專利名稱：Nell肽表達(dá)系統(tǒng)和nell肽的骨形成活性的制作方法
關(guān)于在聯(lián)邦研發(fā)基金資助下所得發(fā)明的權(quán)利聲明本工作受NIH/NIDR基金No.DE9400和CRC/NIH基金No.RR00865的支持，美國(guó)政在本發(fā)明中可享有一定的權(quán)利。
技本領(lǐng)域本發(fā)明總的涉及骨生長(zhǎng)因子，更具體是涉及包括NELL1的組合物，包括NELL1的制品，以及使用NELL1誘導(dǎo)骨形成的方法。本發(fā)明還提供NELL1和NELL2肽的表達(dá)和純化方法。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)因子是諸如肽的物質(zhì)，它們?cè)隗w內(nèi)或體外影響特定的細(xì)胞群的生長(zhǎng)和分化。
骨形成發(fā)生在長(zhǎng)骨(軟骨內(nèi)骨形成)和扁骨(膜內(nèi)骨形成)的發(fā)育過(guò)程中。而且，骨形成還發(fā)生在骨重構(gòu)過(guò)程中，這在成年人的一生中連續(xù)發(fā)生，以保持骨骼的完整性。最后，骨形成還發(fā)生在骨修復(fù)過(guò)程中，例如，在骨折或外科手術(shù)的時(shí)候發(fā)生骨損傷的情況下。人們認(rèn)為在長(zhǎng)骨和扁骨的胚胎學(xué)發(fā)育中涉及不同的骨形成機(jī)理，但認(rèn)為修復(fù)涉及膜內(nèi)骨形成。
每種機(jī)理的骨形成都涉及成骨細(xì)胞的活性，而后者是由生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的。成骨細(xì)胞由骨髓基質(zhì)細(xì)胞(也稱為間質(zhì)干細(xì)胞；MSC)庫(kù)中生成。這些細(xì)胞存在于各種組織中，但主要存在于骨髓基質(zhì)中。MSC是多能的，能夠分化為各種細(xì)胞類型，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、和脂肪細(xì)胞。生長(zhǎng)因子被認(rèn)為能影響骨生成細(xì)胞的增殖、分化和成骨細(xì)胞礦化作用，這些作用的每一種都影響骨形成。
例如，在顱縫骨接合和裂口移植病人中已經(jīng)使用自體骨來(lái)進(jìn)行骨修復(fù)。在3000名嬰兒中有1名患有顱縫骨接合(CS)，即顱縫過(guò)早閉合，因此是最普通的人類先天性顱面畸形中的一種。過(guò)早的縫閉合導(dǎo)致顱雙形，可能需要外科矯正。在人類CS中過(guò)早縫閉合可通過(guò)兩種可能不同的過(guò)程發(fā)生顱蓋生長(zhǎng)過(guò)度和骨融合。最近，認(rèn)為FGF2和FGFR1與通過(guò)CBFA1-介導(dǎo)的路徑的過(guò)早顱縫融合有關(guān)(8)。CBFA1的錯(cuò)義突變和鎖骨頭顱發(fā)育不良(顯示為延遲的縫閉合)有關(guān)。
已經(jīng)使用自體骨如髂骨嵴或顱蓋施行了自體骨移植。這些供體部位并非沒(méi)有繼發(fā)病態(tài)(如疼痛、步態(tài)紊亂、髂嵴供體部位大腿感覺(jué)異常、以及感染、神經(jīng)短缺和顱骨移植物血腫)。而且，供體部位的體積有限，可能造成延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間和留院時(shí)間。
異源體移植材料也已被使用，生長(zhǎng)因子也已在動(dòng)物模型上進(jìn)行了試驗(yàn)。例如，bFGF已經(jīng)顯示出對(duì)骨再生和修復(fù)的潛在用途。另一骨生成的生長(zhǎng)因子家族被描述為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。特別是，已注明BMP-2重組蛋白能使下頜骨連續(xù)性缺損和裂腭缺損再生，其結(jié)果等于或優(yōu)于自體顆粒骨和骨髓。對(duì)BMP和其它骨生成因子的臨床應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)行了研究。然而，使用最低有效劑量的BMP的費(fèi)用是臨床應(yīng)用的限制因素。
脊柱融合是將多個(gè)脊柱的脊椎聯(lián)合在一起使它們之間不再發(fā)生運(yùn)動(dòng)的外科技術(shù)。其指征包括折裂(破裂)脊椎的治療、畸形的矯正、消除運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的疼痛、不穩(wěn)定性的處理、以及一些頸間盤(pán)突出的治療。該手術(shù)可能涉及在脊椎之間放置骨移植物，使得在脊椎之間獲得牢固的連接。手術(shù)過(guò)程還可能涉及一些補(bǔ)充的處理，包括板、螺釘、支架的放置，最近還使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和7以幫助骨移植物的穩(wěn)定化和愈合。自體骨移植是臨床優(yōu)選的方法，但仍有約30-50％的失敗率。自體骨移植是個(gè)單獨(dú)的外科手術(shù)，也會(huì)帶來(lái)顯著的發(fā)病率。
因此，需要安全、有效和付得起費(fèi)用的組合物和方法在骨發(fā)育、疾病或骨外傷中能誘導(dǎo)骨形成。
發(fā)明概要本發(fā)明提供用于表達(dá)和純化NELL1和NELL2肽的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括NELL肽、表達(dá)NELL肽的核酸構(gòu)建物、以及可用來(lái)產(chǎn)生大量NELL肽的表達(dá)NELL肽的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)NELL肽的核酸構(gòu)建物還可包括編碼信號(hào)肽的核酸序列，該信號(hào)肽有助于宿主細(xì)胞中的蛋白運(yùn)輸和NELL肽產(chǎn)生后的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)肽有助于NELL肽從宿主細(xì)胞中分泌。因此，本發(fā)明至少在提供大量功能性NELL肽方面是有利的，該肽可被純化用于臨床或研究。
本發(fā)明可包括包含NELL肽的組合物和基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，組合物可包括NELL1，還可包括有助于例如施用、穩(wěn)定性、活性、擴(kuò)散和/或施用部位肽濃度的其它物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)可包括細(xì)胞和/或NELL1肽，它們有助于植入物周邊的骨修復(fù)。
本發(fā)明包括在各種臨床應(yīng)用中誘導(dǎo)骨生成分化、成骨細(xì)胞礦化和/或骨形成的方法。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)至少在于，NELL肽可提供比已知的生長(zhǎng)因子更大的作用，或可增強(qiáng)其它生長(zhǎng)因子的活性。因此，各種生長(zhǎng)因子在臨床應(yīng)用中可使用較低劑量。這至少在臨床治療更能負(fù)擔(dān)得起這一點(diǎn)上是意義重大的。而且，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)至少在于，NELL1促進(jìn)骨生成分化、成骨細(xì)胞礦化和骨形成，這可改善單用BMP的臨床治愈率和有效性。
定義術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在此可交互使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)可用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸是天然存在的相應(yīng)氨基酸的人造化學(xué)類似物，以及用于指天然存在的氨基酸聚合物。
術(shù)語(yǔ)“NELL1 cDNA”指SEQ ID NO1，3和5(分別為圖1，3和5)，“NELL2cDNA”指SEQ ID NO7，9，11和13(圖7，9，11和13)。
NELL1是一種蛋白質(zhì)，它可被NELL1基因或cDNA表達(dá)，包括SEQ ID NO2，4和6(分別為圖2，4和16)。NELL1肽可包括NELL1肽片段，它仍保留誘導(dǎo)骨生成細(xì)胞分化、成骨細(xì)胞分化或骨形成的能力。NELL2肽是一種蛋白質(zhì)，它可被NELL2基因或cDNA表達(dá)，包括SEQ IDNO8，10，12和14(分別為圖8，10，12和14)。NELL2肽可包括NELL2肽片段，它仍保留與完全的NELL2肽序列相似的活性。
術(shù)語(yǔ)“抗體”可包括修飾的或改變的抗體的各種形式，如完整的免疫球蛋白、只含輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fv片段、由二硫化物鍵連接的Fv片段、含可變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab或(Fab)’2片段、單鏈抗體，等等?？贵w可包括完整的分子以及它們的片段，如Fab和F(ab')2，和/或單鏈抗體(如scFv)，它可結(jié)合一個(gè)抗原決定簇。抗體可以是動(dòng)物(如小鼠或大鼠)來(lái)源的或人源的或嵌合的或人化的?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體(“mAb's”)，如對(duì)NELL1或NELL2蛋白編碼的多肽具有特異性的單克隆抗體。
術(shù)語(yǔ)“捕獲劑”可指與其它分子特異性地結(jié)合形成結(jié)合復(fù)合物(如抗體-抗原、凝集素-碳水化合物、核酸-核酸、生物素-抗生物素蛋白，等)的分子。
術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”指對(duì)生物分子(如蛋白質(zhì)、核酸、抗體等)，指對(duì)異種分子(如蛋白質(zhì)和其它生物分子)群落中生物分子的存在有鑒定作用的結(jié)合反應(yīng)(BR)。因此，在給定的條件下(如抗體的免疫測(cè)定條件或核酸的嚴(yán)格雜交條件)，特定的配體或抗體與其特定的“靶”分子結(jié)合，而對(duì)存在于樣品中的其它分子無(wú)明顯的結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“核酸”或“寡核苷酸”指共價(jià)結(jié)合在一起的至少兩個(gè)核苷酸。本發(fā)明的核酸可以是單股的或雙股的，可含有磷酸二酯鍵，但在某些情況下，也可包括具有交替骨架(包含，例如，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亞磷酰胺酸(omethylphosphoroamidite)鍵、和/或肽核酸骨架或連接)的核酸類似物。核酸類似物可具有正骨架和/或非核糖骨架。核酸還可包括一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖?？蛇M(jìn)行核糖-磷酸骨架的修飾以于加入其它部分(如標(biāo)記物)，或增加這些分子在生理環(huán)境中的諸如穩(wěn)定性和半壽期。
術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”指在嚴(yán)格條件(在探針優(yōu)先與其靶序列雜交而與其它序列則較少雜交的條件)下，核酸分子優(yōu)先與特定的核苷酸序列的結(jié)合、形成雙鏈或雜交。


圖1是編碼人NELL1 cDNA(SEQ ID NO1)的核酸序列。
圖2是編碼人NELL1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。
圖3是編碼大鼠NELL1 cDNA(SEQ IDNO3)的核酸序列。
圖4是編碼大鼠NELL1(SEQ ID NO4)的氨基酸序列。
圖5是編碼小鼠NELL1 cDNA(SEQ ID NO5)的核酸序列。
圖6是編碼小鼠NELL1(SEQ ID NO6)的氨基酸序列。
圖7是編碼人NELL2 cDNA(SEQ ID NO7)的核酸序列。
圖8是編碼人NELL2(SEQ ID NO8)的氨基酸序列。
圖9是編碼大鼠NELL2 cDNA(SEQ ID NO9)的核酸序列。
圖10是編碼大鼠NELL2 SEQ ID NO10)的氨基酸序列。
圖11是編碼小鼠NELL2 cDNA(SEQ ID NO11)的核酸序列。
圖12是編碼小鼠NELL2(SEQ ID NO12)的氨基酸序列。
圖13是編碼雞NELL2(SEQ ID NO13)的核酸序列。
圖14是編碼雞NELL2(SEQ ID NO14)的氨基酸序列。
圖15是產(chǎn)生功能性NELL肽的一個(gè)方法的流程圖。
圖16例示一個(gè)信號(hào)肽-NELL-FLAG-核酸構(gòu)建物。下面劃線的氨基酸序列來(lái)自蜂毒肽信號(hào)肽。在丙氨酸和脯氨酸之間的鍵是High Five細(xì)胞分泌的假定的斷裂位點(diǎn)。RTVLGFG...的殘基來(lái)自大鼠/人NELL1蛋白的成熟蛋白產(chǎn)生的。
圖17例示NELL1-FLAG的細(xì)胞外表達(dá)產(chǎn)物。圖17A是CBB-染色的UnoQ-洗脫物的SDS-PAGE凝膠，該洗脫物含有從無(wú)血清培養(yǎng)基中的High Five細(xì)胞產(chǎn)生的純化的NELL1肽(產(chǎn)率約3mg/L培養(yǎng)基)圖17B是用抗-FLAG抗體的Western印跡；圖17C是CBB-染色的UnoQ-洗脫物的SDS-PAGE凝膠，該洗脫物含有從無(wú)血清培養(yǎng)基中的COS7細(xì)胞產(chǎn)生的純化的NELL1肽(產(chǎn)率＜0.1mg/L培養(yǎng)基)；圖17D是用抗-FLAG抗體的Western印跡。
圖18是例示無(wú)血清培養(yǎng)基中昆蟲(chóng)細(xì)胞細(xì)胞外表達(dá)NELL2-FLAG肽的Western印跡。
圖19是例示兩種類型無(wú)血清培養(yǎng)基中High Five細(xì)胞細(xì)胞外表達(dá)NELL1和NELL2-FLAG肽的Western印跡(表達(dá)Five SFME和SF921)。
圖20是表明暴露于NELL1肽(1ng，10ng，100ng/ml)和BMP4(100ng/ml)的胎鼠顱蓋細(xì)胞中堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)的條形圖。
圖21A-D是用NELL1(A&B 5ng/ml，C&D 50ng/ml)處理的成骨細(xì)胞的顯微照片。
圖22A和B是不存在抗壞血酸時(shí)形成小結(jié)的NELL1 MC3T3小結(jié)的顯微照片。
圖23A-C是表明礦化作用的顯微照片A)抗-NELL，B)β-Gal和C)NELL腺病毒構(gòu)建物；圖23D和E是表示每個(gè)細(xì)胞群中骨鈣蛋白和骨橋蛋白水平經(jīng)時(shí)變化的條形圖。
圖24是NELL1過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠的顯微照片，染色后表明顱蓋過(guò)度生長(zhǎng)的礦化作用。
圖25A和B是顱蓋的顯微照片，染色后顯示礦化作用A)NELL1過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠；B)正常同窩鼠。
圖26是轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)印跡，表明用A)Cbfa1或B)對(duì)照物處理的胎鼠顱蓋細(xì)胞中NELL1基因的表達(dá)。
圖27A-C分別是A)野生型，B)Cbfa1+/-，C)Cbfa1+/-+NELL1overexp小鼠顱(上)、鎖骨(中)的骨骼染色照片；以及顱的顯微-CT。
圖28A和B是顱蓋缺損顯微-CT照片處理的(右)和對(duì)照(左)；A)BMP2處理的和B)NELL1處理的。
圖29是顱蓋缺損顯微-CT照片NELL1處理的(右)，BMP處理的(左)。
圖30A和B是腭缺損的顯微-CT照片NELL1處理的(右)，對(duì)照(左)。
圖31A和B是TUNEL染色的軟骨的顯微照片A)NELL1overexp，B)野生型小鼠。
圖32是治療病人以在選擇的部位形成骨的一種方法的流程圖。
圖33A是表明移植物的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖；圖33B是表明治療病人以在選擇的部位形成骨的實(shí)施方案示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及用NRLL1誘導(dǎo)骨形成的藥物和方法。本發(fā)明還涉及用來(lái)表達(dá)和純化NELL1和NELL2蛋白的方法。
NELL1是由Ting和Watanabe同時(shí)鑒定的。NELL1是810個(gè)氨基酸的肽，主要分布在骨中。在成年人中，NELL2在顱面骨中高水平表達(dá)，而在長(zhǎng)骨中表達(dá)水平較低。已經(jīng)檢測(cè)了它在成骨細(xì)胞分化、骨形成和再生中的作用。NELL2由Watanabe在1996年鑒定，是個(gè)816肽，分布在神經(jīng)細(xì)胞和腦中。
人NELL1基因在啟動(dòng)子區(qū)至少包括3個(gè)Cbfa1應(yīng)答元素。Cbfa1與在NELL1啟動(dòng)子中的這些應(yīng)答元素特異性地結(jié)合。在發(fā)育期和在成年期，NELL1表達(dá)可在轉(zhuǎn)錄因子控制下，至少在前成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和肥大的軟骨細(xì)胞中內(nèi)源性地表達(dá)。鎖骨頭顱骨形成異常(disostosis)是一種發(fā)育性顱蓋缺損，被認(rèn)為至少部分是由Cbfa的破裂引起的。
為了研究NELL1和NELL2肽的功能，曾經(jīng)試圖生產(chǎn)并純化這些肽。不幸的是，NELL1和NELL2肽在許多表達(dá)系統(tǒng)中不能被表達(dá)。特別是，直接在E.coli和S.cerevisiae表達(dá)系統(tǒng)中未檢出表達(dá)。在融合的E.coli和CHO-dhfr表達(dá)系統(tǒng)中。只發(fā)生極低水平的表達(dá)。在桿狀病毒系統(tǒng)中，這些肽曾得到表達(dá)。
本發(fā)明的驚人發(fā)現(xiàn)是，NELL1和NELL2肽可在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高水平表達(dá)，而且在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中表達(dá)的NELL1和NELL2肽是該蛋白的功能形式。
COS7細(xì)胞可用來(lái)低水平地產(chǎn)生NELL1和NELL2蛋白，如每升培養(yǎng)基10毫克，但表達(dá)需要含血清的培養(yǎng)基。不幸的是，該培養(yǎng)基不適合蛋白質(zhì)生產(chǎn)。至于信號(hào)肽，NELL1和NELL2內(nèi)源性信號(hào)肽使COS7細(xì)胞中可發(fā)生肽的低水平表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明包括用昆蟲(chóng)細(xì)胞系表達(dá)功能性NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該昆蟲(chóng)細(xì)胞可為High Five細(xì)胞，Sf9和其它Sf細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供編碼NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的核酸序列。該核酸序列可以是cDNA或基因組DNA，至少編碼NELL肽的一個(gè)功能部分。例如，該核酸序列可選自(但不限于)人NELL1(SEQ ID NO1)、大鼠NELL1(SEQ ID NO3)、小鼠NELL1(SEQ ID NO5)或人NELL2(SEQ IDNO7)、大鼠NELL2(SEQ ID NO；9)、小鼠NELL2(SEQ ID NO11)、雞NELL2(SEQ ID NO13)。該核酸序列還可包括諸如具有基本的序列相似性的序列，例如具有與上述序列的任何部分至少75％序列相似性的序列。
該核酸還可包括用于表達(dá)編碼NELL肽如NELL1或NELL2肽的核酸序列的表達(dá)載體。例如，表達(dá)載體可以是plZT/V5-His(Invitrogen)，選擇性標(biāo)記物還可包括殺稻瘟素和新霉素。
而且，陔核酸序列還可包括編碼報(bào)道蛋白產(chǎn)物的附加核酸，以監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的水平，或者編碼可用本領(lǐng)域已知方法顯影的肽標(biāo)記的核酸，以監(jiān)測(cè)肽表達(dá)的水平。附加序列可加以選擇，使之不干擾核酸的表達(dá)，或不干擾所表達(dá)的肽產(chǎn)物的功能。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法可包括提供編碼NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的核酸序列，其框架中帶有編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分泌信號(hào)肽可以是來(lái)自分泌的蜜蜂蛋白的分泌信號(hào)肽。例如該核酸序列可以選自(但不限于)蜂毒肽信號(hào)序列、果蠅(drosphila)免疫球蛋白結(jié)合蛋白信號(hào)序列、馬γ干擾素(elFN-γ)信號(hào)肽、蛇磷脂酶A2抑制劑信號(hào)肽、人和/或雞溶菌酶信號(hào)肽。對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，也可使用胰蛋白酶原前導(dǎo)序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括用編碼NELL肽的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞系；在允許NELL肽表達(dá)和/或分泌的條件下培養(yǎng)該昆蟲(chóng)細(xì)胞系。例如，該細(xì)胞系可用編碼NELL肽的核酸構(gòu)建物短時(shí)地或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染。
該方法還可包括收集所分泌的NELL肽和/或純化NELL肽備用?？梢愿鞣N功能或表達(dá)測(cè)試法測(cè)試肽產(chǎn)物的活性。例如在任何測(cè)試中，如果在某一特定參數(shù)上NELL肽具有比對(duì)照物質(zhì)顯著的作用，則可以說(shuō)該NELL肽對(duì)于實(shí)現(xiàn)該測(cè)量的參數(shù)是有功能的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)NELL肽(如NELL1和/或NELL2肽)的核酸構(gòu)建物。該核酸序列可以是編碼NELL肽的至少一個(gè)功能部分的cDNA或基因組DNA。例如，該核酸序列可選自(但不限于)人NELL1(SEQ ID NO1)、大鼠NELL1(SEQ ID NO3)、小鼠NELLI(SEQ ID NO5)、或人NELL2(SEQ 1D NO7)、大鼠NELL2(SEQ ID NO9)、小鼠NELL2(SEQ IDNO11)、雞NELL2(SEQ ID NO13)。該核酸序列還可包括諸如具有基本的序列相似性的序列，例如具有與上述序列的任何部分至少75％序列相似性的序列。
該核酸構(gòu)建物可包括編碼信號(hào)肽的核酸序列。該核酸可包括用于表達(dá)編碼NELL肽的核酸序列的表達(dá)載體。而且，該核酸序列可包括編碼報(bào)道基因產(chǎn)物的附加核酸以監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的水平，或編碼可用本領(lǐng)域已知方法顯影的肽標(biāo)記的附加核酸，以監(jiān)測(cè)肽表達(dá)的水平。
該核酸構(gòu)建物可包含含有選擇基因的表達(dá)和克隆載體，該基因也稱為可選擇的標(biāo)記物，如一種編碼使被該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能存活或生長(zhǎng)所必需的蛋白的基因。該基因的存在確保任何缺失該載體的宿主細(xì)胞在生長(zhǎng)或繁殖上得不到轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所能得到的優(yōu)點(diǎn)。典型的選擇基因編碼以下蛋白質(zhì)(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(如氨芐西林、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素)抗性的蛋白質(zhì)，(b)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷體缺陷的蛋白質(zhì)。
核酸構(gòu)建物還可包括為宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子，并且可操作地連接于編碼NELL的核酸上。啟動(dòng)子是不被翻譯的序列，位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子的上游(通常在約100-1000堿基對(duì)之內(nèi))，控制核酸在其控制之下的轉(zhuǎn)錄和翻譯，包括誘導(dǎo)型和組成型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是這樣的啟動(dòng)子，它們可響應(yīng)培養(yǎng)條件的某些改變(如營(yíng)養(yǎng)物的存在或不存在，或溫度的改變)而啟動(dòng)在它們控制下的水平提高的DNA轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在，許多為各種潛在宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子是公知的。
當(dāng)一個(gè)核酸被放置在與另一個(gè)核酸序列有功能關(guān)系的位置時(shí)，該核酸就可能被可操作地連接。例如，編碼前序列或分泌引導(dǎo)物的DNA可操作地與編碼多肽的DNA連接，如果它被表達(dá)為參與該多肽分泌的前蛋白的話；啟動(dòng)子或促進(jìn)子可操作地與編碼序列連接，如果它能影響該序列轉(zhuǎn)錄的話；或者，核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地與編碼序列連接，如果它處于能促進(jìn)翻譯的位置。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括表達(dá)功能性NELL肽的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞可以是昆蟲(chóng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該昆蟲(chóng)細(xì)胞可以是HighFive細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞可被編碼NELL肽的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染。例如，該細(xì)胞系可被編碼NELL肽的核酸構(gòu)建物暫時(shí)地或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染。在一個(gè)實(shí)施方案中，NELL表達(dá)核酸(如cDNA)可被克隆入基因表達(dá)載體或?qū)D(zhuǎn)染細(xì)胞(如昆蟲(chóng)細(xì)胞)感受態(tài)的病毒顆粒中。
核酸序列還可包括編碼NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的核酸序列，在其框架中帶有編碼昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽的核酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括表達(dá)功能性NELL肽并可分泌功能蛋白的細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括包含NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的多肽(氨基酸序列)，并可包括分泌信號(hào)肽。
例如，NELL肽的氨基酸序列可選自(但不限于)人NELL1(SEQ ID NO2)、大鼠NELL1(SEQ ID NO4)、小鼠NELL1(SEQ ID NO6)、或人NELL2(SEQ IDNO8)、大鼠NELL2(SEQ ID NO10)、小鼠NELL2(SEQ ID NO12)、雞NELL2(SEQ ID NO14)。該氨基酸序列還可包括諸如具有基本的序列相似性的序列，例如具有與上述序列的任何部分至少75％序列相似性的序列，或含有類似NELL1肽的活性結(jié)合區(qū)域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括按照標(biāo)準(zhǔn)肽純化方案純化分泌到培養(yǎng)基中的NELL1和/或NELL2肽的方法，包括但不限于下述的那些方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以檢測(cè)所選擇的細(xì)胞是否表達(dá)所選擇的核酸序列，以表達(dá)和/或分泌NELL肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)NELL肽的存在、其量和/或活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域已知的各種方法檢測(cè)和定量NELL肽。這些方法可包括生化分析方法，如電泳、毛細(xì)管電泳、高效液體色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、超擴(kuò)散色譜等，或各種免疫學(xué)方法，如液體或凝膠沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散(單向或雙向)、免疫電泳、放射免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)、免疫熒光測(cè)定、Western印跡等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，Western印跡(免疫印跡)分析可用來(lái)檢測(cè)和定量所選擇的樣品中NELL肽的存在。該技術(shù)包括基于分子量用凝膠電泳分離樣品蛋白質(zhì)，將分離的樣品蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的固體支撐物(如硝基纖維素濾紙、尼龍過(guò)濾器、或衍生化的尼龍過(guò)濾器)上，使樣品與特異性結(jié)合靶肽的抗體共孵育。
本發(fā)明的測(cè)定可按照本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法記分(陽(yáng)性或陰性或靶多肽的量)。記分的具體方法取決于測(cè)定的格式和標(biāo)記的選擇。例如，可通過(guò)顯示酶標(biāo)產(chǎn)生的著色產(chǎn)物給Western印跡測(cè)定記分。在正確的分子量位置上的清晰可見(jiàn)的著色條帶或斑點(diǎn)可記為陽(yáng)性結(jié)果，而沒(méi)有清晰可見(jiàn)的斑點(diǎn)或條帶可記為陰性結(jié)果。條帶或斑點(diǎn)的強(qiáng)度可提供靶多肽濃度的定量測(cè)定。
在這樣的表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的NELL1蛋白可按與骨成形蛋白(如BMP-1到BMP-24)使用相似的方式加以使用。因此，NELL1多肽可用來(lái)加速骨折的修復(fù)，或在自然愈合受限制或不存在的情況下誘導(dǎo)骨修復(fù)或替換。此外，NELL1多肽可摻合在骨移植材料中。這些移植材料可用來(lái)治療骨折或促進(jìn)修補(bǔ)物或骨移植物的替換/愈合和促進(jìn)脊柱融合。
本發(fā)明還可包括用來(lái)增加骨形成程度和/或速度的藥劑和方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明包括藥劑的全身和/或局部應(yīng)用，以增加骨形成。增加骨形成程度和/或速度的方法或藥劑能力的臨床標(biāo)志可以DEXA掃描評(píng)估的所需骨形成部位上骨密度的改善來(lái)見(jiàn)證。可在選定的時(shí)間間隔里在骨折部位進(jìn)行常規(guī)X-線檢測(cè)來(lái)評(píng)估骨折愈合中骨形成的加速。也可使用更先進(jìn)的技術(shù)如定量的CT掃描來(lái)測(cè)定上述標(biāo)志。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括增加成骨細(xì)胞分化的方法，包含任選地使用第二藥劑增加成骨細(xì)胞中NELL1基因產(chǎn)物的濃度；誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。
該方法可包括將NELL1肽施用于成骨細(xì)胞來(lái)增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度，NELL1肽可選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6，或能有效增加成骨細(xì)胞分化的NELL肽的任何部分。該方法可包括通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源性NELL1基因的表達(dá)(例如，通過(guò)提高表達(dá)調(diào)節(jié)分子Cbfa1的細(xì)胞水平)來(lái)增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度。該方法可包括通過(guò)用編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞來(lái)增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度，編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物可選自SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5。
骨生成細(xì)胞包括但不限于成骨細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胎兒胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、硬腦膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞。
骨生成細(xì)胞還可包括這樣的細(xì)胞它們位于骨組織內(nèi)、與骨組織接觸、或遷移至(即“送回”)骨組織，這些細(xì)胞直接或間接地刺激骨組織的形成。因此，骨生成細(xì)胞可以是這樣的細(xì)胞，它們最終分化為成熟的成骨細(xì)胞本身，即，“直接”形成骨組織的細(xì)胞。
第二藥劑可包括但不限于TGF-β、BMP2、BMP4、BMP7、bFGF、膠原?？蛇x擇在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化中與NELL1具有互補(bǔ)或協(xié)同效應(yīng)的第二藥劑。
成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞標(biāo)記物包括但不限于堿性磷酸酯酶活性、骨鈣蛋白和骨橋蛋白mRNA表達(dá)、BMP7表達(dá)、核心蛋白聚糖表達(dá)和層粘連蛋白B1表達(dá)水平的提高。但是，任何其活性或表達(dá)隨著成骨細(xì)胞分化的結(jié)果而改變的細(xì)胞標(biāo)記物均可用作這樣的標(biāo)記物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，增加成骨細(xì)胞礦化作用的方法可包括任選地應(yīng)用第二藥劑增加成骨細(xì)胞中NELL1基因產(chǎn)物的濃度；和誘導(dǎo)礦化作用細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。
該方法包括將NELL1肽施用于成骨細(xì)胞以增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度，NELL1肽可選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6，或在增加成骨細(xì)胞礦化作用中有效的NELL肽的任何部分。可選擇第二藥劑，使在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞礦化作用中與NELL1具有互補(bǔ)或協(xié)同效應(yīng)。
成骨細(xì)胞礦化作用的細(xì)胞標(biāo)記物包括但不限于鈣摻入水平的提高。但是，任何其活性或表達(dá)隨著成骨細(xì)胞礦化作用的結(jié)果而改變的細(xì)胞標(biāo)記物均可用作這樣的標(biāo)記物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，增加膜內(nèi)骨形成的方法可包括任選地將第二藥劑施用于希望骨形成的大致相同的部位，在該希望骨形成的部位增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度并誘導(dǎo)膜內(nèi)骨形成。
該方法可包括將NELL肽施用于希望骨形成的部位以增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度，NELL1肽可選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6，或在增加膜內(nèi)骨形成中有效的NELL肽的任何部分。
第二藥劑可包括但不限于TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原，骨形成細(xì)胞，骨，骨基質(zhì)，腱基質(zhì)，韌帶基質(zhì)?？蛇x擇第二藥劑使其在誘導(dǎo)膜內(nèi)骨形成中與NELL1具有補(bǔ)充或協(xié)同效應(yīng)。
膜內(nèi)骨的形成可通過(guò)在希望骨形成的部位進(jìn)行組織學(xué)顯微鏡觀察、DEXA掃描、X-線或CT-掃描來(lái)評(píng)價(jià)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，增加軟骨內(nèi)骨形成的方法可包括在希望骨形成的部位增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度；對(duì)希望骨形成的部位任選地施用第二藥劑以及在希望骨形成的部位至少誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的肥大。
該方法可包括通過(guò)在希望骨形成的部位施用NELL1肽來(lái)增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度；NELL1肽可選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6，或在增加軟骨內(nèi)骨形成上有效的NELL肽的任何部分。
第二藥劑可包括但不限于TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原，骨生成細(xì)胞，骨，骨基質(zhì)，腱基質(zhì)，韌帶基質(zhì)?？蛇x擇第二藥劑使其在誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨形成中與NELL1具有補(bǔ)充或協(xié)同效應(yīng)。
軟骨內(nèi)骨的形成可通過(guò)成軟骨細(xì)胞肥大來(lái)評(píng)估，用TUNEL染色觀察到肥大的和凋亡的成軟骨細(xì)胞增加。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括將NELL1結(jié)合于載體或基質(zhì)的方法和這樣形成的基質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)骨形成的組合物可包括有效量的第一藥劑以誘導(dǎo)骨形成，選自包括但不限于NELL1肽和改變NELL1肽表達(dá)的藥劑或改變NELL1肽活性的藥劑的組以及任選的載體。
該組合物可包括NELL1肽，選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ IDNO6，或在誘導(dǎo)骨形成中有效的任何片段。
該組合物可包括第二藥劑，包括但不限于TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原，骨，骨基質(zhì)，腱基質(zhì)或韌帶基質(zhì)，骨生成細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以是可生物降解的，如可通過(guò)酶解或水解機(jī)制降解的。載體的例子包括但不限于合成的可吸收的聚合物，例如但不限于聚(α-羥基酸)，如聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(-己內(nèi)酯)、聚(三亞甲基碳酸酯)、聚(對(duì)二噁烷酮)、聚(-己內(nèi)酯-共-乙交酯)、聚(乙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)、聚(D，L-丙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)、多芳基化合物、多羥基丁酸酯(PHB)、聚酐、聚(酐-共-酰亞胺)、丙烯-共-富馬酸酯、聚內(nèi)酯、聚酯、聚碳酸酯、多陰離子聚合物、聚酐類、聚酯-酰胺、聚氨基酸、均聚肽、聚(磷腈)、聚(glaxanone)、多糖、和聚(原酸酯)、polyglactin、polyglactic acid、聚醛糖酸、聚丙烯酸、聚烷酸酯；它們的共聚物或混合物，及任何衍生物和改性物。例如，見(jiàn)美國(guó)專利4,563,489和PCT國(guó)際申請(qǐng)#WO/03024316，在此引為參考。載體的其它離子包括纖維素聚合物，例如但不限于烷基纖維素、羥基烷基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基-甲基纖維素、羧甲基纖維素，以及它們的陽(yáng)離子鹽。載體的其它例子包括合成的和天然的生物陶瓷，包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、磷灰石、生物活性玻璃材料、和源自珊瑚的磷灰石。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)2002187104；PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/9731661；PTC國(guó)際申請(qǐng)WO/0071083，在此引為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體還可用組合物涂覆，該組合物包括由溶膠-凝膠技術(shù)產(chǎn)生的生物玻璃和/或磷灰石，或從浸漬技術(shù)產(chǎn)生的，例如但不限于模擬體液，其鈣和磷酸鹽濃度為天然血清濃度的約1.5-7倍，用各種方法調(diào)節(jié)pH范圍為約2.8-7.8，溫度在15-65℃的范圍。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利6,426,114和6,013,591和PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/9117965，在此引為參考。
載體的其它例子包括膠原(如Collastat，Helistat膠原海綿)、透明質(zhì)素、纖維蛋白、脫乙酰殼多糖、海藻酸鹽、和明膠。見(jiàn)，例如，PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/9505846；WO/02085422，在此引為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括肝素結(jié)合劑；包括但不限于肝素樣聚合物，如硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸肝素、巖藻聚糖、海藻酸鹽，或它們的衍生物和具有氨基酸修飾以提高肝素親和力的肽片段。見(jiàn)，例如，Journal of BiologicalChemistry(2003)，278(44)，p.43229-43235，在此引為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基質(zhì)可以是液體、固體或凝膠的形式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基質(zhì)可包括可流動(dòng)凝膠形式的載體?？蛇x擇凝膠以是可注射的，如在希望骨形成的部位經(jīng)過(guò)注射器注射。該凝膠可以是化學(xué)凝膠，可以是由主價(jià)鍵形成，并通過(guò)pH、離子基團(tuán)和/或溶劑濃縮控制的化學(xué)凝膠。該凝膠也可以是物理凝膠，由次級(jí)鍵形成并由溫度和粘度加以控制。凝膠的例子包括但不限于泊洛沙姆(pluronics)、明膠、透明質(zhì)素、膠原、聚丙交酯-聚乙二醇溶液和軛合物、脫乙酰殼多糖、citosan和b-甘油磷酸酯(BST-凝膠)、海藻酸鹽、瓊脂糖、羥基丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧乙烯、在N-甲基-2-吡咯烷酮中的聚丙交酯/乙交酯。見(jiàn)。例如，Anatomical Record(2001)，263(4)，342-349，在此引為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以是光可聚合的，例如通過(guò)用至少約250nm波長(zhǎng)的電磁輻射。光可聚合的聚合物的例子包括聚乙二醇(PEG)丙烯酸酯衍生物、PEG甲基丙烯酸酯衍生物、丙烯富馬酸酯-共-乙二醇、聚乙烯醇衍生物、PEG-共-聚(-羥基酸)二丙烯酸酯大單體，以及改性的多糖如透明質(zhì)酸衍生物和葡聚糖甲基丙烯酸酯。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5,410,016，在此引為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基質(zhì)可包括溫度敏感性載體。例子包括由以下材料制成的載體N-異丙基丙烯酰胺(NiPAM)、或具有降低的低臨界溶液溫度的改性NiPAM，及通過(guò)摻入甲基丙烯酸乙酯和N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺而結(jié)合的增強(qiáng)肽(如NELL1)；或甲基丙烯酸烷酯如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯和甲基丙烯酸十二烷酯。PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/2001070288；美國(guó)專利5,124,151，在此引為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以有一個(gè)表面，該表面由以下物質(zhì)修飾和/或固定化細(xì)胞粘合分子、粘合肽、和粘合肽類似物，這些物質(zhì)可經(jīng)受體介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞-基質(zhì)連接；和/或分子部分，該分子部分可促進(jìn)經(jīng)過(guò)非受體介導(dǎo)的機(jī)制結(jié)合的粘合，例如但不限于聚陽(yáng)離子聚氨基酸-肽(如聚賴氨酸)、聚陰離子聚氨基酸肽、Mefp類粘合分子和其它DOPA-富集的肽(如聚賴氨酸-DOPA)、多糖、和蛋白聚糖。見(jiàn)，例如，PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/2004005421；WO/2003008376；WO/9734016，在此引為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括由螯合劑構(gòu)成的載體，例如但不限于，膠原、明膠、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、聚(乙二醇)、烷基纖維素((包括羥基烷基纖維素)包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基-甲基纖維素和羧甲基纖維素)、血液、纖維蛋白、聚氧乙烯氧化物、硫酸鈣半水合物、磷灰石、羧基乙烯基聚合物、及聚(乙烯醇)。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利6620406，在此引為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括表面活性劑以促進(jìn)NELL1穩(wěn)定性和/或在載體材料中的分布，例如但不限于聚氧酯(如聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20或泊洛沙姆(Pluronic)F-68)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括緩沖劑，例如但不限于，甘氨酸、谷氨酸鹽酸鹽、氯化鈉、胍、肝素、乙酸、琥珀酸、聚山梨酸酯、硫酸葡聚糖、蔗糖、和氨基酸。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5,385,887，在此引為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括上述材料的組合。
例如，載體可以是PLGA/膠原載體膜。該膜可被浸在包含NELL！肽的溶液中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于人體的植入物可包括一個(gè)基質(zhì)，該基質(zhì)包含其量足以在該植入物周圍誘導(dǎo)骨形成的NELL1。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于人體的植入物可包括一個(gè)基質(zhì)，該基質(zhì)的表面包含其量足以在該植入物的周圍誘導(dǎo)骨形成的NELL1。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于人體的植入物可包括一個(gè)基質(zhì)，該基質(zhì)的表面包含骨生成細(xì)胞和其量足以誘導(dǎo)骨形成的NELL1。在一個(gè)實(shí)施方案中，植入物可接種細(xì)胞，所述細(xì)胞包括但不限于自體細(xì)胞、骨生成細(xì)胞或成骨細(xì)胞、表達(dá)NELL1或其它骨生成分子的細(xì)胞。
植入物可包括一個(gè)基質(zhì)，該基質(zhì)被制成篩、針、螺絲、板或人造關(guān)節(jié)的形狀。例如，基質(zhì)可以是牙科或整形外科植入物的形狀，可用NELL1來(lái)促進(jìn)該植入物周圍骨的整合。植入物可包括可吸收的基質(zhì)，如包括膠原的基質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施例中，可將本發(fā)明組合物包含在緩釋藥片中。
NELL1肽可與可接受的載體組合，形成藥理組合物?？山邮艿妮d體可含有生理學(xué)上可接受的化合物，其作用為例如穩(wěn)定該組合物或增加或減少藥劑的吸收。生理學(xué)上可接受的化合物可包括例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化劑如抗壞血酸或谷胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白質(zhì)；降低抗有絲分裂劑清除或水解的組合物；或賦形劑或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。
其它生理學(xué)上可接受的化合物包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑或防腐劑，后者特別用于防止微生物的生長(zhǎng)和作用。各種防腐劑是已知的，包括例如苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，應(yīng)根據(jù)例如給藥的途徑來(lái)選擇載體，包括生理學(xué)上可接受的化合物。
組合物可以各種單位劑型給藥，這取決于給藥的方法。例如，合適的單位劑型可包括粉劑、片劑、丸劑、膠囊。
本發(fā)明組合物可包含NELL1肽溶解在藥學(xué)上可接受的載體中的溶液，如對(duì)于水溶性肽而言，該載體可為水性載體。可使用各種載體，如緩沖的鹽水等。這些溶液是滅菌，一般不含不需要的物質(zhì)。這些組合物可用公知的常規(guī)滅菌技術(shù)來(lái)滅菌。需要時(shí)，組合物可含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以模擬生理?xiàng)l件如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如，乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。
這些配方中NELL1肽的濃度可作大的變動(dòng)，主要根據(jù)與具體選定的給藥模式和病人需要相適應(yīng)的液體的體積、粘度、體重等加以選擇。
劑量方案由主訴的臨床指征以及病人的各種參數(shù)(如體重、年齡、性別)和臨床表現(xiàn)(如受傷的程度、受傷的部位，等等)來(lái)決定。
但是，本發(fā)明中使用的NELL1肽或藥劑的治療有效劑量是對(duì)病人有積極的臨床效果或在細(xì)胞中具有所需效應(yīng)的劑量，如上所述，該藥劑促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、礦化、骨形成等的能力來(lái)測(cè)定?？烧{(diào)節(jié)各個(gè)肽或藥劑的治療有效劑量以達(dá)到所需的臨床效果，而使副作用降低到最小。對(duì)于具體病人，肽或藥劑的劑量可根據(jù)以下因素進(jìn)行選擇給藥途徑、疾病的嚴(yán)重程度、病人的年齡和體重、病人服用的其它藥物、以及在為具體病人確定個(gè)體給藥方案和劑量水平時(shí)主治醫(yī)師通?？紤]的其它因素。
劑型包括在劑型中的藥劑的治療有效劑量可通過(guò)考慮所選用藥劑的類型和給藥途徑來(lái)選擇。劑型可包括藥劑和其它惰性成分的組合，包括藥學(xué)領(lǐng)域公知的有利于向病人投藥的佐劑和藥學(xué)上可接受的載體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括治療病人以誘導(dǎo)骨形成的方法，包含以選定的時(shí)間間隔給予在有效劑型中的治療有效劑量NELL1，以促進(jìn)骨形成。該方法還包含在希望骨形成的部位給予至少一種第二藥劑，包括但不限于TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原，骨，骨基質(zhì)，腱基質(zhì)或韌帶基質(zhì)，骨生成細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，治療病人以誘導(dǎo)骨形成的方法可包括收集哺乳動(dòng)物骨生成細(xì)胞，增加與該骨生成細(xì)胞接觸的NELL1肽的表達(dá)的濃度，向希望骨形成的區(qū)域給予該骨生成細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可望骨形成以修補(bǔ)顱外傷或顱缺損，如在有鎖骨顱骨發(fā)育不全或腭裂的胎兒、嬰兒或成年人中所發(fā)生的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可能在非愈合性骨缺損(也稱為臨界尺寸缺損，其缺損處骨不能再生/愈合)部位可能希望骨形成。臨界尺寸缺損模型作為對(duì)實(shí)施所有骨愈合(包括長(zhǎng)骨骨折)的藥劑的嚴(yán)密試驗(yàn)而被研究，因?yàn)閾?jù)信所有的骨傷愈合都通過(guò)膜的(也稱為膜內(nèi)的)骨形成。例如，長(zhǎng)骨骨折和顱蓋缺損都通過(guò)膜的骨形成而愈合。在一個(gè)實(shí)施方案中，骨形成可能在牙槽骨移植或牙槽嵴增大或牙周骨缺損時(shí)是希望的。在一個(gè)實(shí)施方案中，希望骨形成以促進(jìn)植入物(如關(guān)節(jié)或牙科植入物，或美容外科外植物(onplant))的整合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，骨形成可被用在骨移植物自體、自生或異質(zhì)材料的替換或添加上。
實(shí)施例以下實(shí)施例被用來(lái)說(shuō)明而不是限制要求保護(hù)的本發(fā)明。
實(shí)施例1 NELL肽的表達(dá)將cDNA片段連接到表達(dá)載體PiZT/V5-His(3.4kb)(EcoRV位點(diǎn)，Invitrogen)中，并包括蜂毒肽信號(hào)肽，成熟大鼠NELL1的BamHI-EcoRI cDNA片段和FLAG標(biāo)志序列。圖16描繪了本實(shí)施例所用的cDNA構(gòu)建物的核酸序列，以及相應(yīng)的預(yù)期的肽序列。
使High Five細(xì)胞(BTI-TN-5B1-4)適應(yīng)于無(wú)血清培養(yǎng)基，用NELL1肽表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用Zeocin處理細(xì)胞以選擇只表達(dá)NELL1 FLAG構(gòu)建物的細(xì)胞群落。確認(rèn)存活的細(xì)胞群落是穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體。收集細(xì)胞外培養(yǎng)基，測(cè)試NELL1肽的存在。純化NELL1肽并用于以下的功能測(cè)定。
圖17描繪含純化NELL1肽的UnoQ-洗脫物的CBB-染色SDS-PAGE凝膠。如在此描述的，將培養(yǎng)基加樣到UnoQ柱(Bio-Rad)。圖4B是用抗-FLAG抗體的Western印跡，描繪與蛋白質(zhì)階梯相對(duì)應(yīng)的NELL1-FLAG表達(dá)。肽140kDa(細(xì)胞內(nèi)前體)、130kD(成熟形式；90kDa肽)、400kDa(分泌形式，均三聚體)。在上面的例子中，表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)率為約3mg NELL1肽/L培養(yǎng)基。
相對(duì)于那些根本不表達(dá)或不分泌肽的其它系統(tǒng)(如細(xì)菌表達(dá)，包括酵母)或其肽產(chǎn)率極低的系統(tǒng)(如E.coli融合的肽系統(tǒng)，CHO-dhfr細(xì)胞，＞1Omcg/L)，所述系統(tǒng)(哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞)的產(chǎn)率在大量生產(chǎn)功能肽上是驚人的和遠(yuǎn)為有效的。
重組大鼠NELL1蛋白的表達(dá)和純化。為了用昆蟲(chóng)細(xì)胞生產(chǎn)C-端FLAG-標(biāo)記的NELL1肽，將融合于得自pTB701-NELL1-FLC質(zhì)粒(Kuroda，BBRC)的FLAG表位序列的大鼠NELL1 cDNA插入昆蟲(chóng)表達(dá)載體plZT/V5-His(Invitrogen)構(gòu)建成plZT-NELL1-FLC質(zhì)粒。用PCR方法將NELL1來(lái)源的分泌信號(hào)序列替換為蜜蜂蜂毒肽信號(hào)序列。High Five細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen，培養(yǎng)在High Five無(wú)血清培養(yǎng)基中(Invitrogen)。用FuGene6(Roche)以plZT-NELL1-FLC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HighFive細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用400mg/ml的Zeocin(Invitrogen)選擇細(xì)胞。每3-4天更換選擇培養(yǎng)基，直至建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。用免疫沉淀法和Western印跡分析確認(rèn)NELL1的分泌。發(fā)現(xiàn)High Five細(xì)胞在該培養(yǎng)基中能表達(dá)NELL1肽(140-kDa)。
通過(guò)用UNO Q-1柱(Bio-Rad)的陰離子交換色譜從Zeocin-抗性High Five細(xì)胞的培養(yǎng)基純化大鼠重組NELL1-FLAG肽。NELL1肽以500mM NaCl洗脫。
為了用COS7細(xì)胞生產(chǎn)C-端FLAG-標(biāo)記的NELL1肽，將連接于得自pTB701-NELL1-FLC質(zhì)粒的FLAG表位序列的大鼠NELL1 cDNA插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.1(Invitrogen)構(gòu)建成pcDAN3.1-NELL1-FLC質(zhì)粒。將COS7細(xì)胞在補(bǔ)充10％FBS的DMEM中培養(yǎng)。用電穿孔方法，用內(nèi)源性NELL信號(hào)肽質(zhì)粒以pcDNA3.1-NELL1-FLC轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將培養(yǎng)基進(jìn)行免疫沉淀和Western印跡分析來(lái)檢測(cè)NELL1肽。
圖17C是含NELL1-FLAG的UnoQ洗脫物的CBB-染色SDS-PAGE凝膠。這些表達(dá)研究表明，COS不表達(dá)功能NELL肽，沒(méi)有修飾NELL的N-端(如包括信號(hào)序列)以增加分泌效能。圖17D是來(lái)用抗-FLAG抗體的表明NELL1肽表達(dá)的Western印跡。
重組大鼠NELL2蛋白的表達(dá)和純化為了用昆蟲(chóng)細(xì)胞生產(chǎn)C-端FLAG-標(biāo)記的NELL2肽，將融合于得自pTB701-NELL2-FLC質(zhì)粒的FLAG表位序列的大鼠NELL2 cDNA插入昆蟲(chóng)表達(dá)載體plZT/V5-His(Invitrogen)，構(gòu)建成plZT-NELL2-FLC質(zhì)粒。High Five細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen，在High Five無(wú)血清培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)。用FuGene6(Roche)以plZT-NELL1-FLC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染High Five細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用400mg/ml的Zeocin(Invitrogen)選擇細(xì)胞。每3-4天更換選擇培養(yǎng)基，直至建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。用免疫沉淀法和Western印跡分析確認(rèn)培養(yǎng)基中NELL2的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)High Five細(xì)胞在該培養(yǎng)基中能表達(dá)NELL2肽(140-kDa)。
通過(guò)采用UNO Q-1柱(Bio-Rad)的陰離子交換色譜從Zeocin-抗性High Five細(xì)胞培養(yǎng)基中純化重組的大鼠NELL2-FLAG肽。以500mM NaCl洗脫NELL2-FLAG肽。
實(shí)施例2從培養(yǎng)基中純化NELL2蛋白帶有plZT-FLC-NELL2的High Five細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基(1L)中培養(yǎng)約3天。培養(yǎng)基于3000×g離心5分鐘，收集上清液。加入PMSF至終濃度為1mM。加入飽和硫酸銨溶液(80％飽和度v/v)，溶液在4℃放置1小時(shí)。溶液于15000×g離心30分鐘，收集沉淀物。將沉淀物溶解在4℃ 50ml的20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA中，加樣于陰離子交換色譜UnoQ柱(6ml，Bio-Rad)，該柱已用20mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA于4℃平衡，進(jìn)行FPLC(Amershan-Pharmacia)。用相同的緩沖液充分洗滌柱。
然后梯度(在相同的緩沖液中OM到1.5M NaCl)洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。用抗-FlagM2(Sigma)Ab進(jìn)行Western印跡鑒定NELL2-FLAG級(jí)分。將陽(yáng)性級(jí)分收集在一個(gè)管子中。最終產(chǎn)物在無(wú)縫纖維素管(Wako，截留分子量12000)中對(duì)1L PBS于4℃透析過(guò)夜。產(chǎn)物保存于-70℃。
用SDS-PAGE/CBB染色檢測(cè)NELL2-FLAG肽的純度。圖18表示含純化NELL2肽的UnoQ-洗脫物的CBB染色SDS-PAGE凝膠。欄A表明從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出約130 kDa的肽帶?！癐P”指用于免疫沉淀的抗-FLAG抗體；“WB”指用于Western印跡檢測(cè)的抗-FLAG抗體。
圖19是從Five SFM表達(dá)的NELL1和NELL2的印跡?！癊SF921”指無(wú)血清培養(yǎng)基的商品名；“Five SFM”指培養(yǎng)基的商品名。用于表達(dá)這兩個(gè)NELL蛋白的構(gòu)建物與上述的那些相似。
實(shí)施例3堿性磷酸酯酶活性的增加是成骨細(xì)胞分化的早期細(xì)胞標(biāo)記在一個(gè)研究中，將胎鼠顱蓋細(xì)胞在NELL1(1ng/nl，10ng/nl，100ng/ml，用上述方法產(chǎn)生)或BMP4(100ng/ml)存在下生長(zhǎng)一段時(shí)間。用常規(guī)方法測(cè)定每個(gè)樣品的堿性磷酸酯酶。
圖20是表示在大鼠顱蓋細(xì)胞培養(yǎng)物中作為處理的函數(shù)的堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)的條形圖(“OD”＝光密度)。因此，如堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)測(cè)定所示，在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化上，NELL1處理比BMP4更有效。
圖21是用NELL1處理的大鼠顱蓋細(xì)胞培養(yǎng)物的顯微照片。在不存在抗壞血酸時(shí)，用NELL1處理誘導(dǎo)了堿性磷酸酯酶活性和細(xì)胞微小結(jié)形成，這是成骨細(xì)胞分化和骨形成前體的一個(gè)指征。
實(shí)施例4堿性磷酸酯酶測(cè)定是成骨細(xì)胞分化的早期細(xì)胞標(biāo)記在一個(gè)研究中，將大鼠顱蓋成骨細(xì)胞在24孔板上生長(zhǎng)。將孔分成包含以下物質(zhì)的組NELL1，BMP2，NELL1/BMP2和對(duì)照(無(wú)肽)。處理包括施加100ng/ml的肽。用常規(guī)方法測(cè)定每個(gè)樣品中的堿性磷酸酯酶。
表1

因此，NELL1和BMP對(duì)成骨細(xì)胞分化有加性效應(yīng)，如相對(duì)于對(duì)照或只用一種肽處理的細(xì)胞的堿性磷酸酯酶活性測(cè)定所示。
實(shí)施例5為了研究NELL1表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞分化的作用，用NELL1表達(dá)構(gòu)建物感染MC3T3細(xì)胞微陣列后的3、6、9天，評(píng)估骨相關(guān)基因的表達(dá)，與用β-gal表達(dá)構(gòu)建物感染的細(xì)胞進(jìn)行比較。
表2

在NELL1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中幾種骨相關(guān)基因的表達(dá)水平至少比β-gal對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞高兩倍。因此，由于晚期成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞標(biāo)志(如骨鈣蛋白和骨橋蛋白)被向上調(diào)節(jié)了，所以NELL1表達(dá)和產(chǎn)生提高了成骨細(xì)胞分化。
實(shí)施例6微結(jié)形成，或眾多成骨細(xì)胞的聚集，是成骨細(xì)胞分化和骨形成前體的一個(gè)指征。該過(guò)程被認(rèn)為是由抗壞血酸調(diào)節(jié)的。
為了研究NELL1對(duì)微結(jié)形成的作用，用編碼NELL1的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染MC3T3細(xì)胞，然后在不存在抗壞血酸的情況下生長(zhǎng)。
圖22A和B是形成微結(jié)的表達(dá)NELL1的MC3T3細(xì)胞的顯微照片，為了檢測(cè)堿性磷酸酯酶而染色(B)。NELL1表達(dá)引起堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)，以及微結(jié)形成。
因此，NELL1對(duì)細(xì)胞微結(jié)形成是有活性的，微結(jié)形成是骨形成的前體，NELL1單獨(dú)就足以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。
實(shí)施例7礦化作用，或鈣的細(xì)胞內(nèi)累積是成骨細(xì)胞分化和骨形成前體的一個(gè)指征。為了研究NELL1礦化作用，用編碼腺病毒NELL1的構(gòu)建物或編碼β-gal的對(duì)照構(gòu)建物或反義NELL1病毒轉(zhuǎn)染原代顱蓋細(xì)胞。隨后在培養(yǎng)3，6，9，12天后用Von Kassa染色觀察細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣累積的存在。實(shí)驗(yàn)證明NELL1能加速骨礦化作用。
圖23A-C是用A)反義NELL1病毒、B)β-gal或C)NELL1處理的顱蓋細(xì)胞的顯微照片。對(duì)照細(xì)胞有中等的礦化量，表達(dá)NELL1的細(xì)胞的礦化水平增加，而反義NELL1細(xì)胞中礦化作用被抑制。該“剔除”研究表明，成骨細(xì)胞分化需要NELL1。
圖23D和E是表明培養(yǎng)3、6、9、12天后相對(duì)于對(duì)照GAPFH，骨鈣蛋白和骨橋蛋白mRNA表達(dá)比例的條形圖。在12天后，表達(dá)NELL1的細(xì)胞表達(dá)出了顯著提高的骨鈣蛋白和骨橋蛋白mRNA水平。因此，NELL1在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和礦化的晚期細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)上是有活性的，成骨細(xì)胞分化和礦化是骨形成的前體。
實(shí)施例8使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型來(lái)檢測(cè)NELL1過(guò)度表達(dá)對(duì)骨形成的作用將CMV啟動(dòng)子連接在NELL1 cDNA上，顯微注射到受精卵中。在強(qiáng)效的CMV啟動(dòng)子之下NELL1被全過(guò)度表達(dá)(pan-over-expressed)。
圖24是NELL1轉(zhuǎn)基因小鼠組織的顯微照片，Von Kassa染色。如圖24所示，NELL1轉(zhuǎn)基因小鼠顱蓋過(guò)度生長(zhǎng)，這證實(shí)了NELL1誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)(包括膜骨形成)的能力。
圖25A和B是NELL1轉(zhuǎn)基因小鼠(A)和正常同窩鼠(B)的顱蓋的Von Kassa染色顯微照片。如圖25A所示，NELL1轉(zhuǎn)基因小鼠比正常的同窩鼠提高了礦化作用，這證實(shí)了NELL1在膜骨形成中的作用。
實(shí)施例9使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型來(lái)檢測(cè)NELL1表達(dá)對(duì)Cbfa1缺失引起的發(fā)育缺損的作用為了確定Cbfa1在NELL1調(diào)節(jié)中是否起作用，用含小鼠Cbfa1的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染胎鼠顱蓋細(xì)胞。
圖26是顯示24和48小時(shí)時(shí)Cbfa1轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞的NELL1表達(dá)的印跡。在24小時(shí)內(nèi)Cbfa1轉(zhuǎn)染使NELL1表達(dá)上調(diào)(也使陽(yáng)性對(duì)照骨鈣蛋白上調(diào))。這表明是NELL-1是Cbfa1(一種關(guān)鍵的“成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子)的下游。
圖27A-C是骨骼染色(上，中)和顯微CT(下)的照片。圖27A表示野生型小鼠的正常骨骼圖像?？梢?jiàn)到典型的礦化界線(boarder)(虛線)，前和后囪門(mén)(星號(hào))，以及右冠狀骨縫(箭頭)。還顯示了正常的鎖骨(A-中)。顯微-CT揭示了典型的顱面骨形態(tài)。圖27B表示Cbfa1+/-動(dòng)物的骨骼缺損。特別是，在中線顱蓋缺損側(cè)面染色很差的組織中存在不完全的骨礦化和骨形成(在點(diǎn)線之間)，在冠狀結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)還可見(jiàn)到發(fā)亮(箭頭)。注意到顯著的鎖骨發(fā)育不全(B-中)。圖DC表明Cbfa1+/-+NELLoverexp動(dòng)物的骨骼缺損，證明在骨骼染色和顯微-CT上，相對(duì)于Cbfa1+/-單倍體缺損動(dòng)物，顱蓋骨形成顯著增加。還有，相對(duì)于Cbfa1+/-單倍體缺損動(dòng)物，鎖骨發(fā)育不全程度的顯著減少(中)。注意，在冠狀骨縫處骨重合的恢復(fù)(箭頭)。因此，在轉(zhuǎn)基因小鼠中NELL1過(guò)度表達(dá)挽救了Cbfa1缺失，證實(shí)了NELL1在膜骨形成和軟骨內(nèi)骨形成中的作用。而且，先天骨缺損中NELL1可使骨再生。
實(shí)施例10臨界尺寸缺損是研究藥劑誘導(dǎo)膜內(nèi)骨修復(fù)能力的重要模型。為了研究NELL1對(duì)骨修復(fù)的作用，在野生型成年CD-1雄性小鼠中制造右和左顱骨缺損(3mm)。左缺損(對(duì)照)只用PLGA/膠原載體膜移植，而右缺損用各面浸泡在200ng NELL1或BMP2中的PLGA/膠原載體膜移植。取出顱骨，用顯微-CT分析法觀察。
圖28A是顱蓋缺損治療的照片對(duì)照(左)和BMP2(右)；對(duì)照(左)和NELL1(右)；圖29是顱蓋缺損治療的照片NELL1(左)和BMP2(右)。在NELL1和BMP2兩個(gè)組都觀察到顯著量的骨形成。因此，NELL1表達(dá)在臨界尺寸缺損模型中顯著實(shí)現(xiàn)了骨形成并誘導(dǎo)了骨再生，這證實(shí)了NELL1在膜骨形成中的作用。
實(shí)施例11快速腭伸展(RPE)是研究藥劑誘導(dǎo)膜內(nèi)骨修復(fù)能力的另一個(gè)模型。為了研究NELL1對(duì)骨修復(fù)的作用，將4周齡Sprague Dawley大鼠分成(1)對(duì)照伸展組和(2)NELL1治療伸展組。將大鼠處死，取出它們的腭并在器官培養(yǎng)基中保持生命力。使腭伸展和向治療組加入NELL1為時(shí)9天。
圖30A和B是伸展的腭的照片(A)NELL1治療和(B)對(duì)照。在NELL1和BMP2兩個(gè)組中都觀察到顯著量的骨形成。因此，在RPE模型中NELL1治療顯著實(shí)現(xiàn)了骨形成，證實(shí)了NELL1在膜骨形成中的作用。
實(shí)施例12軟骨內(nèi)骨形成是長(zhǎng)骨發(fā)育中的關(guān)鍵過(guò)程。它包括幾個(gè)階段成軟骨細(xì)胞增生，肥大，凋亡，血管侵入，被成骨細(xì)胞替代。這些階段中任何一個(gè)的加速都會(huì)誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨生長(zhǎng)。
圖31A和B是針對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色的軟骨顯微照片(A)NELL1過(guò)度表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠；(B)野生型小鼠。
如圖31A所示，在NELL1過(guò)度表達(dá)小鼠中，軟骨顯示肥大的成軟骨細(xì)胞和凋亡(用TUNEL ASSAY棕色染色鑒定凋亡細(xì)胞核的萎縮來(lái)表示)。在圖31B中是用TUNEL染色的正常小鼠(野生型)軟骨，只呈現(xiàn)極少凋亡的細(xì)胞，細(xì)胞也不肥大。因此，NELL1能夠誘導(dǎo)軟骨肥大和凋亡，由此誘導(dǎo)了長(zhǎng)骨形成和再生。
實(shí)施例13NELL基質(zhì)制備在體外試驗(yàn)中，將聚丙交酯-共-乙交酯(8515 PLGA；特性粘數(shù)～0.6dL/g，Birmingham Polymers，AL)溶解在氯仿中制成5％溶液，倒入玻璃培養(yǎng)皿并使其緩慢揮發(fā)24小時(shí)。在溶劑提取后，按以下8個(gè)組將膜包被(a)僅有聚合物無(wú)包被；(b)常規(guī)磷灰石(1×SBF接著1.5×SBF)；(c)加速的仿生磷灰石(5×SBF然后為無(wú)-Mg和無(wú)碳酸鹽的5×SBF)(d)纖連蛋白(0.01mg/ml)(e)聚-L-賴氨酸(0.01mg/ml)(f)膠原；(g)Mefp-1(0.01mg/ml)；和(h)膠原和透明質(zhì)素的混合物。每組又分成含NELL1(100ng)的和無(wú)NELL1的組，在非分化培養(yǎng)基(無(wú)抗壞血酸，無(wú)β-甘油磷酸酯)中與原代成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)7天。對(duì)于每種材料，NELL1的組比無(wú)NELL1的組激發(fā)出更高的堿性磷酸酯酶活性。在這些材料中，加速的磷灰石(c組)誘導(dǎo)出最高的堿性磷酸酯酶活性，而聚合物對(duì)照(a組)則最低。
在體內(nèi)試驗(yàn)中，將聚丙交酯-共-乙交酯(8515 PLGA；特性粘數(shù)～0.6dL/g，Birmingham Polymers，AL)溶解在氯仿中并與成孔劑(porogen)(直徑為～100-300μm的蔗糖顆粒)混合，在顆粒浸提和溶劑提取后產(chǎn)生～90％空隙率的PLGA框架。將該多孔框架進(jìn)行氬-等離子體-蝕刻，滅菌，用含200ng NELL1肽的牛I型膠原水性混合物包被，干燥，然后植入成年雄性野生型小鼠的顱蓋缺損中。陽(yáng)性對(duì)照(PLGA/膠原/BMP)和陰性對(duì)照(僅PLGA/膠原，無(wú)生長(zhǎng)因子)也植入類似的缺損中。四周后，顯微-CT分析顯示，陰性對(duì)照框架(僅PLGA/膠原)很少或沒(méi)有誘導(dǎo)骨形成，但含NELL1的和含BMP的框架到第4周時(shí)在缺損上誘導(dǎo)了快速的和完全的礦化。常規(guī)組織學(xué)證實(shí)，該礦化表現(xiàn)出成熟骨骼的經(jīng)典特征。
應(yīng)該理解在此敘述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是為了說(shuō)明的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可據(jù)此進(jìn)行各種修改或改變，這些修改和改變都在本申請(qǐng)精神和所附權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。所有在此引用的出版物、專利和專利申請(qǐng)都整體地結(jié)合在此引為參考。應(yīng)該理解，本發(fā)明還可包含所述實(shí)施方案的任何組合或與已知的方法和組合物的組合。
雖然已經(jīng)敘述了NELL肽表達(dá)系統(tǒng)和NELL肽的骨形成活性的某些實(shí)施方案，但應(yīng)該理解，這些實(shí)施方案所包含的概念也可用于其它的實(shí)施方案中。簡(jiǎn)而言之，本申請(qǐng)的保護(hù)只限于以下的權(quán)利要求書(shū)。
序列表<110>加州大學(xué)董事會(huì)丁淦蘇立奇 科羅達(dá)吳恩明<120>NELL肽表達(dá)系統(tǒng)和NELL肽的骨形成活性<130>38586-332<150>US 60/445,672<151>2003-02-07<160>14<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2433<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(2433)<400>1atg ccg atg gat ttg att tta gtt gtg tgg ttc tgt gtg tgc act gcc 48Met Pro Met Asp Leu Ile Leu Val Val Trp Phe Cys Val Cys Thr Ala1 5 10 15agg aca gtg gtg ggc ttt ggg atg gac cct gac ctt cag atg gat atc 96Arg Thr Val Val Gly Phe Gly Met Asp Pro Asp Leu Gln Met Asp Ile20 25 30gtc acc gag ctt gac ctt gtg aac acc acc ctt gga gtt gct cag gtg 144Val Thr Glu Leu Asp Leu Val Asn Thr Thr Leu Gly Val Ala Gln Val35 40 45tct gga atg cac aat gcc agc aaa gca ttt tta ttt caa gac ata gaa 192Ser Gly Met His Asn Ala Ser Lys Ala Phe Leu Phe Gln Asp Ile Glu50 55 60aga gag atc cat gca gct cct cat gtg agt gag aaa tta att cag ctg 240Arg Glu Ile His Ala Ala Pro His Val Ser Glu Lys Leu Ile Gln Leu65 70 75 80ttc cag aac aag agt gaa ttc acc att ttg gcc act gta cag cag aag 288Phe Gln Asn Lys Ser Glu Phe Thr Ile Leu Ala Thr Val Gln Gln Lys85 90 95cca tcc act tca gga gtg ata ctg tcc att cga gaa ctg gag cac agc 336Pro Ser Thr Ser Gly Val Ile Leu Ser Ile Arg Glu Leu Glu His Ser100 105 110tat ttt gaa ctg gag agc agt ggc ctg agg gat gag att cgg tat cac 384Tyr Phe Glu Leu Glu Ser Ser Gly Leu Arg Asp Glu Ile Arg Tyr His115 120 125tac ata cac aat ggg aag cca agg aca gag gca ctt cct tac cgc atg 432Tyr Ile His Asn Gly Lys Pro Arg Thr Glu Ala Leu Pro Tyr Arg Met130 135 140gca gat gga caa tgg cac aag gtt gca ctg tca gtt agc gcc tct cat 480Ala Asp Gly Gln Trp His Lys Val Ala Leu Ser Val Ser Ala Ser His145 150 155 160ctc ctg ctc cat gtc gac tgt aac agg att tat gag cgt gtg ata gac 528Leu Leu Leu His Val Asp Cys Asn Arg Ile Tyr Glu Arg Val Ile Asp165 170 175cct cca gat acc aac ctt ccc cca gga atc aat tta tgg ctt ggc cag 576Pro Pro Asp Thr Asn Leu Pro Pro Gly Ile Asn Leu Trp Leu Gly Gln
180 185 190cgc aac caa aag cat ggc tta ttc aaa ggg atc atc caa gat ggg aag 624Arg Asn Gln Lys His Gly Leu Phe Lys Gly Ile Ile Gln Asp Gly Lys195 200 205atc atc ttt atg ccg aat gga tat ata aca cag tgt cca aat cta aat 672Ile Ile Phe Met Pro Asn Gly Tyr Ile Thr Gln Cys Pro Asn Leu Asn210 215 220cac act tgc cca acc tgc agt gat ttc tta agc ctg gtg caa gga ata 720His Thr Cys Pro Thr Cys Ser Asp Phe Leu Ser Leu Val Gln Gly Ile225 230 235 240atg gat tta caa gag ctt ttg gec aag atg act gca aaa cta aat tat 768Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ala Lys Met Thr Ala Lys Leu Asn Tyr245 250 255gca gag aca aga ctt agt caa ttg gaa aac tgt cat tgt gag aag act 816Ala Glu Thr Arg Leu Ser Gln Leu Glu Asn Cys His Cys Glu Lys Thr260 265 270tgt caa gtg agt gga ctg ctc tat cga gat caa gac tct tgg gta gat 864Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Tyr Arg Asp Gln Asp Ser Trp Val Asp275 280 285ggt gac cat tgc agg aac tgc act tgc aaa agt ggt gcc gtg gaa tgc 912Gly Asp His Cys Arg Asn Cys Thr Cys Lys Ser Gly Ala Val Glu Cys290 295 300cga agg atg tcc tgt ccc cct ctc aat tgc tcc cca gac tcc ctc cca 960Arg Arg Met Ser Cys Pro Pro Leu Asn Cys Ser Pro Asp Ser Leu Pro305 310 315 320gta cac att gct ggc cag tgc tgt aag gtc tgc cga cca aaa tgt atc 1008Val His Ile Ala Gly Gln Cys Cys Lys Val Cys Arg Pro Lys Cys Ile325 330 335tat gga gga aaa gtt ctt gca gaa ggc cag cgg att tta acc aag agc 1056Tyr Gly Gly Lys Val Leu Ala Glu Gly Gln Arg Ile Leu Thr Lys Ser340 345 350tgt cgg gaa tgc cga ggt gga gtt tta gta aaa att aca gaa atg tgt 1104Cys Arg Glu Cys Arg Gly Gly Val Leu Val Lys Ile Thr Glu Met Cys355 360 365cct cct ttg aac tgc tca gaa aag gat cac att ctt cct gag aat cag 1152Pro Pro Leu Asn Cys Ser Glu Lys Asp His Ile Leu Pro Glu Asn Gln370 375 380tgc tgc cgt gtc tgt aga ggt cat aac ttt tgt gca gaa gga cct aaa 1200Cys Cys Arg Val Cys Arg Gly His Asn Phe Cys Ala Glu Gly Pro Lys385 390 395 400tgt ggt gaa aac tca gag tgc aaa aac tgg aat aca aaa gct act tgt 1248Cys Gly Glu Asn Ser Glu Cys Lys Asn Trp Asn Thr Lys Ala Thr Cys405 410 415gag tgc aag agt ggt tac atc tct gtc cag gga gac tct gcc tac tgt 1296Glu Cys Lys Ser Gly Tyr Ile Ser Val Gln Gly Asp Ser Ala Tyr Cys420 425 430gaa gat att gat gag tgt gca gct aag atg cat tac tgt cat gcc aat 1344Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ala Lys Met His Tyr Cys His Ala Asn435 440 445act gtg tgt gtc aac ctt cct ggg tta tat cgc tgt gac tgt gtc cca 1392Thr Val Cys Val Asn Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Cys Asp Cys Val Pro450 455 460gga tac att cgt gtg gat gac ttc tct tgt aca gaa cac gat gaa tgt 1440Gly Tyr Ile Arg Val Asp Asp Phc Ser Cys Thr Glu His Asp Glu Cys465 470 475 480ggc agc ggc cag cac aac tgt gat gag aat gcc atc tgc acc aac act 1488Gly Ser Gly Gln His Asn Cys Asp Glu Asn Ala Ile Cys Thr Asn Thr
485 490 495gtc cag gga cac agc tgc acc tgc aaa ccg ggc tac gtg ggg aac ggg 1536Val Gln Gly His Ser Cys Thr Cys Lys Pro Gly Tyr Val Gly Asn Gly500 505 510acc atc tgc aga gct ttc tgt gaa gag ggc tgc aga tac ggt gga acg 1584Thr Ile Cys Arg Ala Phe Cys Glu Glu Gly Cys Arg Tyr Gly Gly Thr515 520 525tgt gtg gct ccc aac aaa tgt gtc tgt cca tct gga ttc aca gga agc 1632Cys Val Ala Pro Asn Lys Cys Val Cys Pro Ser Gly Phe Thr Gly Ser530 535 540cac tgc gag aaa gat att gat gaa tgt tca gag gga atc att gag tgc 1680His Cys Glu Lys Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu Gly Ile Ile Glu Cys545 550 555 560cac aac cat tcc cgc tgc gtt aac ctg cca ggg tgg tac cac tgt gag 1728His Asn His Ser Arg Cys Val Asn Leu Pro Gly Trp Tyr His Cys Glu565 570 575tgc aga agc ggt ttc cat gac gat ggg acc tat tca ctg tcc ggg gag 1776Cys Arg Ser Gly Phe His Asp Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Gly Glu580 585 590tcc tgt att gac att gat gaa tgt gcc tta aga act cac acc tgt tgg 1824Ser Cys Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala Leu Arg Thr His Thr Cys Trp595 600 605aac gat tct gcc tgc atc aac ctg gca ggg ggt ttt gac tgt ctc tgc 1872Asn Asp Ser Ala Cys Ile Asn Leu Ala Gly Gly Phe Asp Cys Leu Cys610 615 620ccc tct ggg ccc tcc tgc tct ggt gac tgt cct cat gaa ggg ggg ctg 1920Pro Ser Gly Pro Ser Cys Ser Gly Asp Cys Pro His Glu Gly Gly Leu625 630 635 640aag cac aat ggc cag gtg tgg acc ttg aaa gaa gac agg tgt tct gtc 1968Lys His Asn Gly Gln Val Trp Thr Leu Lys Glu Asp Arg Cys Ser Val645 650 655tgc tcc tgc aag gat ggc aag ata ttc tgc cga cgg aca gct tgt gat 2016Cys Ser Cys Lys Asp Gly Lys Ile Phe Cys Arg Arg Thr Ala Cys Asp660 665 670tgc cag aat cca agt gct gac cta ttc tgt tgc cca gaa tgt gac acc 2064Cys Gln Asn Pro Ser Ala Asp Leu Phe Cys Cys Pro Glu Cys Asp Thr675 680 685aga gtc aca agt caa tgt tta gac caa aat ggt cac aag ctg tat cga 2112Arg Val Thr Ser Gln Cys Leu Asp Gln Asn Gly His Lys Leu Tyr Arg690 695 700agt gga gac aat tgg acc cat agc tgt cag cag tgt cgg tgt ctg gaa 2160Ser Gly Asp Asn Trp Thr His Ser Cys Gln Gln Cys Arg Cys Leu Glu705 710 715 720gga gag gta gat tgc tgg cca crc act tgc ccc aac ttg agc tgt gag 2208Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro Leu Thr Cys Pro Asn Leu Ser Cys Glu725 730 735tat aca gct atc tta gaa ggg gaa tgt tgt ccc cgc tgt gtc agt gac 2256Tyr Thr Ala Ile Leu Glu Gly Glu Cys Cys Pro Arg Cys Val Ser Asp740 745 750ccc tgc cta gct gat aac atc acc tat gac atc aga aaa act tgc ctg 2304Pro Cys Leu Ala Asp Asn Ile Thr Tyr Asp Ile Arg Lys Thr Cys Leu755 760 765gac agc tat ggt gtt tca cgg ctt agt ggc tca gtg tgg acg atg gct 2352Asp Ser Tyr Gly Val Ser Arg Leu Ser Gly Ser Val Trp Thr Met Ala770 775 780gga tct ccc tgc aca acc tgt aaa tgc aag aat gga aga gtc tgt tgt 2400Gly Ser Pro Cys Thr Thr Cys Lys Cys Lys Asn Gly Arg Val Cys Cys
785 790 795800tct gtg gat ttt gag tgt ctt caa aat aat tga 2433Ser Val Asp Phe Glu Cys Leu Gln Asn Asn *805 810<210>2<211>810<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Pro Met Asp Leu Ile Leu Val Val Trp Phe Cys Val Cys Thr Ala15 10 15Arg Thr Val Val Gly Phe Gly Met Asp Pro Asp Leu Gln Met Asp Ile20 25 30Val Thr Glu Leu Asp Leu Val Asn Thr Thr Leu Gly Val Ala Gln Val35 40 45Ser Gly Met His Asn Ala Ser Lys Ala Phe Leu Phe Gln Asp Ile Glu50 55 60Arg Glu Ile His Ala Ala Pro His Val Ser Glu Lys Ieu Ile Gln Leu65 70 75 80Phe Gln Asn Lys Ser Glu Phe Thr Ile Leu Ala Thr Val Gln Gln Lys85 90 95Pro Ser Thr Ser Gly Val Ile Leu Ser Ile Arg Glu Leu Glu His Ser100 105 110Tyr Phe Glu Leu Glu Ser Ser Gly Leu Arg Asp Glu Ile Arg Tyr His115 120 125Tyr Ile His Asn Gly Lys Pro Arg Thr Glu Ala Leu Pro Tyr Arg Met130 135 140Ala Asp Gly Gln Trp His Lys Val Ala Leu Ser Val Ser Ala Ser His145 150 155 160Leu Leu Leu His Val Asp Cys Asn Arg Ile Tyr Glu Arg Val Ile Asp165 170 175Pro Pro Asp Thr Asn Leu Pro Pro Gly Ile Asn Leu Trp Leu Gly Gln180 185 190Arg Asn Gln Lys His Gly Leu Phe Lys Gly Ile Ile Gln Asp Gly Lys195 200 205Ile Ile Phe Met Pro Asn Gly Tyr Ile Thr Gln Cys Pro Asn Leu Asn210 215 220His Thr Cys Pro Thr Cys Ser Asp Phe Leu Ser Leu Val Gln Gly Ile225 230 235 240Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ala Lys Met Thr Ala Lys Leu Asn Tyr245 250 255Ala Glu Thr Arg Leu Ser Gln Leu Glu Asn Cys His Cys Glu Lys Thr260 265 270Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Tyr Arg Asp Gln Asp Ser Trp Val Asp275 280 285Gly Asp His Cys Arg Asn Cys Thr Cys Lys Ser Gly Ala Val Glu Cys290 295 300Arg Arg Met Ser Cys Pro Pro Leu Asn Cys Ser Pro Asp Ser Leu Pro305 310 315 320Val His Ile Ala Gly Gln Cys Cys Lys Val Cys Arg Pro Lys Cys Ile325 330 335Tyr Gly Gly Lys Val Leu Ala Glu Gly Gln Arg Ile Leu Thr Lys Ser340 345 350Cys Arg Glu Cys Arg Gly Gly Val Leu Val Lys Ile Thr Glu Met Cys355 360 365Pro Pro Leu Asn Cys Ser Glu Lys Asp His Ile Leu Pro Glu Asn Gln370 375 380Cys Cys Arg Val Cys Arg Gly His Asn Phe Cys Ala Glu Gly Pro Lys385 390 395 400Cys Gly Glu Asn Ser Glu Cys Lys Asn Trp Asn Thr Lys Ala Thr Cys405 410 415Glu Cys Lys Ser Gly Tyr Ile Ser Val Gln Gly Asp Ser Ala Tyr Cys420 425 430Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ala Lys Met His Tyr Cys His Ala Asn435 440 445Thr Val Cys Val Asn Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Cys Asp Cys Val Pro450 455 460Gly Tyr Ile Arg Val Asp Asp Phc Ser Cys Thr Glu His Asp Glu Cys465 470 475 480Gly Ser Gly Gln His Asn Cys Asp Glu Asn Ala Ile Cys Thr Asn Thr485 490 495Val Gln Gly His Ser Cys Thr Cys Lys Pro Gly Tyr Val Gly Asn Gly
500 505 510Thr Ile Cys Arg Ala Phe Cys Glu Glu Gly Cys Arg Tyr Gly Gly Thr515 520 525Cys Val Ala Pro Asn Lys Cys Val Cys Pro Ser Gly Phe Thr Gly Ser530 535 540His Cys Glu Lys Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu Gly Ile Ile Glu Cys545 550 555 560His Asn His Ser Arg Cys Val Asn Leu Pro Gly Trp Tyr His Cys Glu565 570 575Cys Arg Ser Gly Phe His Asp Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Gly Glu580 585 590Ser Cys Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala Leu Arg Thr His Thr Cys Trp595 600 605Asn Asp Ser Ala Cys Ile Asn Leu Ala Gly Gly Phe Asp Cys Leu Cys610 615 620Pro Ser Gly Pro Ser Cys Ser Gly Asp Cys Pro His Glu Gly Gly Leu625 630 635 610Lys His Asn Gly Gln Val Trp Thr Leu Lys Glu Asp Arg Cys Ser Val645 650 655Cys Ser Cys Lys Asp Gly Lys Ile Phe Cys Arg Arg Thr Ala Cys Asp660 665 670Cys Gln Asn Pro Ser Ala Asp Leu Phe Cys Cys Pro Glu Cys Asp Thr675 680 685Arg Val Thr Ser Gln Cys Leu Asp Gln Asn Gly His Lys Leu Tyr Arg690 695 700Ser Gly Asp Asn Trp Thr His Ser Cys Gln Gln Cys Arg Cys Leu Glu705 710 715 720Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro Leu Thr Cys Pro Asn Leu Ser Cys Glu725 730 735Tyr Thr Ala Ile Leu Glu Gly Glu Cys Cys Pro Arg Cys Val Ser Asp740 745 750Pro Cys Leu Ala Asp Asn Ile Thr Tyr Asp Ile Arg Lys Thr Cys Leu755 760 765Asp Ser Tyr Gly Val Ser Arg Leu Ser Gly Ser Val Trp Thr Met Ala770 775 780Gly Ser Pro Cys Thr Thr Cys Lys Cys Lys Asn Gly Arg Val Cys Cys785 790 795 800Ser Val Asp Phe Glu Cys Leu Gln Asn Asn805 810<210>3<211>2433<212>DNA<213>鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(2433)<400>3atg ceg atg gat gtg att tta gtt ttg tgg ttc tgt gta tgc acc gcc 48Met Pro Met Asp Val Ile Leu Val Leu Trp Phe Cys Val Cys Thr Ala1 5 10 15agg aca gtg ttg ggc ttt ggg atg gac cct gac ctt cag ctg gac atc 96Arg Thr Val Leu Gly Phe Gly Met Asp Pro Asp Leu Gln Leu Asp Ile20 25 30atc tca gag ctc gac ctg gtg aac acc acc ctg gga gtc acg cag gtg 144Ile Ser Glu Leu Asp Leu Val Asn Thr Thr Leu Gly Val Thr Gln Val35 40 45gct gga ctg cac aac gcc agt aaa gca ttt cta ttt caa gat gta cag 192Ala Gly Leu His Asn Ala Ser Lys Ala Phe Leu Phe Gln Asp Val Gln50 55 60aga gag atc cat tcg gcc cct cac gtg agt gag aag ctg atc cag cta 240Arg Glu Ile His Ser Ala Pro His Val Ser Glu Lys Leu Ile Gln Leu65 70 75 80ttc cgg aat aag agc gag ttc acc ttt ttg gct aca gtg cag cag aaa 288Phe Arg Asn Lys Ser Glu Phe Thr Phc Leu Ala Thr Val Gln Gln Lys85 90 95cca tcc acc tca ggg gtg ata ctg tcc atc cgg gag ctg gag cac agc 336Pro Ser Thr Ser Gly Val Ile Leu Ser Ile Arg Glu Leu Glu His Ser
100105 110tat ttt gaa ctg gag agc agt ggc cca aga gaa gag ata cgc tac cat 384Tyr Phe Glu Leu Glu Ser Ser Gly Pro Arg Glu Glu Ile Arg Tyr His115 120 125tac ata cat ggt gga aag ccc agg act gag gcc ctt ccc tac cgc atg 432Tyr Ile His Gly Gly Lys Pro Arg Thr Glu Ala Leu Pro Tyr Arg Met130 135 140gca gac gga caa tgg cac aag gtc gcg ctg tca gtg agc gcc tct cac 480Ala Asp Gly Gln Trp His Lys Val Ala Leu Ser Val Ser Ala Ser His145 150 155 160ctc ctg ctc cac atc gac tgc aat agg att tac gag cgt gtg ata gac 528Leu Leu Leu His Ile Asp Cys Asn Arg Ile Tyr Glu Arg Val Ile Asp165 170 175cct ccg gag acc aac ct cct cca gga agc aat ctg tgg ctt ggg caa 576Pro Pro Glu Thr Asn Leu Pro Pro Gly Ser Asn Leu Trp Leu Gly Gln180 185 190cgt aac caa aag cat ggc ttt ttc aaa gga atc atc caa gat ggt aag 624Arg Asn Gln Lys His Gly Phe Phe Lys Gly Ile Ile Gln Asp Gly Lys195 200 205atc atc ttc atg ccg aat ggt ttc atc aca cag tgt ccc aac ctc aat 672Ile Ile Phe Met Pro Asn Gly Phe IIe Thr Gln Cys Pro Asn Leu Asn210 215 220cgc act tgc cca aca tgc agt gac ttc ctg agc ctg gtt caa gga ata 720Arg Thr Cys Pro Thr Cys Ser Asp Phe Leu Ser Leu Val Gln Gly Ile225 230 235 240atg gat ttg caa gag ctt ttg gcc aag atg act gca aaa ctg aat tat 768Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ala Lys Met Thr Ala Lys Leu Asn Tyr245 250 255gca gag acg aga ctt ggt caa ctg gaa aat tgc cac tgt gag aag acc 816Ala Glu Thr Arg Leu Gly Gln Leu Glu Asn Cys His Cys Glu Lys Thr260 265 270tgc caa gtg agt ggg ctg ctc tac agg gac caa gac tcc tgg gtg gat 864Cys G1n Val Ser Gly Leu Leu Tyr Arg Asp Gln Asp Ser Trp Val Asp275 280 285ggt gac aac tgt ggg aac tgc acg tgc aaa agt ggt gcc gtg gag tgc 912Gly Asp Asn Cys Gly Asn Cys Thr Cys Lys Ser Gly Ala Val Glu Cys290 295 300cgc agg atg tcc tgt ccc ccg ctc aac tgt tcc ccg gac tca ctt cct 960Arg Arg Met Ser Cys Pro Pro Leu Asn Cys Ser Pro Asp Ser Leu Pro305 310 315 320gtg cac att tcc ggc cag tgt tgt aaa gtt tgc aga cca aaa tgt atc 1008Val His Ile Ser Gly Gln Cys Cys Lys Val Cys Arg Pro Lys Cys Ile325 330 335tat gga gga aaa gtt ctt gct gag ggc cag cgg att tta acc aag acc 1056Tyr Gly Gly Lys Val Leu Ala Glu Gly Gln Arg Ile Leu Thr Lys Thr340 345 350tgc cgg gaa t gt cga ggt gga gtc ttg gta aaa ate aca gaa gct tgc1104Cys Arg Glu Cys Arg Gly Gly Val Leu Val Lys Ile Thr Glu Ala Cys355 360 365cct cct ttg aac tgc tca gca aag gat cat att ctt cca gag aat cag 1152Pro Pro Leu Asn Cys Set Ala Lys Asp His Ile Leu Pro Glu Asn Gln370 375 380tgc tgc agg gtc tgc cca ggt cat aac ttc tgt gca gaa gca cct aag 1200Cys Cys Arg Val Cys Pro Gly His Asn Phe Cys Ala Glu Ala Pro Lys385 390 395 400tgc gga gaa aac tcg gaa tgc aaa aat tgg aat aca aaa gca acc tgt 1248Cys Gly Glu Asn Ser Glu Cys Lys Asn Trp Asn Thr Lys Ala Thr Cys
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cga gct gaa cag cga atg aat aga ttg gat cag tgc tat tgt gaa agg 816Arg Ala Glu Gln Arg Met Asn Arg Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg260 265 270act tgc acc atg aag gga acc acc tac cga gaa ttt gag tcc tgg ata 864Thr Cys Thr Met Lys Gly Thr Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Ile275 280 285gac ggc tgt aag aac tgc aca tgc ctg aat gga acc atc cag tgt gaa 912Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Leu Asn Gly Thr Ile Gln Cys Glu290 295 300act cta atc tgc cca aat cct gac tgc cca ctt aag tcg gct ctt gcg960Thr Leu Ile Cys Pro Asn Pro Asp Cys Pro Leu Lys Ser Ala Leu Ala305 310 315 320tat gtg gat ggc aaa tgc tgt aag gaa tgc aaa tcg ara tgc caa ttt 1008Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Lys Ser Ile Cys Gln Phe325 330 335caa gga cga acc tac ttt gaa gga gaa aga aat aca gtc tat tcc tct 1056Gln Gly Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Glu Arg Asn Thr Val Tyr Ser Ser340 345 350tct gga gta tgt gtt ctc tat gag tgc aag gac cag acc atg aaa ctt 1104Ser Gly Val Cys Val Leu Tyr Glu Cys Lys Asp Gln Thr Met Lys Leu355 360 365gtt gag agt tca ggc tgt cca gct ttg gat tgt cca gag tct cat cag 1152Val Glu Ser Ser Gly Cys Pro Ala Leu Asp Cys Pro Glu Ser His Gln370 375 380ata acc ttg tct cac agc tgt tgc aaa gtt tgt aaa ggt tat gac ttt 1200Ile Thr Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Val Cys Lys Gly Tyr Asp Phe385 390 395 400tgt tct gaa agg cat aac tgc atg gag aat tcc atc tgc aga aat ctg 1248Cys Ser Glu Arg His Asn Cys Met Glu Asn Ser Ile Cys Arg Asn Leu405 410 415aat gac agg gct gtt tgt agc tgt cga gat ggt ttt agg gct ctt cga 1296Asn Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg420 425 430gag gat aat gcc tac tgt gaa gac atc gat gag tgt gct gaa ggg cgc 1344Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Glu Gly Arg435 440 445cat tac tgt cgt gaa aat aca atg tgt gtc aac acc ccg ggt tct ttt 1392His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe450 455 460atg tgc atc tgc aaa act gga tac atc aga att gat gat tat tca tgt 1440Met Cys Ile Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp Tyr Ser Cys465 470 475 480aca gaa cat gat gag tgt atc aca aat cag cac aac tgt gat gaa aat 1488Thr Glu His Asp Glu Cys Ile Thr Asn Gln His Asn Cys Asp Glu Asn485 490 495gct tta tgc ttc aac act gtt gga gga cac aac tgt gtt tgc aag ccg 1536Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val Cys Lys Pro500 505 510ggc tat aca ggg aat gga acg aca tgc aaa gca ttt tgc aaa gat ggc 1584Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Thr Cys Lys Ala Phe Cys Lys Asp Gly515 520 525tgt agg aat gga gga gcc tgt att gcc gct aat gtg tgt gcc tgc cca 1632Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ala Asn Val Cys Ala Cys Pro530 535 540caa ggc ttc act gga ccc agc tgt gaa acg gac att gat gaa tgc tct 1680Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser545 550 555 560
gat ggt ttt gtt caa tgt gac agt cgt gct aat tgc att aac ctg cct 1728Asp Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile Asn Leu Pro565 570 575gga tgg tac cac tgt gag tgc aga gat ggc tac cat gac aat ggg atg 1776Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp Asn Gly Met580 585 590ttt tca cca agt gga gaa tcg tgt gaa gat att gat gag tgt ggg acc 1824Phe Ser Pro Ser Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gly Thr595 600 605ggg agg cac agc tgt gcc aat gat acc att tgc ttc aat ttg gat ggc 1872Gly Arg His Ser Cys Ala Asn Asp Thr Ile Cys Phe Asn Leu Asp Gly610 615 620gga tat gat tgt cga tgt cct cat gga aag aat tgc aca ggg gac tgc 1920Gly Tyr Asp Cys Arg Cys Pro His Gly Lys Asn Cys Thr Gly Asp Cys625 630 635 640atc cat gat gga aaa gtt aag cac aat ggt cag att tgg gtg ttg gaa 1968Ile His Asp Gly Lys Val Lys His Asn Gly Gln Ile Trp Val Leu Glu645 650 655aat gac agg tgc tct gtg tgc tca tgt cag aat gga ttc gtt atg tgt 2016Asn Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Cys Gln Asn Gly Phe Val Met Cys660 665 670cga cgg atg gtc tgt gac tgt gag aat ccc aca gtt gat ctt ttt tgc 2064Arg Arg Met Val Cys Asp Cys Glu Asn Pro Thr Val Asp Leu Phe Cys675 680 685tgc cct gaa tgt gac cca agg ctt agt agt cag tgc ctc cat caa aat 2112Cys Pro Glu Cys Asp Pro Arg Leu Ser Ser Gln Cys Leu His Gln Asn690 695 700ggg gaa act ttg tat aac agt ggt gac acc tgg gtc cag aat tgt caa 2160Gly Glu Thr Leu Tyr Asn Ser Gly Asp Thr Trp Val Gln Asn Cys Gln705 710715 720cag tgc cgc tgc ttg caa ggg gaa gtt gat tgt tgg ccc ctg cct tgc 2208Gln Cys Arg Cys Leu Gln Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro Leu Pro Cys725 730 735cca gat gtg gag tgt gaa ttc agc att ctc cca gag aat gag tgc tgc 2256Pho Asp Val Glu Cys Glu Phe Ser Ile Leu Pro Glu Asn Glu Cys Cys740 745 750ccg cgc tgt gtc aca gac cct tgc cag gct gac acc atc cgc aat gac 2304Pro Arg Cys Val Thr Asp Pro Cys Gln Ala Asp Thr Ile Arg Asn Asp755 760 765atc acc aag act tgc ctg gac gaa atg aat gtg gtt cgc ttc acc ggg 2352Ile Thr Lys Thr Cys Leu Asp Glu Met Asn Val Val Arg Phc Thr Gly770 775 780tcc tct tgg atc aaa cat ggc act gag tgt act crc tgc cag tgc aag 2400Ser Ser Trp Ile Lys His Gly Thr Glu Cys Thr Leu Cys Gln Cys Lys785 790 795 800aat ggc cac atc tgt tgc tca gtg gat cca cag tgc ctt cag gaa ctg 2448Asn Gly His Ile Cys Cys Ser Val Asp Pro Gln Cys Leu Gln Glu Leu805 810 815tga 2451*<210>8<211>816<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Leu Ile Phe Gly Leu
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<221>CDS<222>(1)...(2451)<400>9atg gaa tcc cgg gta tta ctg aga acg ttc tgc gtg atc ctc ggg ctc 48Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Val Ile Leu Gly Leu1 5 10 15gaa gcg gtt tgg gga ctt ggt gtg gac ccc tcc cta cag att gac gtc 96Glu Ala Val Trp Gly Leu Gly Val Asp Pro Set Leu Gln Ile Asp Val20 25 30tta tca gag tta gaa ctt ggg gag tcc aca get gga gtg cgc caa gtc 144Leu Ser Glu Leu Glu Leu Gly Glu Ser Thr Ala Gly Val Arg Gln Val35 40 45cea gga ctg cat aat ggg acg aaa gcc ttc ctc ttc caa gat tcc ccc 192Pro Gly Leu His Asn Gly Thr Lys Ala Phe Leu Phe Gln Asp Set Pro50 55 60aga agc ata aaa gca ccc att gct aca gct gag cgg ttt ttc cag aag 240Arg Ser Ile Lys Ala Pro Ile Ala Thr Ala Glu Arg Phe Phe Gln Lys65 70 75 80ctg agg aat aaa cac gag ttc aca att ctg gtg acc ctg aaa cag atc 288Leu Arg Asn Lys His Glu Phe Thr Ile Leu Val Thr Leu Lys Gln Ile85 90 95cac tta aat tcg gga gtc att ctc tcc atc cac cae ttg gat cac agg 336His Leu Asn Ser Gly Val Ile Leu Set Ile His His Leu Asp His Arg100 105 110tac ctg gaa ctg gaa agc age ggc cac cgg aat gag atc aga ctg cat 384Tyr Leu Glu Leu Glu Ser Ser Gly His Arg Asn Glu Ile Arg Leu His115 120 125tac cgc tct gga act cac cgc ccg cac acg gaa gtg ttt cct tat att 432Tyr Arg Ser Gly Thr His Arg Pro His Thr Glu Val Phe Pro Tyr Ile130 135 140ttg gct gat gcc aag tgg cac aag ctc tcc tta gcc ttc agt gcc tcc 480Leu Ala Asp Ala Lys Trp His Lys Leu Ser Leu Ala Phe Ser Ala Ser145 150 155 160
cac tta att tta cac atc gac tgc aac aag atc tat gaa cga gtg gtg 528His Leu Ile Leu His Ile Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Val165 170 175gaa atg cct tct aca gac ttg cct ctg ggc acc aca ttt tgg ttg gga 576Glt Met Pro Set Thr Asp Leu Pro Leu Gly Thr Thr Phe Trp Leu Gly180 185 190cag aga aat aac gca cac ggg tat ttt aag gga ata atg caa gat gtg 624Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met Gln Asp Val195 200 205caa tta ctt gtc atg ccc cag ggg ttc atc gct cag tgc ccg gat ctt 672Gln Leu Leu Val Met Pro Glu G1y Phe Ile Ala Gln Cys Pro Asp Leu210 215 220aat cga acc tgt cca aca tgc aac gac ttc cat ggg ctt gtg cag aaa 720Asn Arg Thr Cys Pro Thr Cys Asn Asp Phe His Gly Leu Val Gln Lys225 230 235 240atc atg gag ctg cag gac att tta tcg aag acg tca gcc aag ttg tct 768Ile Met Glu Leu Gln Asp Ile Leu Ser Lys Thr Ser Ala Lys Leu Ser245 250 255aga gct gaa caa cga atg aac agg ctg gat cag tgc tac tgt gag cgg 816Arg Ala Glu Gln Arg Met Asn Arg Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg260 265 270acg tgc acc atg aag gga gcc acc tac cgg gag ttc gag tcc tgg aca 864Thr Cys Thr Met Lys Gly Ala Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Thr275 280 285gac ggc tgc aag aac tgc aca tgc ttg aat ggg acc atc cag tgc gag 912Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Leu Asn Gly Thr Ile Gln Cys Glu290 295 300act ctg gtc tgc cct gct ccc gac tgc ccg gct aaa tcg gct cca gcg 960Thr Leu Val Cys Pro Ala Pro Asp Cys Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala305 310 315 320tac gtg gat ggc ag tgc tgt aag gag tgc aag tcc acc tgc cag ttc 1008Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Lys Ser Thr Cys Gln Phe325 330 335cag ggg cgg agc tac ttt gag gga gaa agg agc aca gtc ttc tca gct 1056Gln Gly Arg Ser Tyr Phe Glu Gly Glu Arg Ser Thr Val Phe Ser Ala340 345 350tcc gga atg tgc gte ttg tat gaa tgc aag gat cag acc atg aag ctt 1104Ser Gly Met Cys Val Leu Tyr Glu Cys Lys Asp Gln Thr Met Lys Leu355 360 365gtt gag aac gcc ggc tgc ccg gct tta gat tgc ccc gag tct cat cag 1152Val Glu Asn Ala Gly Cys Pro Ala Leu Asp Cys Pro Glu Ser His Gln370 375 380atc gcc ttg tct cac agc tgc tgc aag gtt tgc aaa ggt tat gac ttc 1200Ile Ala Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Val Cys Lys Gly Tyr Asp Phe385 390 395 400tgt tct gag aag cat aca tgc atg gag aac tca gtc tgc agg aac ctg 1248Cys Ser Glu Lys His Thr Cys Met Glu Asn Ser Val Cys Arg Asn Leu405 410 415aac gac agg gca gtg tgc agc tgc cgg gat ggt ttc cgg gcc ctc cgg 1296Asn Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg420 425 430gag gac aat gcc tac tgt gaa gac att gac gag tgt gca gag ggg cgc 1344Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Glu Gly Arg435 440 445cat tac tgc cgt gag aac acc atg tgt gtg aac aca ccg ggc tct ttc 1392His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe450 455 460
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tac tca tct tct gga atg tgt gtc tta tat gaa tgc aag gat cag acc 1104Tyr Ser Ser Ser Gly Met Cys Val Leu Tyr Glu Cys Lys Asp Gln Thr355 360 365atg aag ctt gtt gag aac att ggc tgc cca ccc tta gat tgt ccc gag 1152Met Lys Leu Val Glu Asn Ile Gly Cys Pro Pro Leu Asp Cys Pro Glu370 375 380tct cat cag att gcc ttg tct cac agc tgc tgc aag gtt tgt aaa ggt 1200Ser His Gln Ile Ala Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Val Cys Lys Gly385 390 395 400tat gac ttc tgt tct gag aag cat acc tgc atg gag aac tcg gtc tgc 1248Tyr Asp Phe Cys Ser Glu Lys His Thr Cys Met Glu Asn Set Val Cys405 410 415agg aac ctg aac gac agg gtt gtg tgc agc tgc agg gat ggt ttt cgg 1296Arg Asn Leu Asn Asp Arg Val Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg420 425 430gct ctc cga gag gac aac gcc tac tgt gaa gac att gac gag tgt gca 1344Ala Leu Arg Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala435 440 445gaa ggg cgc cat tac tgc cgt gag aac acc atg tgt gtg aat aca cct 1392Glu Gly Arg His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro450 455 460ggt tct ttc atg tgt gtc tgc aaa act ggg tac atc agg atc gac gat1440Gly Ser Phe Met Cys Val Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp465 470 475 480tac tca tgt aca gaa cat gat gag tgt ctc aca acc cag cac aat tgt 1488Tyr Ser Cys Thr Glu His Asp Glu Cys Leu Thr Thr Gln His Asn Cys485 490 495gat gaa aac gct ttg tgc ttt aac act gtt gga gga cac aac tgt gtc 1536Asp Glu Asn Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val500 505 510tgc aag cct ggc tac acc ggg aat gga acc acg tgc aaa gct ttc tgc 1584Cys Lys Pro Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Thr Cys Lys Ala Phe Cys515 520 525aaa gat ggc tgt aga aac gga gga gcg tgc att gct gcc aat gtg tgt 1632Lys Asp Gly Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ala Asn Val Cys530 535 540gcc tgc cca caa ggc ttc acg gga ccc agc tgt gag aca gac att gac 1680Ala Cys Pro Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp545 550 555 560gag tgc tct gag ggc ttt gtt cag tgt gac agc cgt gcc aac tgc atc 1728Glu Cys Ser Glu Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile565 570 575aac ctg cct ggg tgg tat cac tgt gag tgc aga gac ggc tac cat gac 1776Asn Leu Pro Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp580 585 590aat ggg atg ttt gcg cca ggc gga gaa tcc tgt gaa gat att gac gaa 1824Asn Gly Met Phe Ala Pro Gly Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu595 600 605tgc ggg act ggg agg cac agc tgc acc aac gac acc att tgc ttc aac 1872Cys Gly Thr Gly Arg His Ser Cys Thr Asn Asp Thr Ile Cys Phe Asn610 615 620ttg gac ggg gga tac gat tgc cgg tgt ccc cat ggg aag aac tgc act 1920Leu Asp Gly Gly Tyr Asp Cys Arg Cys Pro His Gly Lys Asn Cys Thr625 630 635 640ggg gac tgc gtg cac gag ggg aaa gtg aag cac acc ggc cag atc tgg 1968Gly Asp Cys Val His Glu Gly Lys Val Lys His Thr Gly Gln Ile Trp645 650 655
gtg ctg gaa aac gac agg tgc tcc gtg tgt tcc tgg cag act ggg ttt 2016Val Leu Glu Asn Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Trp Gln Thr Gly Phe660 665 670gtc atg tgt cga cgg atg gtc tgc gac tgc gaa aac ccc aca gat gac 2064Val Met Cys Arg Arg Met Val Cys Asp Cys Glu Asn Pro The Asp Asp675 680 685ctt tcc tgc tgc cct gag tgt gac cca agg ctg agc agt cag tgc ctg 2112Leu Ser Cys Cys Pro Glu Cys Asp Pro Arg Leu Ser Ser Gln Cys Leu690 695 700cat caa aac ggg gaa acc gtg tac aac agc ggc gac acc tgg gtc cag 2160His Gln Asn Gly Glu Thr Val Tyr Asn Ser Gly Asp Thr Trp Val Gln705 710 715 720gat tgc cgt cag tgc cgc tgc ttg caa gga gaa gtt gac tgt tgg ccc 2208Asp Cys Arg Gln Cys Arg Cys Leu Gln Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro725 730 735ctg gct tgc cca gag gta gaa tgt gaa ttt agc gtc ctt cct gag aac 2256Leu Ala Cys Pro Glu Val Glu Cys Glu Phe Ser Val Leu Pro Glu Asn740 745 750gag tgc tgc cca cgc tgt gtc acc gat cct tgt cag gcc gac acc atc 2304Glu Cys Cys Pro Arg Cys Val Thr Asp Pro Cys Gln Ala Asp Thr Ile755 760 765cgc aat gac atc acc aaa acc tgc ctg gac gag atg aac gtg gtt cgc 2352Arg Asn Asp Ile Thr Lys Thr Cys Leu Asp Glu Met Asn Val Val Arg770 775 780ttc acc ggg tct tcc tgg atc aag cac ggc acg gag tgt acc ctc tgc 2400Phe Thr Gly Ser Ser Trp Ile Lys His Gly Thr G1u Cys Thr Leu Cys785 790 795 800cag tgc aag aat ggc cat ttg tgc tgc tca gtg gat cca cag tgc ctt 2448Gln Cys Lys Asn Gly His Leu Cys Cys Ser Val Asp Pro Gln Cys Leu805 810 815cag gag ctg tga 2460Gln Glu Leu *<210>12<211>819<212>PRT<213>鼠(Mus musculus)<400>12Met His Ala Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Val Ile1 5 10 15Leu Gly Leu Gly Ala Val Trp Gly Leu Gly Val Asp Pro Ser Leu Gln20 25 30Ile Asp Val Leu Thr Glu Leu Glu Leu Gly Glu Ser Thr Asp Gly Val35 40 45Arg Gln Val Pro Gly Leu His Asn Gly Thr Lys Ala Phe Leu Phe Gln50 55 60Glu Ser Pro Arg Ser Ile Lys Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu Arg Phe65 70 75 80Leu Gln Lys Leu Arg Asn Lys His Glu Phe Thr Ile Leu Val Thr Leu85 90 95Lys Gln Ile His Leu Asn Ser Gly Val Ile Leu Ser Ile His His Leu100 105 110Asp His Arg Tyr Leu Glu Leu Glu Ser Ser Gly His Arg Asn Glu Ile115 120 125Arg Leu His Tyr Arg Ser Gly Thr His Arg Pro His Thr Glu Val Phe130 135 140Pro Tyr Ile Leu Ala Asp Ala Lys Trp His Lys Leu Ser Leu Ala Phe145 150 155 160Ser Ala Ser His Leu Ile Leu His Ile Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu165 170 175Arg Val Val Glu Met Pro Phe Thr Asp Leu Ala Leu Gly Thr Thr Phe180 185 190Trp Leu Gly Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met
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245 250 255caa gct gag cag agg atg aac aag ttg gat cag tgc tat tgt gaa agg 816Gln Ala Glu Gln Arg Met Asn Lys Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg260 265 270acc tgc aca atg aaa ggc atg aca tac aga gaa ttt gaa tcc tgg aca 864Thr Cys Thr Met Lys Gly Met Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Thr275 280 285gat ggt tgt aag aac tgc act tgc atg aat ggc act gtg cag tgt gaa 912Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Met Asn Gly Thr Val Gln Cys Glu290 295 300gct ttg att tgc tcc ctc tct gac tgt cca cct aat tct gcc ctg rca 960Ala Leu Ile Cys Ser Leu Ser Asp Cys Pro Pro Asn Ser Ala Leu Ser305 310 315 320tac gtg gat ggc aag tgc tgc aaa gaa tgt caa tcg gtg tgc ata ttt 1008Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Gln Ser Val Cys Ile Phe325 330 335gaa ggc aga acc tac ttt gaa gga caa aga gaa acg gtg tat tea agc 1056Glu Gly Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Gln Arg Glu Thr Val Tyr Ser Ser340 345 350tca ggg gac tgt gtt ctg ttt gag tgc aag gac cac aaa atg cag cgt 1104Ser Gly Asp Cys Val Leu Phe Glu Cys Lys Asp His Lys Met Gln Arg355 360 365att cca aaa gac agt tgt gca act ttg aac tgc ccg gaa tct caa cag 1152Ile Pro Lys Asp Ser Cys Ala Thr Leu Asn Cys Pro Glu Ser Gln Gln370 375 380arc cca tta tct cac agt tgc tgc aaa atc tgt aaa ggc cat gac ttt 1200Ile Pro Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Ile Cys Lys Gly His Asp Phe385 390 395 400tgc act gaa gga cat aac tgt atg gag cat tct gtc tgc cga aac cta 1248Cys Thr Glu Gly His Asn Cys Met Glu His Ser Val Cys Arg Asn Leu405 410 415gat gac aga gct gtc tgt agc tgc cga gat ggc ttc cgg gcc crt cgg 1296Asp Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg420 425 430gag gac aat gcc tac tgt gaa gat gtt gat gag tgt gcc gag ggg cag 1344Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Val Asp Glu Cys Ala Glu Gly Gln435 440 445cac tac tgt cgg gag aac acc atg tgt gta aat aca cca gga tcc ttc 1392His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe450 455 460atg tgc arc tgc aaa aca gga tat ara cgc att gat gac tat rca tgt 1440Met Cys Ile Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp Tyr Set Cys465 470 475 480aca gag cac gat gaa tgt gta aca aac cag cac aac tgt gat gaa aat 1488Thr Glu His Asp Glu Cys Val Thr Asn Gln His Asn Cys Asp Glu Asn485 490 495gcg cta tgt rtc aac acg gtg ggt ggg cac aac tgt gtc tgc aag ctg 1536Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val Cys Lys Leu500 505 510ggt tac aca gga aat ggg acg gtg tgt aaa gca ttt tgc aaa gat ggg 1584Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Val Cys Lys Ala Phe Cys Lys Asp Gly515 520 525tgc agg aat gga gga gcc tgt att gct tcc aac gtg tgt gcc tgc cca 1632Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ser Asn Val Cys Ala Cys Pro530 535 540caa ggc ttc act ggc ccc agc tgt gaa act gac att gat gaa tgc tct 1680Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser
545 550 555 560gat ggc ttt gtg cag tgt gac agc cgt gct aat tgc atc aat ctg cca 1728Asp Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile Asn Leu Pro565 570 575ggg tgg tac cac tgt gaa tgc agg gat ggc tac cat gac aat ggg atg 1776Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp Asn Gly Met580 585 590ttt tca cca agt gga gaa tcc tgt gaa gac att gat gaa tgt gca act 1824Phe Ser Pro Ser Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Thr595 600 605gga agg cat agc tgt gcc aat gac act gtt tgc ttt aac ctg gat ggt 1872Gly Arg His Ser Cys Ala Asn Asp Thr Val Cys Phe Asn Leu Asp Gly610 615 620ggg tat gac tgt cga tgt cca cat ggc aag aac tgc aca gga gac tgt 1920Gly Tyr Asp Cys Arg Cys Pro His Gly Lys Asn Cys Thr Gly Asp Cys625 630 635 640atc cat gaa gac aaa arc aag cac aat ggt cag att tgg gtg ctg gag 1968Ile His Glu Asp Lys Ile Lys His Asn Gly Gln Ile Trp Val Leu Glu645 650 655aac gac aga tgc tct gtc tgc tca tgc cag agt gga tac gtg atg tgc 2016Asn Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Cys Gln Ser Gly Tyr Val Met Cys660 665 670cgg cga atg gtc tgt gac tgt gaa aat ccc act gtt gac crc ttt tgc 2064Arg Arg Met Val Cys Asp Cys Glu Asn Pro Thr Val Asp Leu Phe Cys675 680 685tgt cct gag tgt gac cca agg ctc agc agt caa tgt tta cat cag agt 2112Cys Pro Glu Cys Asp Pro Arg Leu Ser Ser Gln Cys Leu His Gln Ser690 695 700ggg gag ctt tcc tac aac agt ggt gac tcc tgg ara caa aac tgt cag 2160Gly Glu Leu Ser Tyr Asn Ser Gly Asp Ser Trp Ile Gln Asn Cys Gln705 710 715 720cag tgt cgc tgc ttg caa gga gag gtt gac tgt tgg ccc tta ccg tgc 2208Gln Cys Arg Cys Leu Gln Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro Leu Pro Cys725 730 735cca gag gta gac tgt gag ttc agt gtc ctc cct gag aat gag tgc tgc 2256Pro Glu Val Asp Cys Glu Phe Ser Val Leu Pro Glu Asn Glu Cys Cys740 745 750cca cgc tgt gtc act gac ccc tgc caa gcg gac acc atc cgt aat gac 2304Pro Arg Cys Val Thr Asp Pro Cys Gln Ala Asp Thr Ile Arg Asn Asp755 760 765atc acc aaa acc tgc ctg gat gaa acc aat gtt gtt cgc ttc act gga 2352Ile Thr Lys Thr Cys Leu Asp Glu Thr Asn Val Val Arg Phe Thr Gly770 775 780tct tct tgg att aag cat ggc aca gag tgc aca ctc tgc caa tgt aag 2400Ser Ser Trp Ile Lys His Gly Thr Glu Cys Thr Leu Cys Gln Cys Lys785 790 795 800aat ggc cac gtc tgt tgc tca gtg gat cca cag tgc ctt cag gaa ctg 2448Asn Gly His Val Cys Cys Ser Val Asp Pro Gln Cys Leu Gln Glu Leu805 810 815tga ca 2453*<210>14<211>816<212>PRT<213>雞(Gallus gallus)
<400>14Met Glu Ser Gly Cys Gly Leu Gly Thr Leu Cys Leu Leu Leu Cys Leu1 5 10 15Gly Pro Val Val Gly Phe Gly Val Asp Pro Ser Leu Gln Ile Asp Val20 25 30Leu Ser Glu Leu Gly Leu Pro Gly Tyr Ala Ala Gly Val Arg Gln Val25 40 45Pro Gly Leu His Asn Gly Ser Lys Ala Phe Leu Phe Pro Asp Thr Ser50 55 60Arg Ser Val Lys Ala Ser Pro Glu Thr Ala Glu Ile Phe Phe Gln Lys65 70 75 80Leu Arg Asn Lys Tyr Glu Phe Thr Ile Leu Val Thr Leu Lys Gln Ala85 90 95His Leu Asn Ser Gly Val Ile Phe Ser Ile His His Leu Asp His Arg100 105 110Tyr Leu Glu Leu Glu Ser Ser Gly His Arg Asn Glu Ile Arg Leu His115 120 125Tyr Arg Thr Gly Ser His Arg Ser His Thr Glu Val Phe Pro Tyr Ile130 135 140Leu Ala Asp Asp Lys Trp His Arg Leu Ser Leu Ala Ile Ser Ala Ser145 150 155 160His Leu Ile Leu His Val Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Val165 170 175Glu Lys Pro Phe Met Asp Leu Pro Val Gly Thr Thr Phe Trp Leu Gly180 185 190Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met Gln Asp Val195 200 205Gln Leu Leu Val Met Pro Gln Gly Phe Ile Ser Gln Cys Pro Asp Leu210 215 220Asn Arg Thr Cys Pro Thr Cys Asn Asp Phe His Gly Leu Val Gln Lys225 230 235 240Ile Met Glu Leu Glu Asp Ile Leu Ala Lys Thr Ser Ala Lys Leu Ser245 250 255Gln Ala Glu Gln Arg Met Asn Lys Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg260 265 270Thr Cys Thr Met Lys Gly Met Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Thr275 280 285Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Met Asn Gly Thr Val Gln Cys Glu290 295 300Ala Leu Ile Cys Ser Leu Ser Asp Cys Pro Pro Asn Ser Ala Leu Ser305 310 315 320Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Gln Ser Val Cys Ile Phe325 330 335Glu Gly Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Gln Arg Glu Thr Val Tyr Ser Ser340 345 350Ser Gly Asp Cys Val Leu Phe Glu Cys Lys Asp His Lys Met Gln Arg355 360 365Ile Pro Lys Asp Ser Cys Ala Thr Leu Asn Cys Pro Glu Ser Gln Gln370 375 380Ile Pro Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Ile Cys Lys Gly His Asp Phe385 390 395 400Cys Thr Glu Gly His Asn Cys Met Glu His Ser Val Cys Arg Asn Leu405 410 415Asp Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg420 425 430Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Val Asp Glu Cys Ala Glu Gly Gln435 440 445His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe450 455 460Met Cys Ile Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp Tyr Ser Cys465 470 475 480Thr Glu His Asp Glu Cys Val Thr Asn Gln His Asn Cys Asp Glu Asn485 490 495Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val Cys Lys Leu500 505 510Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Val Cys Lys Ala Phe Cys Lys Asp Gly515 520 525Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ser Asn Val Cys Ala Cys Pro530 535 540Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser545 550 555 560Asp Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile Asn Leu Pro565 570 575Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp Asn Gly Met580 585 590Phe Ser Pro Ser Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Thr
595 600 605Gly Arg His Ser Cys Ala Asn Asp Thr Val Cys Phe Asn Leu Asp Gly610 615 620Gly Tyr Asp Cys Arg Cys Pro His Gly Lys Asn Cys Thr Gly Asp Cys625 630 635 640Ile His Glu Asp Lys Ile Lys His Asn Gly Gln Ile Trp Val Leu Glu645 650 655Asn Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Cys Gln Ser Gly Tyr Val Met Cys660 665 670Arg Arg Met Val Cys Asp Cys Glu Asn Pro Thr Val Asp Leu Phe Cys675 680 685Cys Pro Glu Cys Asp Pro Arg Leu Ser Ser Gln Cys Leu His Gln Ser690 695 700Gly Glu Leu Ser Tyr Asn Ser Gly Asp Ser Trp Ile Gln Asn Cys Gln705 710 715 720Gln Cys Arg Cys Leu Gln Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro Len Pro Cys725 730 735Pro Glu Val Asp Cys Glu Phe Ser Val Leu Pro Glu Asn Glu Cys Cys740 745 750Pro Arg Cys Val Thr Asp Pro Cys Gln Ala Asp Thr Ile Arg Asn Asp755 760 765Ile Thr Lys Thr Cys Leu Asp Glu Thr Asn Val Val Arg Phe Thr Gly770 775 780Ser Ser Trp Ile Lys His Gly Thr Glu Cys Thr Leu Cys Gln Cys Lys785 790 795 800Asn Gly His Val Cys Cys Ser Val Asp Pro Gln Cys Leu Gln Glu Leu805 810 81權(quán)利要求
1.在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)功能肽性的一種方法，所述方法包括提供至少一種核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL1肽的至少一個(gè)核酸及編碼昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽的核酸；用所述的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞；在允許NELL1肽表達(dá)的條件下培育所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞；任選地收集從該細(xì)胞系分泌的NELL1肽；任選地基本上純化該NELL1肽；以及任選地測(cè)試該NELL1肽的活性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的昆蟲(chóng)是High Five細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽是蜂毒肽信號(hào)序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的編碼NELL1的核酸選自SEQ IDNO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQID NO4或SEQ ID NO6。
6.用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)NELL1肽的核酸構(gòu)建物，所述的核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL1肽的至少一個(gè)核酸及編碼昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽的核酸。
7.如權(quán)利要求5所述的核酸，其中所述的昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽是蜂毒肽信號(hào)肽序列。
8.如權(quán)利要求5所述的核酸，其中所述的編碼NELL1肽的核酸選自SEQ IDNO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQID NO4或SEQ ID NO6。
10.一種用于表達(dá)功能性NELL1肽的細(xì)胞系，所述的細(xì)胞系包括一種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL1肽的至少一個(gè)核酸及編碼昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽的核酸。
11.如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是High Five細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞分泌所述的NELL1肽。
14.如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其中所述的分泌信號(hào)肽是蜂毒肽信號(hào)肽。
15.如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其中所述的編碼NELL1肽的核酸選自SEQID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
17.一種多肽，包含NELL1肽和昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽。
18.如權(quán)利要求16所述的多肽，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
19.如權(quán)利要求17所述的多肽，其中所述的分泌信號(hào)肽是蜂毒肽信號(hào)序列。
20.一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)功能性肽的方法，所述的方法包括提供核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL1肽的至少一個(gè)核酸與編碼分泌信號(hào)肽的核酸；用所述的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞；在允許NELL1肽表達(dá)的條件下培育所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；任選地收集從該細(xì)胞系分泌的NELL1肽；任選地基本上純化該NELL1肽；以及任選地測(cè)試該NELL1肽誘導(dǎo)骨形成的活性。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞是COS7細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽是NELL肽信號(hào)序列。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的編碼NELL1肽的核酸選自SEQID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
25.一種用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)NELL1肽的核酸構(gòu)建物，所述的核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL1肽的至少一個(gè)核酸與編碼分泌信號(hào)肽的核酸。
26.如權(quán)利要求24所述的核酸，其中所述的昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽是NELL肽信號(hào)序列。
27.如權(quán)利要求24所述的核酸，其中所述的編碼NELL1肽的核酸選自SEQID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
28.如權(quán)利要求24所述的核酸，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
29.一種用于表達(dá)功能性NELL1肽的細(xì)胞系，所述的細(xì)胞系包含一種核酸構(gòu)建物，所述的核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL1肽的至少一個(gè)核酸與編碼分泌信號(hào)肽的核酸。
30.如權(quán)利要求29所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求30所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是COS7細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求29所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞分泌所述的NELL1肽。
33.如權(quán)利要求29所述的細(xì)胞，其中所述的分泌信號(hào)肽是NELL肽信號(hào)序列。
34.如權(quán)利要求29所述的細(xì)胞，其中所述的編碼NELL1肽的核酸選自SEQID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
35.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
36.一種包含NELL1肽和分泌信號(hào)肽的多肽。
37.如權(quán)利要求35所述的多肽，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
38.如權(quán)利要求35所述的多肽，其中所述的分泌信號(hào)肽是NELL肽信號(hào)序列。
39.在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)功能肽性的一種方法，所述的方法包括提供一種核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL2肽和昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽的至少一個(gè)核酸與NELL2肽；用所述的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞；在允許NELL2肽表達(dá)的條件下培育所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞；任選地收集從該細(xì)胞系分泌的NELL2肽；任選地基本上純化該NELL2肽；以及任選地測(cè)試該NELL2肽的活性。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞是High Five細(xì)胞。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽是蜂毒肽信號(hào)肽序列。
42.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的編碼NELL2肽的核酸選自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
43.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的NELL2肽選自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
44.一種用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)NELL2肽的核酸構(gòu)建物，所述的核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL2肽的至少一個(gè)核酸與編碼昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽的核酸。
45.如權(quán)利要求43所述的核酸，其中所述的昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽是蜂毒肽信號(hào)序列。
46.如權(quán)利要求43所述的核酸，其中所述的編碼NELL2肽的核酸選自SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
47.如權(quán)利要求5所述的核酸，其中所述的NELL2肽選自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
48.一種用于表達(dá)功能性NELL2肽的細(xì)胞系，所述的細(xì)胞系包括一種核酸構(gòu)建物，所述的核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL2肽的至少一個(gè)核酸與編碼昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽的核酸。
49.如權(quán)利要求48所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞。
50.如權(quán)利要求49所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是High Five細(xì)胞。
51.如權(quán)利要求48所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞分泌所述的NELL2肽。
52.如權(quán)利要求48所述的細(xì)胞，其中所述的分泌信號(hào)肽是蜂毒肽信號(hào)肽序列。
53.如權(quán)利要求48所述的細(xì)胞，其中所述的編碼NELL2肽的核酸選自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
54.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的NELL2肽選自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
55.一種包含NELL2肽和昆蟲(chóng)分泌信號(hào)肽的多肽。
56.如權(quán)利要求55所述的多肽，其中所述的NELL2肽選自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
57.如權(quán)利要求55所述的多肽，其中所述的分泌信號(hào)肽是蜂毒肽信號(hào)序列。
58.一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)功能性肽的方法，所述的方法包括提供核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL2肽的至少一個(gè)核酸和編碼分泌信號(hào)肽的核酸與NELL2肽；用所述的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞；在允許NELL2肽表達(dá)的條件下培育所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞；任選地收集從該細(xì)胞系分泌的NELL2肽；任選地基本上純化該NELL2肽；以及任選地測(cè)試該NELL2肽促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞存活的活性。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是COS7細(xì)胞。
60.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物分泌信號(hào)肽是NELL肽信號(hào)序列。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述的編碼NELL1肽的核酸選自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
62.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述的NELL2肽選自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
63.一種用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)NELL2肽的核酸構(gòu)建物，所述的核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL2肽的至少一個(gè)核酸與編碼分泌信號(hào)肽的核酸。
64.如權(quán)利要求63所述的核酸，其中所述的哺乳動(dòng)物分泌信號(hào)肽是NELL肽信號(hào)序列。
65.如權(quán)利要求63所述的核酸，其中所述的編碼NELL2肽的核酸選自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
66.如權(quán)利要求63所述的核酸，其中所述的NELL2肽選自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
67.一種用于表達(dá)功能性NELL2肽的細(xì)胞系，所述的細(xì)胞系包括一種核酸構(gòu)建物，所述的核酸構(gòu)建物在其框架中包含編碼至少一個(gè)NELL2肽的至少一個(gè)核酸與編碼分泌信號(hào)肽的核酸。
68.如權(quán)利要求67所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
69.如權(quán)利要求68所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是COS7細(xì)胞。
70.如權(quán)利要求67所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞分泌所述的NELL2肽。
71.如權(quán)利要求67所述的細(xì)胞，其中所述的分泌信號(hào)肽是NELL肽信號(hào)序列。
72.如權(quán)利要求67所述的細(xì)胞，其中所述的編碼NELL2肽的核酸選自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
73.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述的NELL2肽選自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
74.一種增加骨生成細(xì)胞分化的方法，包括在骨生成細(xì)胞中增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度；任選地施用一種第二種骨生成劑；以及誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括將NELL1肽施用于骨生成細(xì)胞。
76.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
77.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括誘導(dǎo)內(nèi)源性NELL1基因的表達(dá)。
78.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述的增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括增加Cbfal的細(xì)胞水平。
79.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括用編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染骨生成細(xì)胞。
80.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物包含選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5中的至少一個(gè)。
81.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
82.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的骨生成細(xì)胞選自成骨細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胎兒胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、硬腦膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、原代顱蓋細(xì)胞、干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞。
83.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的第二種骨生成肽選自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原。
84.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞標(biāo)記物選自堿性磷酸酯酶活性，骨鈣蛋白mRNA表達(dá)，骨橋蛋白mRNA表達(dá)，核心蛋白聚糖表達(dá)，和層粘連蛋白B表達(dá)。
85.一種增加成骨細(xì)胞礦化作用的方法，包括在骨生成細(xì)胞中增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度；任選地將一種藥劑施用于骨生成細(xì)胞；以及誘導(dǎo)礦化作用的細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。
86.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括將NELL1肽施用于骨生成細(xì)胞。
87.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
88.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括誘導(dǎo)內(nèi)源性NELL1基因的表達(dá)。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括增加Cbfal的細(xì)胞水平。
90.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括用編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染骨生成細(xì)胞。
91.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述的編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物包含選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5中的至少一個(gè)。
92.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述的NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
93.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述的骨生成細(xì)胞選自成骨細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胎兒胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、硬腦膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、原代顱蓋細(xì)胞、干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞。
94.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述的第二種骨生成劑選自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原。
95.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所誘導(dǎo)的礦化作用的細(xì)胞標(biāo)記物選自鈣摻入。
96.一種增加膜內(nèi)骨形成的方法，包括在需要骨形成的部位增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度；
97.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括將NELL1肽施用于需要骨形成的部位。
98.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQID NO4或SEQ ID NO6。
99.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括誘導(dǎo)內(nèi)源性NELL1基因的表達(dá)。
100.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括用編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并將該細(xì)胞施用在需要骨形成的部位的附近。
101.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物包含選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的至少一個(gè)。
102.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
103.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述的藥劑選自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原，骨，基質(zhì)，韌帶基質(zhì)，腱基質(zhì)，骨生成細(xì)胞或成骨細(xì)胞。
104.如權(quán)利要求96的方法，其中誘導(dǎo)膜內(nèi)骨的形成用CT、基因表達(dá)、組織學(xué)、機(jī)械試驗(yàn)來(lái)評(píng)估。
105.增加軟骨內(nèi)骨形成的方法，包括在需要骨形成和/或愈合和/或再生的部位增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度；任選地在需要骨形成的部位施用藥劑；以及在需要骨形成的部位誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的肥大。
106.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述骨形成包括骨愈合或骨再生。
107.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括將NELL1肽施用在需要骨形成的部位。
108.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
109.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括誘導(dǎo)內(nèi)源性NELL1基因的表達(dá)。
110.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括用編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并將該細(xì)胞施用在需要骨形成的部位的附近。
111.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物包含選自以下的至少一個(gè)SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5。
112.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
113.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的藥劑選自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF,膠原，骨，基質(zhì)，韌帶基質(zhì)，腱基質(zhì)，骨生成細(xì)胞或成骨細(xì)胞。
114.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞肥大導(dǎo)致凋亡的成軟骨細(xì)胞的增加。
115.在脊椎的鄰近部位增加骨形成的方法，包括在需要脊柱融合的脊椎的鄰近處增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度；任選地在需要脊柱融合的脊椎的鄰近處施用外加的活性藥劑；以及在需要脊柱融合的部位誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞肥大或成骨細(xì)胞分化。
116.如權(quán)利要求115所述的方法，所述方法還包括增加成骨細(xì)胞的分化。
117.如權(quán)利要求115所述的方法，所述方法還包括增加成骨細(xì)胞的礦化作用。
118.如權(quán)利要求115所述的方法，所述方法還包括誘導(dǎo)膜骨形成。
119.如權(quán)利要求115所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括將NELL1肽施用在需要脊柱融合的部位。
120.如權(quán)利要求115所述的方法，其中所述NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
121.如權(quán)利要求115所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括誘導(dǎo)內(nèi)源性NELL1基因的表達(dá)。
122.如權(quán)利要求115所述的方法，其中所述增加NELL1基因產(chǎn)物的濃度包括用編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并將該細(xì)胞施用在需要脊柱融合的部位的附近。
123.如權(quán)利要求122所述的方法，其中所述編碼NELL1肽的核酸構(gòu)建物包含選自以下的至少一個(gè)SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
124.如權(quán)利要求122所述的方法，其中所述NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6。
125.如權(quán)利要求115所述的方法，其中所述的藥劑選自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原，骨，基質(zhì)，韌帶基質(zhì)，腱基質(zhì)，骨生成細(xì)胞或成骨細(xì)胞。
126.誘導(dǎo)骨形成的組合物，包含有效量的誘導(dǎo)骨形成的第一藥劑，選自NELL1肽/改變NELL1肽表達(dá)的藥劑，或改變NELL1肽活性的藥劑；和任選的載體。
127.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述NELL1肽選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
128.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的藥劑選自TGF-B，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原。
129.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的藥劑選自骨基質(zhì)，韌帶基質(zhì)或腱基質(zhì)，骨生成細(xì)胞或成骨細(xì)胞。
130.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的載體是可被酶解或水解機(jī)制降解的。
131.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的載體是選自以下物質(zhì)的合成聚合物聚(α-羥基酸)，如聚(L-丙交酯)，聚(D，L-丙交酯)，聚乙交酯，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚(-己內(nèi)酯)，聚(三亞甲基碳酸酯)，聚(對(duì)-二噁烷酮)(poly(p-dioxanone))，聚(-己內(nèi)酯-共-乙交酯)，聚(乙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)聚(D，L-丙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)，多芳基化合物，多羥基丁酸酯，聚酐，聚(酐-共-酰亞胺)，丙烯-共-富馬酸酯，聚內(nèi)酯，聚酯，聚碳酸酯，多陰離子聚合物，聚酐，聚酯-酰胺，聚(氨基酸)，均多肽，聚(磷腈)，聚(glaxanone)，多糖，和聚(原酸酯)，聚glactin，聚glatic acid，聚醛糖酸，聚丙烯酸，聚烷酸酯。
132.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的載體是選自以下物質(zhì)的纖維素聚合物烷基纖維素，羥基烷基纖維素，甲基纖維素，乙基纖維素，羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素，羥基丙基-甲基纖維素，羧甲基纖維素，以及它們的陽(yáng)離子鹽。
133.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的載體是選自以下物質(zhì)的合成或天然生物陶瓷碳酸鈣，磷酸鈣，磷灰石，生物活性玻璃材料，及源自珊瑚的磷灰石。
134.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的載體選自膠原，透明質(zhì)素，血纖蛋白，脫乙酰殼多糖，海藻酸鹽，及明膠。
135.如權(quán)利要求126所述的組合物，進(jìn)一步包含選自以下物質(zhì)的肝素結(jié)合劑硫酸葡聚糖，硫酸軟骨素，硫酸乙酰肝素，巖藻聚糖，海藻酸鹽。
136.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的載體是可流動(dòng)形式凝膠。
137.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的載體是光可聚合的。
138.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的載體是溫度敏感的。
139.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的組合物還包括選自以下物質(zhì)的鰲合劑膠原，明膠，透明質(zhì)酸，海藻酸鹽，聚(乙二醇)，烷基纖維素(包括羥基烷基纖維素)，包括甲基纖維素，乙基纖維素，羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素，羥基丙基-甲基纖維素，和羧甲基纖維素，血，血纖蛋白，聚氧乙烯氧化物，硫酸鈣半水合物，磷灰石，羧基乙烯基聚合物，或聚(乙烯基醇)。
140.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的組合物還包括選自以下物質(zhì)的表面活性劑聚山梨酸酯80，聚山梨酸酯20或泊洛沙姆(Pluronic)F-68。
141.如權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述的組合物還包括選自以下物質(zhì)的緩沖劑甘氨酸，谷氨酸鹽酸鹽，氯化鈉，胍，肝素，谷氨酸鹽酸鹽，乙酸，琥珀酸，聚山梨酸酯，硫酸葡聚糖，蔗糖，和氨基酸。
142.治療病人以增加膜內(nèi)骨形成的方法，包括按選定的時(shí)間間隔給予在有效劑型中的治療有效劑量NELL1肽，以增強(qiáng)骨形成。
143.如權(quán)利要求142所述的方法，還包含在需要骨形成的部位給予選自以下物質(zhì)的至少一種藥劑TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原，骨基質(zhì)，韌帶基質(zhì)，或腱基質(zhì)。
144.治療病人以誘導(dǎo)骨形成的方法，包括收集哺乳動(dòng)物骨生成細(xì)胞；增加與骨生成細(xì)胞接觸的NELL1肽的濃度；在需要骨形成的部位給予該骨生成細(xì)胞。
145.如權(quán)利要求144所述的方法，其中所述增加與骨生成細(xì)胞接觸的NELL1肽的表達(dá)濃度包括將包含NELL1肽的組合物施用于骨生成細(xì)胞。
146.如權(quán)利要求144所述的方法，其中所述增加與骨生成細(xì)胞接觸的NELL1肽的濃度包含誘導(dǎo)NELL1肽的內(nèi)原性表達(dá)。
147.如權(quán)利要求144所述的方法，其中所述增加與骨生成細(xì)胞接觸的NELL1肽的表達(dá)濃度包括用表達(dá)NELL1肽的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
148.如權(quán)利要求145、146或147所述的方法，其中所述NELL1肽選自SEQID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
149.如權(quán)利要求145、146或147所述的方法，進(jìn)一步包含在需要骨形成的部位給予至少一種選自以下物質(zhì)的藥劑TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，膠原，骨，基質(zhì)，韌帶基質(zhì)，腱基質(zhì)，骨生成細(xì)胞或成骨細(xì)胞。
150.用于人體的一種植入物，包括一種基質(zhì)，其中所述基質(zhì)包含其量足以在該植入物的鄰近處誘導(dǎo)骨形成的NELL1。
151.用于人體的一種植入物，包括一種基質(zhì)，其具有的表面的至少一部分包含NELL1，其量足以在該植入物的鄰近處誘導(dǎo)骨形成。
152.用于人體的一種植入物，包括一種基質(zhì)，其具有的表面的至少一部分包含骨生成細(xì)胞，該基質(zhì)包含其量足以誘導(dǎo)骨形成的NELL1。
153.如權(quán)利要求145、146或147所述的植入物，其中所述的基質(zhì)被制成篩，針，螺絲，板，或假肢關(guān)節(jié)。
154.如權(quán)利要求145、146或147所述的植入物，其中所述的基質(zhì)是可再吸收的。
155.如權(quán)利要求145、46或147所述的植入物，其中所述的基質(zhì)包含膠原。
全文摘要
本發(fā)明總的涉及骨生長(zhǎng)因子，更具體涉及包括NELL1的組合物、包括NELL1的制品，以及使用NELL1誘導(dǎo)骨形成的方法。本發(fā)明還提供NELL1和NELL2肽的表達(dá)和純化方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101018562SQ200480009450
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2004年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月7日
發(fā)明者丁淦, 蘇立奇·科羅達(dá), 胡恩明 申請(qǐng)人:加州大學(xué)董事會(huì)