本發(fā)明屬于分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

鉛離子（pb²⁺）是一種有神經(jīng)毒性的重金屬元素，對人體危害嚴(yán)重，可對神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和腎臟等造成危害。美國環(huán)境保護(hù)署規(guī)定飲用水中鉛離子的最大允許量不得超過72nm。

目前，常規(guī)的鉛離子檢測方法主要有原子吸收光譜，電感耦合等離子體質(zhì)譜法，原子熒光光譜等方法。這些方法需要分離富集，操作繁瑣費時或需配置大型儀器，不利于快速現(xiàn)場檢測。近年來，利用對pb²⁺敏感的脫氧核酶（17ds-17ednazyme）為分子識別元件檢測pb²⁺的方法備受關(guān)注（d.mazumdar,j.liu,g.lu,j.zhouandy.lu,chem.commun.,2010,46,1416-1418），已建立熒光、電化學(xué)以及膠體金比色法等分析技術(shù)，但大多需要進(jìn)行標(biāo)記，或需要使用檢測儀器獲得數(shù)據(jù)，因而限制了這些技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此，迫切需要建立一種新型檢測技術(shù)用于鉛離子的檢測，使檢測過程無需使用檢測儀器，檢測結(jié)果直接肉眼可見，并使檢測體系無需標(biāo)記，從而節(jié)約成本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在利用鉛離子特異性識別的脫氧核酶為識別元件，結(jié)合工具酶介導(dǎo)的信號擴(kuò)增，以g-四聚體為信號報告分子，建立一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測試劑盒，包括dna雜交緩沖液，顯色緩沖液體系，氯高鐵血紅素，還包括下列成分：核酸序列17ds、17e、h1以及核酸外切酶iii。

具體分析如下：

底物鏈核酸序列17ds：堿基數(shù)為40-48個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段actat-ra-g-gaaga的序列（鉛離子（pb²⁺）特異性識別的脫氧核酶）；其中ra為切割位點，ra-g左右兩旁的5個堿基與17e互補(bǔ)；17ds的3'端有至少6個堿基不與17e互補(bǔ)，在17e的3'端有至少6個堿基不與17ds互補(bǔ)（防止17ds-17e被核酸外切酶iii切掉）；當(dāng)有鉛離子存在時，催化鏈切割底物鏈，切割位點為ra，切割后的底物鏈分割為兩部分，其中靠近17ds的5'端部分記名為a區(qū)，用于啟動下一步反應(yīng)；如果沒有鉛離子存在，那么催化鏈和底物鏈還是繼續(xù)互補(bǔ)結(jié)合在一起。

催化鏈核酸序列17e：堿基數(shù)為36-42個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段tcttc-tccgagccggtcgaaa-tagtg的序列（鉛離子（pb²⁺）特異性識別的脫氧核酶），其中tccgagccggtcgaaa構(gòu)成一個凸起部分，凸起部分左右兩旁的5個堿基與17ds互補(bǔ)；17e的3'端至少有6個堿基不與17ds互補(bǔ)；其反應(yīng)原理見上說明。

核酸序列h1；從3'端開始依次為b區(qū)域、c區(qū)域和d區(qū)域，其中c區(qū)和部分d區(qū)互補(bǔ)，構(gòu)成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分，b凸起于莖結(jié)構(gòu)外；h1的b與17ds切割后的a區(qū)的5'端互補(bǔ)，a的3'端凸起；b與a的部分互補(bǔ)后，b的3'端凸起變成平末端；加入核酸外切酶iii，核酸外切酶iii可以從平末端的雙鏈dna中的3'端開始切割核酸，從而把h1的b切掉成單個核苷酸；當(dāng)b被切掉后，h1的c又變成平末端，核酸外切酶iii又可以切割c，從而打開莖環(huán)h1，釋放h1上的d序列；c的堿基數(shù)為5-10個，過短或過長都不利于形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的堿基數(shù)為7個。同時a由于其3'端凸起，無法被切割，因此，a又可以循環(huán)進(jìn)入下一輪信號擴(kuò)增，不斷切割h1，最后釋放大量的核酸序列d。

其中，d是富含g堿基的核酸序列，加入氯高鐵血紅素（hemin）后，會形成具有催化活性的g四聚體結(jié)構(gòu)。它們能催化氧化tmb-h2o2（四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水）、opd-h2o2（鄰苯二胺-雙氧水）或abts-h2o2（2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水）檢測體系，產(chǎn)生有色底物，結(jié)果肉眼可見，從而達(dá)到檢測鉛離子的目的。

此外，還包括核酸外切酶iii。

優(yōu)選的，h1的d區(qū)域的核酸序列包含有四組ggg序列，各組ggg序列中間隔1-3個非g堿基。

優(yōu)選的，h1的d區(qū)域的核酸序列為gggtagggcgggttggg。

優(yōu)選的，h1的c區(qū)堿基數(shù)為5-10個，過短或過長都不利于形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，h1的c區(qū)堿基數(shù)為7個。

優(yōu)選的，雜交緩沖液為tris-hcl緩沖液，20mm，ph為7.4，含有200mmnacl以及50mmkcl。

優(yōu)選的，顯色緩沖液體系由顯色緩沖液、底物以及雙氧水構(gòu)成，包括四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水緩沖液體系、鄰苯二胺-雙氧水緩沖液體系或2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水緩沖液體系。

優(yōu)選的，底物鏈核酸序列17ds，催化鏈核酸序列17e，核酸序列h1，其序列如下所示：

17ds：5'-cgacatctacctagcactc-actat（a）-ra-g-gaaga-gatgaaaaaa-3'（seqidno：1）；

17e:5'-catc-tcttc-tccgagccggtcgaaa-tagtg-agtaaaaaa-3'（seqidno：2）；

h1:5'-gggtagggcgggttggg（d）-cctaccc（c）-agtgctaggtagatgtcg（b）-3'（seqidno：3）。

一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測方法，包括下列步驟：

1)先用雜交緩沖液分別溶解17ds、17e以及h1，將等量的17ds與17e混合，室溫反應(yīng)30分鐘，形成17ds-17e混合物；

2)將待測溶液加入到17ds-17e混合物中，室溫反應(yīng)45分鐘，完成切割反應(yīng)；

3)加入h1和核酸外切酶iii，室溫反應(yīng)90分鐘；

4)加入適量氯高鐵血紅素，室溫反應(yīng)30分鐘，取出50l反應(yīng)液，加入到950l顯色緩沖液體系中，室溫反應(yīng)15分鐘，觀察顏色變化；當(dāng)有鉛離子時，溶液顯色，當(dāng)沒有鉛離子時，溶液無色；

其中，17ds、17e、h1以及dna雜交緩沖液，顯色緩沖液體系如上述任意一項所示。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明以鉛離子特異性識別的脫氧核酶為分子識別元件，通過設(shè)計莖環(huán)結(jié)構(gòu)核酸，結(jié)合核酸外切酶iii選擇性切割作用，實現(xiàn)檢測信號的放大。以g-四聚體為信號報告分子，可現(xiàn)實免標(biāo)記檢測，簡化了操作，節(jié)約了成本。同時檢測結(jié)果直接肉眼可見，無需檢測儀器。整個檢測過程響應(yīng)迅速，無需專業(yè)訓(xùn)練即可掌握操作流程，便于快速推廣使用。本發(fā)明所述的檢測方法和檢測試劑盒對環(huán)境或食品中鉛離子的快速檢測具有重要意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的檢測方法的原理圖；

圖2為對不同濃度的鉛離子檢測的結(jié)果圖；

圖3為特異性實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測試劑盒，包括dna雜交緩沖液，顯色緩沖液體系，氯高鐵血紅素，還包括下列成分：核酸序列17ds、17e、h1以及核酸外切酶iii。

具體分析如下：

底物鏈核酸序列17ds：堿基數(shù)為40-48個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段actat-ra-g-gaaga的序列（鉛離子（pb²⁺）特異性識別的脫氧核酶）；其中ra為切割位點，ra-g左右兩旁的5個堿基與17e互補(bǔ)；17ds的3'端有至少6個堿基不與17e互補(bǔ)，在17e的3'端有至少6個堿基不與17ds互補(bǔ)（防止17ds-17e被核酸外切酶iii切掉）；當(dāng)有鉛離子存在時，催化鏈切割底物鏈，切割位點為ra，切割后的底物鏈分割為兩部分，其中靠近17ds的5'端部分記名為a區(qū)，用于啟動下一步反應(yīng)；如果沒有鉛離子存在，那么催化鏈和底物鏈還是繼續(xù)互補(bǔ)結(jié)合在一起。

催化鏈核酸序列17e：堿基數(shù)為36-42個，從5'端開始向3'端延伸過程中，包含有一段tcttc-tccgagccggtcgaaa-tagtg的序列（鉛離子（pb²⁺）特異性識別的脫氧核酶），其中tccgagccggtcgaaa構(gòu)成一個凸起部分，凸起部分左右兩旁的5個堿基與17ds互補(bǔ)；17e的3'端至少有6個堿基不與17ds互補(bǔ)；其反應(yīng)原理見上說明。

核酸序列h1；從3'端開始依次為b區(qū)域、c區(qū)域和d區(qū)域，其中c區(qū)和部分d區(qū)互補(bǔ)，構(gòu)成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分，b凸起于莖結(jié)構(gòu)外；h1的b與17ds切割后的a區(qū)的5'端互補(bǔ)，a的3'端凸起；b與a的部分互補(bǔ)后，b的3'端凸起變成平末端；加入核酸外切酶iii，核酸外切酶iii可以從平末端的雙鏈dna中的3'端開始切割核酸，從而把h1的b切掉成單個核苷酸；當(dāng)b被切掉后，h1的c又變成平末端，核酸外切酶iii又可以切割c，從而打開莖環(huán)h1，釋放h1上的d序列；c的堿基數(shù)為5-10個，過短或過長都不利于形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的堿基數(shù)為7個。同時a由于其3'端凸起，無法被切割，因此，a又可以循環(huán)進(jìn)入下一輪信號擴(kuò)增，不斷切割h1，最后釋放大量的核酸序列d。

其中，d是富含g堿基的核酸序列，加入氯高鐵血紅素（hemin）后，會形成具有催化活性的g四聚體結(jié)構(gòu)。它們能催化氧化tmb-h2o2（四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水）、opd-h2o2（鄰苯二胺-雙氧水）或abts-h2o2（2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水）檢測體系，產(chǎn)生有色底物，結(jié)果肉眼可見，從而達(dá)到檢測鉛離子的目的（反應(yīng)原理見圖1）。

此外，還包括核酸外切酶iii。

優(yōu)選的，h1的d區(qū)域的核酸序列包含有四組ggg序列，各組ggg序列中間隔1-3個非g堿基。

優(yōu)選的，h1的d區(qū)域的核酸序列為gggtagggcgggttggg，但不限于此。

優(yōu)選的，h1的c區(qū)堿基數(shù)為5-10個，過短或過長都不利于形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，h1的c區(qū)堿基數(shù)為7個。

優(yōu)選的，雜交緩沖液為tris-hcl緩沖液，20mm，ph為7.4，含有200mmnacl以及50mmkcl。

優(yōu)選的，顯色緩沖液體系由顯色緩沖液、底物以及雙氧水構(gòu)成，包括四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水緩沖液體系、鄰苯二胺-雙氧水緩沖液體系或2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水緩沖液體系。

優(yōu)選的，底物鏈核酸序列17ds，催化鏈核酸序列17e，核酸序列h1，其序列如下所示：

17ds：5'-cgacatctacctagcactc-actat-ra-g-gaaga-gatgaaaaaa-3'（seqidno：1）；

17e:5'-catc-tcttc-tccgagccggtcgaaa-tagtg-agtaaaaaa-3'（seqidno：2）；

h1:5'-gggtagggcgggttggg-cctaccc-agtgctaggtagatgtcg-3'（seqidno：3）。

一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測方法，包括下列步驟：

1)先用雜交緩沖液分別溶解17ds、17e以及h1，將等量的17ds與17e混合，室溫反應(yīng)30分鐘，形成17ds-17e混合物；

2)將待測溶液加入到17ds-17e混合物中，室溫反應(yīng)45分鐘，完成切割反應(yīng)；

3)加入h1和核酸外切酶iii，室溫反應(yīng)90分鐘；

4)加入適量氯高鐵血紅素，室溫反應(yīng)30分鐘，取出50l反應(yīng)液，加入到950l顯色緩沖液體系中，室溫反應(yīng)15分鐘，觀察顏色變化；當(dāng)有鉛離子時，溶液顯色，當(dāng)沒有鉛離子時，溶液無色；

其中，17ds、17e、h1以及dna雜交緩沖液，顯色緩沖液體系如上述任意一項所示。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實施例1

一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測方法按照如下步驟進(jìn)行：

（1）先用tris-hcl緩沖液（20mm，ph為7.4，含有200mmnacl以及50mmkcl）分別溶解17ds、17e以及h1。300nm的17ds與300nm的17e混合，室溫反應(yīng)30分鐘，形成17ds-17e混合物。

（2）把不同濃度的鉛離子加入到17ds-17e混合物中，室溫反應(yīng)45分鐘，完成切割反應(yīng)。

（3）加入1m的h1和25u的核酸外切酶iii，室溫反應(yīng)90分鐘。

（4）加入0.3m的hemin（氯高鐵血紅素），室溫反應(yīng)30分鐘。取出50l反應(yīng)液，加入到950l顯色緩沖液中（含有26.6mm檸檬酸，51.4mm磷酸氫二鈉，25mmkcl，10l0.5%的tmb，20l30%的h2o2，ph=5.0），室溫反應(yīng)15分鐘，觀察顏色變化。當(dāng)有鉛離子時，溶液變藍(lán)，當(dāng)沒有鉛離子時，溶液無色。

實施例2

一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測試劑盒包括以下成分：

（1）核酸序列17ds，17e，h1，它們的序列如下：

17ds：5'-cgacatctacctagcactcactat（a）ra-g-gaagagatgaaaaaa-3'（seqidno：1）；

17e:5'-catctcttc-tccgagccggtcgaaa-tagtgagtaaaaaa-3'（seqidno：2）；

h1:5'-gggtagggcgggttggg（d）-cctaccc（c）-agtgctaggtagatgtcg（b）-3'（seqidno：3）；

（2）tris-hcl緩沖液，含有200mmnacl以及50mmkcl；

（3）氯高鐵血紅素；

（4）顯色緩沖液體系，包含有26.6mm檸檬酸，51.4mm磷酸氫二鈉，25mmkcl，10ul0.5%的tmb，20ul30%的h2o2，ph=5.0。

實施例3

對不同濃度鉛離子的檢測：

配制鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為10pm、100pm、1nm、10nm和100nm，室溫保存。

將不同濃度的鉛離子溶液分別加到實施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后觀察實驗結(jié)果，如圖2所示，10pm的鉛離子可產(chǎn)生明顯的藍(lán)色變化，說明其檢測限為10pm。隨著鉛離子濃度增加，顏色也增加，并逐漸趨于飽和。

實施例4

特異性實驗：

配制100nm不同離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，它們分別是hg²⁺、cu²⁺、fe³⁺、mn²⁺、cr³⁺、co²⁺、ag⁺和cd²⁺。

將100nm的不同干擾物標(biāo)準(zhǔn)溶液和100pm鉛離子溶液分別加到實施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后觀察顏色變化，如圖3所示，100nm的hg²⁺、cu²⁺、fe³⁺、mn²⁺、cr³⁺、co²⁺、ag⁺和cd²⁺沒有產(chǎn)生顏色變化，對檢測不產(chǎn)生影響。只有當(dāng)加入鉛離子后才會產(chǎn)生藍(lán)色，這證明該方法對鉛離子的檢測具有很好的特異性。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所

<120>一種免標(biāo)記鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒

<130>

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<213>人工序列

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