己烷，不停搖進行脫脂，靜止5h至上層未見無油狀物，得到脫脂的粗提取液；

d、將步驟c得到的粗提取液，在12000轉/分下，溫度4℃離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白粗提取液；

e、將步驟d得到的骨髓蛋白粗提取液，采用截留分子量為10KDa的再生纖維素平板膜，在壓力0.10MPa，溫度25℃，流速35m/s，進行大分子和小分子成分的分離和濃縮，將骨髓蛋白質滯留和滲透液分別收集，得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液；

f、將步驟e得到骨髓蛋白質滯留和滲透液兩種10KD載留和10KD濾過部分，分別利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3-5倍，依次離心，上清液噴霧干燥或冷凍干燥，過篩，紫外滅菌，包裝，分別得到10KD載留骨髓蛋白粉(1.14g)和10KD濾過多肽部分(0.40g)，骨髓活性蛋白提取率為57％，多肽提取率為20％。

實施例3

a、取新鮮骨髓100g，清洗3次，使去掉骨頭砸碎和血跡，切碎小分塊，按重量比為1∶5加入液氮粉碎，反復粉碎3次，得到骨髓碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、將步驟a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸餾水，置磁力攪拌器上提取4小時，溫度35℃，每次提取2次，減壓抽濾，合并提取液，分離雜物，得到提取液備用；

c、將步驟b得到的提取液，置溫度4℃過夜，使油水層分離，取出上層油層，將下層提取層置分液漏斗，按料液體積比為1∶5加入正己烷，不停搖進行脫脂，靜止4h至上層未見油狀物，得到脫脂的粗提取液；

d、將步驟c得到的粗提取液，在12000轉/分下,溫度4℃離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白提取液；

e、將步驟d得到的骨髓蛋白提取液，采用截留分子量為10KDa的再生纖維素平板膜，在壓力0.10MPa，溫度25℃，流速30m/s下，進行大分子和小分子成分的分離和濃縮，將骨髓蛋白質滯留和滲透液分別收集，得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液；

f、將步驟e得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液，分別利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3-5倍，依次離心，上清液噴霧干燥或冷凍干燥，過篩，紫外滅菌，包裝，分別得到10KD載留骨髓蛋白粉(1.09g)和10KD濾過多肽部分(0.30g)，骨髓活性蛋白質提取率54.5％，多肽提取率15％。

實施例4

a、取新鮮骨髓100g，清洗3次，使去掉骨頭砸碎和血跡，切碎小分塊，按重量比為1∶5加入液氮粉碎，反復粉碎3次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、將步驟a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸餾水，置磁力攪拌器上提取3小時，溫度40℃，每次提取3次，減壓抽濾，合并提取液，分離雜物，得到提取液備用；

c、將步驟b得到的提取液，置溫度4℃過夜，使油水層分離，取出上層油層，將下層提取層置分液漏斗，按料液體積比為1∶5加入石油醚，不停搖進行脫脂，靜止5h至上層未見無油狀物，得到脫脂的粗提取液；

d、將步驟c得到的粗提取液，在12000轉/分下，溫度4℃離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白提取液；

e、將步驟d得到的骨髓蛋白提取液，采用截留分子量為10KDa的再生纖維素平板膜，在壓力0.06MPa，溫度20℃，流速25m/s，進行大分子和小分子成分的分離和濃縮，將骨髓蛋白質滯留和滲透液分別收集，得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液；

f、將步驟e得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液，分別利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3-5倍，依次離心，上清液噴霧干燥或冷凍干燥，過篩，紫外滅菌，包裝，分別得到10KD載留骨髓蛋白粉(0.85g)和10KD濾過多肽部分(0.33g)，骨髓活性蛋白質提取率42.5％，多肽提取率16.5％。

實施例5

a、取新鮮骨髓100g，清洗3次，使去掉骨頭砸碎和血跡，切碎小分塊，按重量比為1∶5加入液氮粉碎，反復粉碎4次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、將步驟a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸餾水，置磁力攪拌器上提取4小時，溫度30℃，每次提取3次，減壓抽濾，合并提取液，分離雜物，得到提取液備用；

c、將步驟b得到的提取液，置溫度4℃過夜，使油水層分離，取出上層油層，將下層提取層置分液漏斗，按料液體積比為1∶5加入正己烷，不停搖進行脫脂，靜止3h至上層未見無油狀物，得到脫脂的粗提取液；

d、將步驟c得到的粗提取液，在12000轉/分下，溫度4℃離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白提取液；

e、將步驟d得到的骨髓蛋白提取液，采用截留分子量為10KDa的再生纖維素平板膜，在壓力0.15MPa，溫度25℃，流速30m/s，進行大分子和小分子成分的分離和濃縮，將骨髓蛋白質滯留和滲透液分別收集，得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液；

f、將步驟e得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液，分別利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3-5倍，依次離心，上清液噴霧干燥或冷凍干燥，過篩，紫外滅菌，包裝，分別得到10KD載留骨髓蛋白粉(0.80g)和10KD濾過多肽部分(0.46g)，骨髓活性蛋白質提取率40％，多肽提取率23％。

實施例6

a、取新鮮骨髓100g，清洗3次，使去掉骨頭砸碎和血跡，切碎小分塊，按重量比為1:5加入液氮粉碎，反復粉碎4次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、將步驟a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸餾水，置磁力攪拌器上提取4小時，溫度35℃，每次提取3次，減壓抽濾，合并提取液，分離雜物，得到提取液備用；

c、將步驟b得到的提取液，置溫度4℃過夜，使油水層分離，取出上層油層，將下層提取層置分液漏斗，按料液體積比為1∶5加入正己烷，不停震搖進行脫脂，然后靜止5h至上層未見油狀物，得到脫脂的蛋白粗提取液；

d、將步驟c得到的粗提取液，在12000轉/分下，溫度4℃下離心10min，取上清液得到骨髓蛋白粗提取液；

e、將步驟c得到的骨髓蛋白粗提取液，采用截留分子量為10KDa的再生纖維素平板膜，在壓力0.10MPa，溫度25℃，流速35m/s，進行大分子和小分子成分的分離和濃縮，將骨髓蛋白質滯留和滲透液分別收集，得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液；

f、將步驟e得到10KD載留蛋白質液和10KD濾過液，分別利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3-5倍，依次離心，上清液噴霧干燥或冷凍干燥，過篩，紫外滅菌，包裝，分別得到10KD載留骨髓蛋白粉(1.16g)和10KD濾過多肽部分(0.34g)，骨髓活性蛋白提取率58％，多肽提取率17％。

實施例7(對比)

a、取新鮮骨髓100g，清洗3次，使去掉骨頭砸碎和血跡，預冷，切碎小分塊，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、將步驟a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸餾水，置磁力攪拌器上提取4小時，溫度40℃，每次提取3次，減壓抽濾，合并提取液，分離雜物，得到提取液備用；

c、將步驟b得到的提取液，置溫度4℃過夜，使油水層分離，取出上層油層，將下層提取層置分液漏斗，按料液體積比為1∶5加入正己烷，不停搖進行脫脂，靜止5h至上層未見油狀物，得到脫脂的蛋白粗提取液；

d、將步驟c得到的粗提取液，在12000轉/分下，溫度4℃下離心10min，取上清液，

提取液濃縮至5-7倍，透析48小時，上清液噴霧干燥或冷凍干燥，過篩，紫外滅菌，包裝，即得到骨髓蛋白粉1.2g，骨髓活性蛋白提取率為60％。

e、將步驟c得到的骨髓蛋白粗提取液，采用截留分子量為10KDa的再生纖維素平板膜，在壓力0.10MPa，溫度25℃，流速35m/s，進行大分子和小分子成分的分離和濃縮，將滯留和滲透液分別收集，得到骨髓蛋白質提取溶液；

f、將步驟e得到兩種10KD載留和10KD濾過部分，即骨髓蛋白質滯留和滲透液，分別利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3-5倍，依次離心，上清液噴霧干燥或冷凍干燥，過篩，紫外滅菌，包裝，即可得到分別為10KD載留骨髓蛋白粉(0.64g)和10KD濾過多肽部分(0.16g)，骨髓活性蛋白提取率32％，多肽提取率8％。

實施例8

蛋白質濃度的測定：

利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定實施1-6所得骨髓蛋白質濃度：

標準曲線的繪制根據二喹啉甲酸(BCA)蛋白測量試劑盒說明書操作配制工作液，每50倍體積的二喹啉甲酸(BCA)試劑A溶液加1倍體積的二喹啉甲酸(BCA)試劑B溶液，充分混勻備用；根據表1吸取試劑盒中蛋白標準品牛血清蛋白，用水稀釋，搖勻；各管分別取25μL于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，輕微振蕩，混勻，于溫度37℃恒溫箱中溫育30min；取出96孔板，用酶標儀測定吸光度，測定波長為562nm；每個做三組平行，以吸光度為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標進行回歸運算。

表1系列稀釋牛血清白蛋白(BSA)標準品

樣品的測定：

精確稱取2.5mg樣品，加入1mL蒸餾水溶解，10000轉/分離心2min，按照標準曲線操作方法，取25μL樣品溶液于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，輕微振蕩，混勻，于溫度37℃恒溫箱中溫育30min，取出96孔板，用酶標儀測定吸光度，測定波長為562nm，每個樣品做三組平行，按照標準曲線計算蛋白質的含量；

實驗結果：

由圖2及表2可知，不管何種溶液提取，利用液氮研磨對原料處理的提取物蛋白質含量高于其他方法處理原料所得提取物；采用直接水提方法提取的蛋白提取率與含量均低于骨髓液氮粉碎處理和超濾膜處理的方法，故本發(fā)明采用的超濾膜用液氮冷凍粉碎水提的骨髓提取也分離成兩個分子量段，為了便于直觀分析和比較本表只列入其直接水提，液氮冷粉碎水提，液氮冷粉碎水提10KD載留液和10KD濾過液干燥部分。其中液氮研磨處理水提方法蛋白含量最高，可達1745μg/mL,占提取物的52.3％。超濾膜分離中10KD載留液部分蛋白含量高，可達1411μg/mL，占提取物的38.1％。

表2有效成分及蛋白質提取率

實施例9

蛋白質種類的確定：

試劑配制及樣品處理：

樣品緩沖液：0.5mL的0.5moL/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液(pH＝6.8)、2mL的10％十二烷基硫酸鈉、1mL甘油、0.5mL的β-巰基乙醇、1mL的水、微量的溴酚藍；

樣品的處理：精密稱取樣品3mg溶于1mL蒸餾水中，搖勻，與樣品緩沖液等體積混合，隔水煮沸10min，10000轉/分，離心5min；

電極緩沖液：將15.1g三羥甲基氨基甲烷94g甘氨酸、50mL的10％十二烷基硫酸鈉溶解并定容至4L；

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳儲存液：30％(W/V)超純級丙烯酰胺、0.8％(W/V)N,N-亞甲雙丙烯酰胺；

10％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠配制：2.3mL的H₂O、5mL的30％(V/V)SDS-PAGE儲存液、2.5mL的1.5moL/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶(pH＝8.8)、0.1mL的10％(W/V)十二烷基硫酸鈉、0.1mL的10％(W/V)過硫酸銨、0.004mL的四甲基乙二胺；5％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠配制：3.4mL的H₂O、0.83mL的30％(V/V)

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳儲存液、0.63mL的1.5moL/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液(pH＝8.8)、0.05mL的10％(W/V)十二烷基硫酸鈉、0.05mL的10％(W/V)過硫酸銨、0.005mL的四甲基乙二胺；

電泳條件：恒壓75伏，30min，然后恒壓150伏，90min；

考馬斯亮藍固定液：25％異丙醇、10％的冰醋酸、65％水；

考馬斯亮藍染色液：將0.6g的考馬斯亮藍R-250溶解在300mL的固定液中，過濾，棕色瓶儲存；

考馬斯亮藍脫色液：5％甲醇、7％的冰醋酸、88％水；

電泳結束后將凝膠片置于固定液中固定2h，然后放入考馬斯亮藍染色液中，置于搖床上染色2h，再用脫色液浸泡至背景色褪色完全為止。

棕色瓶儲存；

考馬斯亮藍脫色液：5％甲醇、7％的冰醋酸、88％水；

電泳結束后將凝膠片置于固定液中固定2h，然后放入考馬斯亮藍染色液中，置于搖床上染色2h，再用脫色液浸泡至背景色褪色完全為止；

實驗結果：

由圖3中可以看出，骨髓樣品水提部分(1)只能看出分子量為66KD得蛋白條帶，未顯示出分子量10或者1以下的多肽條帶；后經過骨髓樣品切碎，液氮進行冷凍粉碎水提(2)部分在6.5KD-9.5KD之間，出現多肽條帶，說明低溫下液氮冷凍粉碎能夠充分粉碎，有效得提高產率，減少損耗，是一種骨髓前處理首選方的法之一；

由圖4中可以看出，超濾膜濃縮中，10KD載留部分(1)在66KD處顯示明顯的條帶，10KD濾過部分在9.5KD左右的分子量段電泳條帶顯示，表明在這位置出現多肽；這說明超濾膜10KD的平板膜能夠有效的分離蛋白質和多肽部分，是一種簡易而快速分離骨髓蛋白和多肽的有效方法之一。

實施例10

融化瓊脂培養(yǎng)基，待其溫度降至46±0.5℃，加入已培養(yǎng)好的菌液，使試驗菌懸液濃度為5×105cfu/ml-5×106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20mine使其凝固；

用瓊脂打孔器打孔，直徑為5-6mm，4-5孔/皿，均勻分布，各樣片中心之間相距25mm以上，與平板的周緣相距15mm以上；

樣品濃度為100mg/ml(100mM)；每孔加樣品溶液20μl，蓋好平皿，置于溫度37℃培養(yǎng)箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培養(yǎng)16h-18h，用游標卡尺測量抑菌環(huán)的直徑并記錄；

評價：

(1)抑菌作用的判斷:

抑菌環(huán)直徑大于7mm者，判為有抑菌作用；

抑菌環(huán)直徑小于或等于7mm者，判為無抑菌作用；

試驗結果：

由表3和圖4、圖5中可以看出骨髓經粉碎直接水提沒有任何抗菌活性，可能骨髓組織沒有完全破碎，從而有效成未過提取液中；液氮冷凍研磨水提法提取的蛋白質只對白色念球菌有抑菌活性，超濾膜分離兩種濃縮部分對白色念球菌和大腸桿菌均有抑制活性，其中10KD載留部分活性較強，這與蛋白含量高低也有一定的劑量關系。

表3、骨髓蛋白質與多肽抗菌效果對比圖

當抑制區(qū)直徑≤7mm時，認為樣品沒有效果抗菌(水腫)：白色念珠菌ATCC10231；大腸桿菌ATCC11229；

實施例11

用安捷倫科技系列6520b chip-q-tof進行蛋白與肽質譜分析：

安捷倫1260紫外-可見光檢測器、安捷倫1260自動進樣器、安捷倫380型ELSD檢測器，正離子質譜條件(ESI+/MS)條件：毛細管電壓：65V，干燥氣溫度：溫度350℃；錐孔電壓175V，在液質模式300–3000m/z采用正離子模式質量范圍；色譜柱：C₁₈柱子(150×75mm,5um)，乙腈，甲酸等均為色譜純；

1流動相的配制：A：0.1％甲酸+5％乙腈，B：90％甲酸+0.1％乙腈；

2樣品的制備：梯度洗脫(3mim,20％，30min，80％,35min,20％)，流速0.6μL/min，進樣體積為10uL；

試驗結果：

由圖6可看出，10KDa載留部分，即蛋白質類成分在10mim-11.5mim中間出現一個大峰，分子量為15064.11(10.1815min)；其他峰分子量分別為11448.82(8.916mim)11382.83(9.491mim)、14553.73(9.491min)、12664.58(10.476min),15063.73(10.476min)、15064.11(10.476min)、18997.11(10.476min)；從這些分子量可以推斷為10KDa纖維素平板膜可以有效的分離蛋白質成分；

由圖7可看出，10KDa濾液部分，即多肽類成分在4.5mim-8mim中間出現一個大峰，分子量為4222.1428(5.129min)。其他峰分子量分別為4223.1485(5.129min)、2066.4531(5.954min)、4289.2793(6.410min)、2037.5016(6.1410min)、2454.125(6.1410min)、4450.4712(6.1410min)、1718.2039(6.660min)、3118.8771(6.915min)、2570.2401(7.396min)、3111.9524(7.396min)、3110.9421(7.396min)、6290.66(7.396min)、6504.0044(7.396min)、2439.0747(6.595min)、2586.2619(7.260min)；從這些分子量可以推斷為10KDa纖維素平板膜可以有效的分離多肽類成分，而且骨髓中多肽成分數量較多。