本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨是一種由軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)和II型膠原組成的透明軟骨，關(guān)節(jié)的創(chuàng)傷和炎癥均可引起關(guān)節(jié)軟骨的損傷。關(guān)節(jié)軟骨的損傷會(huì)導(dǎo)致患者的關(guān)節(jié)反復(fù)疼痛和活動(dòng)受限，嚴(yán)重影響了他們的日常生活。由于關(guān)節(jié)軟骨再生能力有限，一旦損傷，難以自行修復(fù)，關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)一直是骨科研究的重要課題之一。
軟骨組織工程技術(shù)是在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增軟骨種子細(xì)胞，并且以較高濃度將其種植于具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上構(gòu)建組織工程軟骨，然后植入到組織缺損部位，完成組織的修復(fù)和重建。軟骨組織工程的最終目的就是得到高質(zhì)量的修復(fù)組織和長(zhǎng)期有效的功能，為病人最終解決痛苦。從這種意義上看，組織工程方法是目前治療關(guān)節(jié)軟骨損傷最有希望的方法，是目前軟骨損傷修復(fù)研究的主要方面。近年來，研究者致力于應(yīng)用組織工程學(xué)治療修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的研究，但其前提條件是獲取足夠數(shù)量的軟骨細(xì)胞，即關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的體外分離、體外培養(yǎng)及擴(kuò)增問題。
目前，軟骨細(xì)胞體外分離的方法主要有組織塊機(jī)械分離法、酶一步消化分離法和酶兩步消化分離法。這些方法由于操作的細(xì)節(jié)不同，最終獲得的軟骨細(xì)胞在數(shù)量與質(zhì)量上出現(xiàn)了明顯的差異。組織塊機(jī)械分離法雖然操作方法簡(jiǎn)單，但是細(xì)胞分離周期長(zhǎng)，只適合于細(xì)胞需求量少的研究。膠原酶消化法相對(duì)于組織塊機(jī)械分離法來說，細(xì)胞獲得周期較短，但是，由于不同研究者使用的酶種類、濃度和消化時(shí)間不同，可能會(huì)出現(xiàn)消化不足或者酶毒性損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量差異。因此，需要提供一種細(xì)胞得率高的軟骨細(xì)胞體外分離方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。該分離培養(yǎng)方法軟骨細(xì)胞得率高。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
本發(fā)明提供了一種軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
將軟骨組織處理成組織塊，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，然后加入II型膠原酶進(jìn)行消化；II型膠原酶的質(zhì)量百分比濃度為0.05％～0.1％，II型膠原酶的消化時(shí)間為16～20h。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)研究出一種比較好的軟骨細(xì)胞原代分離方法，該方法細(xì)胞獲得周期短、數(shù)量較多，獲得細(xì)胞的活率也較高。
作為優(yōu)選，II型膠原酶的質(zhì)量百分比濃度為0.05％。
作為優(yōu)選，II型膠原酶的消化時(shí)間為18h。
在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，胰蛋白酶的質(zhì)量百分比濃度為0.25％。
作為優(yōu)選，胰蛋白酶的消化時(shí)間為20～30min。
優(yōu)選地，胰蛋白酶的消化時(shí)間為30min。
作為優(yōu)選，組織塊為小于1mm3的組織塊。
在本發(fā)明中，II型膠原酶進(jìn)行消化后還包括細(xì)胞培養(yǎng)的步驟。
在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基。
作為優(yōu)選，細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞密度為(1～10)×104個(gè)/mL。
在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL。
在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化與加入II型膠原酶進(jìn)行消化之間還包括清洗的步驟。
在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，清洗采用PBS清洗，清洗的次數(shù)為3次。
本發(fā)明提供了一種軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。該分離培養(yǎng)方法包括：將軟骨組織處理成組織塊，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，然后加入II型膠原酶進(jìn)行消化；II型膠原酶的質(zhì)量百分比濃度為0.05％～0.1％，II型膠原酶的消化時(shí)間為16～20h。本發(fā)明具有的技術(shù)效果為：
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)研究得知，采用適宜的II型膠原酶的濃度和消化時(shí)間用于軟骨組織的消化，可有效維持軟骨細(xì)胞的活力，使得分離得到的軟骨細(xì)胞在后期的增殖培養(yǎng)時(shí)能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的軟骨細(xì)胞，大大提高了細(xì)胞培養(yǎng)的效率。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明公開了一種軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
本發(fā)明提供的軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中所用生物材料或試劑均可由市場(chǎng)購得。
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
實(shí)施例1：軟骨細(xì)胞的分離
取4周齡的新西蘭兔，耳靜脈注射法處死后，無菌條件下分離后肢關(guān)節(jié)軟骨，剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟骨膜后，放入盛有PBS的玻璃培養(yǎng)皿中。將分離得到的軟骨組織切成小于1mm的小塊。
在軟骨組織中加入0.25％的胰蛋白酶消化20min；PBS清洗3次后，終濃度為0.05％的II型膠原酶酶消化18h，每3h收集細(xì)胞一次。
將收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入1×105個(gè)軟骨細(xì)胞，5mL含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中。
實(shí)施例2：軟骨細(xì)胞的分離
取4周齡的新西蘭兔，耳靜脈注射法處死后，無菌條件下分離后肢關(guān)節(jié)軟骨，剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟骨膜后，放入盛有PBS的玻璃培養(yǎng)皿中。將分離得到的軟骨組織切成小于1mm的小塊。
在軟骨組織中加入0.25％的胰蛋白酶消化30min；PBS清洗3次后，終濃度為0.05％的II型膠原酶酶消化18h，每3h收集細(xì)胞一次。
將收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入1×105個(gè)軟骨細(xì)胞，5mL含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中。
實(shí)施例3：軟骨細(xì)胞的分離
取4周齡的新西蘭兔，耳靜脈注射法處死后，無菌條件下分離后肢關(guān)節(jié)軟骨，剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟骨膜后，放入盛有PBS的玻璃培養(yǎng)皿中。將分離得到的軟骨組織切成小于1mm的小塊。
在軟骨組織中加入0.25％的胰蛋白酶消化20min；PBS清洗3次后，終濃度為0.1％的II型膠原酶酶消化18h，每3h收集細(xì)胞一次。
將收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入1×105個(gè)軟骨細(xì)胞，5mL含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中。
對(duì)比例1：軟骨細(xì)胞的分離
取4周齡的新西蘭兔，耳靜脈注射法處死后，無菌條件下分離后肢關(guān)節(jié)軟骨，剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟骨膜后，放入盛有PBS的玻璃培養(yǎng)皿中。將分離得到的軟骨組織切成小于1mm的小塊。
在軟骨組織中加入0.25％的胰蛋白酶消化20min；PBS清洗3次后，終濃度為0.2％的II型膠原酶酶消化18h，每3h收集細(xì)胞一次。
將收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入1×105個(gè)軟骨細(xì)胞，5mL含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中。
試驗(yàn)例1：細(xì)胞獲得率
實(shí)施例1-3和對(duì)比例1的細(xì)胞經(jīng)5d的培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞獲得率。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示：
表1 細(xì)胞獲得率
由表1的試驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)施例1-3的細(xì)胞獲得率顯著高于對(duì)比例1的細(xì)胞獲得率，結(jié)果表明，延長(zhǎng)胰酶消化的時(shí)間或降低II型膠原酶的終濃度均可有效保持軟骨細(xì)胞的活力，從而保證了在后期增殖培養(yǎng)時(shí)能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的軟骨細(xì)胞。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。