本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
由心肌細(xì)胞功能障礙引起的心臟衰竭是世界范圍內(nèi)的一種主要的疾病,心衰患者最終死亡的原因主要是心臟泵血功能喪失或心律不齊。嚴(yán)重的心衰患者一年期死亡率超過50%。雖然晚期患者可以進(jìn)行心臟移植,然而由于供體器官缺乏,約有20%的病人在等待器官移植的過程中死亡。由于心力衰竭的高發(fā)病率和死亡率、移植心臟的死亡、免疫排斥反應(yīng)等并發(fā)癥以及移植心臟后期失效等客觀現(xiàn)狀,亟待發(fā)展新的治療方法以提高心肌細(xì)胞的功能,阻止心力衰竭的發(fā)生。目前對(duì)心力衰竭的治療方法主要集中于早期血管再生和抑制進(jìn)一步的心肌細(xì)胞損失,而心肌細(xì)胞是一種終端分化的細(xì)胞,增殖能力極其有限,損失后極難恢復(fù)。而心肌細(xì)胞移植療法著重于重建心肌功能,恢復(fù)再生心肌組織的泵血能力,也有研究發(fā)現(xiàn)注入心臟的心肌細(xì)胞能夠形成新的心肌組織。但細(xì)胞移植治療關(guān)鍵因素是確定合適的供體細(xì)胞類型。因此,如何誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞以用于醫(yī)藥治療是亟待解決的技術(shù)難題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題,本發(fā)明的目的是人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。
本發(fā)明提出的一種人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法,包括如下步驟:將人胎盤亞全能干細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于含有干細(xì)胞培養(yǎng)液的24孔板中,待細(xì)胞貼壁后,將干細(xì)胞培養(yǎng)液去除,再加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)28天,每3天換液。
優(yōu)選地,干細(xì)胞培養(yǎng)液包括:DMEM培養(yǎng)基、羥乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氫鉀、二乙胺四乙酸鈉鹽、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、透明質(zhì)酸、?;撬帷⑻ケP生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黃芪多糖、黨參多糖、大棗多糖。
優(yōu)選地,干細(xì)胞培養(yǎng)液中,羥乙基淀粉的濃度為3~3.5g/L,人血清白蛋白的濃度為1.8~2.3g/L,碳酸氫鉀的濃度為0.5~0.6g/L,二乙胺四乙酸鈉鹽的濃度為0.3~0.6μg/L,亞硒酸鈉的濃度為0.2~0.5μg/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為50~100mg/L,透明質(zhì)酸的濃度為2~5μg/L,?;撬岬臐舛葹?~8μg/L,胎盤生長(zhǎng)因子的濃度為10~20μg/L,成纖維細(xì)胞因子的濃度為10~20μg/L,谷胱甘肽的濃度為50~80mg/L,硫辛酸的濃度為15~25mg/L,黃芪多糖的濃度為20~40mg/L,黨參多糖的濃度為30~60mg/L,大棗多糖的濃度為40~80mg/L。
優(yōu)選地,心肌細(xì)胞培養(yǎng)液包括:RPMI-1640培養(yǎng)基,海藻糖,牛磺酸,成纖維生長(zhǎng)因子,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子,碳酸氫鉀,氨基酸螯合硒,谷氨酰胺,黃體酮,輔酶I,硫辛酸,丹酚酸B,黃精多糖,人參皂苷。
優(yōu)選地,心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中,海藻糖的濃度為2.5~3.5g/L,牛磺酸的濃度為1~1.2g/L,成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為25~40mg/L,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為20~30μg/L,碳酸氫鉀的濃度為0.8~1.3g/L,氨基酸螯合硒的濃度為1~2μg/L,谷氨酰胺的濃度為50~80mg/L,黃體酮的濃度為10~20mg/L,輔酶I的濃度為60~120μg/L,硫辛酸的濃度為15~25mg/L,維生素的濃度為50~100mg/L,丹酚酸B的濃度為20~40mg/L,黃精多糖的濃度為15~30mg/L,人參皂苷的濃度為30~50mg/L。
本發(fā)明還提出的一種心肌細(xì)胞,采用上述人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法制得。
本發(fā)明還提出的上述心肌細(xì)胞用于制備預(yù)防或治療心肌細(xì)胞功能障礙疾病的藥物組合物。
本發(fā)明能夠?qū)⑷颂ケP亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞,所得心肌細(xì)胞具有正常心肌細(xì)胞特異性分子標(biāo)簽,并且具有正常心肌的功能,為再生醫(yī)學(xué)的細(xì)胞來源問題提供一種新的途徑。
具體實(shí)施方式
下面,通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
本發(fā)明提出的一種人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法,包括如下步驟:將人胎盤亞全能干細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于含有干細(xì)胞培養(yǎng)液的24孔板中,待細(xì)胞貼壁后,將干細(xì)胞培養(yǎng)液去除,再加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)28天,每3天換液。
干細(xì)胞培養(yǎng)液包括:DMEM培養(yǎng)基、羥乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氫鉀、二乙胺四乙酸鈉鹽、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、透明質(zhì)酸、?;撬?、胎盤生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黃芪多糖、黨參多糖、大棗多糖。其中羥乙基淀粉的濃度為3.2g/L,人血清白蛋白的濃度為2/L,碳酸氫鉀的濃度為0.55g/L,二乙胺四乙酸鈉鹽的濃度為0.4μg/L,亞硒酸鈉的濃度為0.4μg/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為70mg/L,透明質(zhì)酸的濃度為3.5μg/L,?;撬岬臐舛葹?μg/L,胎盤生長(zhǎng)因子的濃度為15μg/L,成纖維細(xì)胞因子的濃度為15μg/L,谷胱甘肽的濃度為65mg/L,硫辛酸的濃度為20mg/L,黃芪多糖的濃度為30mg/L,黨參多糖的濃度為50mg/L,大棗多糖的濃度為60mg/L。
心肌細(xì)胞培養(yǎng)液包括:RPMI-1640培養(yǎng)基,海藻糖,牛磺酸,成纖維生長(zhǎng)因子,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子,碳酸氫鉀,氨基酸螯合硒,谷氨酰胺,黃體酮,輔酶I,硫辛酸,丹酚酸B,黃精多糖,人參皂苷。其中海藻糖的濃度為3g/L,?;撬岬臐舛葹?.1g/L,成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為32mg/L,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為25μg/L,碳酸氫鉀的濃度為1g/L,氨基酸螯合硒的濃度為1.5μg/L,谷氨酰胺的濃度為70mg/L,黃體酮的濃度為15mg/L,輔酶I的濃度為90μg/L,硫辛酸的濃度為20mg/L,維生素的濃度為75mg/L,丹酚酸B的濃度為30mg/L,黃精多糖的濃度為20mg/L,人參皂苷的濃度為40mg/L。
實(shí)施例2
本發(fā)明提出的一種人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法,包括如下步驟:將人胎盤亞全能干細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于含有干細(xì)胞培養(yǎng)液的24孔板中,待細(xì)胞貼壁后,將干細(xì)胞培養(yǎng)液去除,再加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)28天,每3天換液。
干細(xì)胞培養(yǎng)液包括:DMEM培養(yǎng)基、羥乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氫鉀、二乙胺四乙酸鈉鹽、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、透明質(zhì)酸、?;撬帷⑻ケP生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黃芪多糖、黨參多糖、大棗多糖。其中羥乙基淀粉的濃度為3g/L,人血清白蛋白的濃度為2.3g/L,碳酸氫鉀的濃度為0.5g/L,二乙胺四乙酸鈉鹽的濃度為0.6μg/L,亞硒酸鈉的濃度為0.2μg/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為100mg/L,透明質(zhì)酸的濃度為2μg/L,?;撬岬臐舛葹?μg/L,胎盤生長(zhǎng)因子的濃度為10μg/L,成纖維細(xì)胞因子的濃度為20μg/L,谷胱甘肽的濃度為50mg/L,硫辛酸的濃度為25mg/L,黃芪多糖的濃度為20mg/L,黨參多糖的濃度為60mg/L,大棗多糖的濃度為40mg/L。
心肌細(xì)胞培養(yǎng)液包括:RPMI-1640培養(yǎng)基,海藻糖,牛磺酸,成纖維生長(zhǎng)因子,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子,碳酸氫鉀,氨基酸螯合硒,谷氨酰胺,黃體酮,輔酶I,硫辛酸,丹酚酸B,黃精多糖,人參皂苷。其中海藻糖的濃度為3.5g/L,牛磺酸的濃度為1g/L,成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為40mg/L,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為20μg/L,碳酸氫鉀的濃度為1.3g/L,氨基酸螯合硒的濃度為1μg/L,谷氨酰胺的濃度為80mg/L,黃體酮的濃度為10mg/L,輔酶I的濃度為120μg/L,硫辛酸的濃度為15mg/L,維生素的濃度為100mg/L,丹酚酸B的濃度為20mg/L,黃精多糖的濃度為30mg/L,人參皂苷的濃度為30mg/L。
實(shí)施例3
本發(fā)明提出的一種人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法,包括如下步驟:將人胎盤亞全能干細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于含有干細(xì)胞培養(yǎng)液的24孔板中,待細(xì)胞貼壁后,將干細(xì)胞培養(yǎng)液去除,再加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)28天,每3天換液。
干細(xì)胞培養(yǎng)液包括:DMEM培養(yǎng)基、羥乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氫鉀、二乙胺四乙酸鈉鹽、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、透明質(zhì)酸、牛磺酸、胎盤生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黃芪多糖、黨參多糖、大棗多糖。其中羥乙基淀粉的濃度為3.5g/L,人血清白蛋白的濃度為1.8g/L,碳酸氫鉀的濃度為0.6g/L,二乙胺四乙酸鈉鹽的濃度為0.3μg/L,亞硒酸鈉的濃度為0.5μg/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為50mg/L,透明質(zhì)酸的濃度為5μg/L,?;撬岬臐舛葹?μg/L,胎盤生長(zhǎng)因子的濃度為20μg/L,成纖維細(xì)胞因子的濃度為10μg/L,谷胱甘肽的濃度為80mg/L,硫辛酸的濃度為15mg/L,黃芪多糖的濃度為40mg/L,黨參多糖的濃度為30mg/L,大棗多糖的濃度為80mg/L。
心肌細(xì)胞培養(yǎng)液包括:RPMI-1640培養(yǎng)基,海藻糖,牛磺酸,成纖維生長(zhǎng)因子,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子,碳酸氫鉀,氨基酸螯合硒,谷氨酰胺,黃體酮,輔酶I,硫辛酸,丹酚酸B,黃精多糖,人參皂苷。其中海藻糖的濃度為2.5g/L,?;撬岬臐舛葹?.2g/L,成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為25mg/L,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為30μg/L,碳酸氫鉀的濃度為0.8g/L,氨基酸螯合硒的濃度為2μg/L,谷氨酰胺的濃度為50mg/L,黃體酮的濃度為20mg/L,輔酶I的濃度為60μg/L,硫辛酸的濃度為25mg/L,維生素的濃度為50mg/L,丹酚酸B的濃度為40mg/L,黃精多糖的濃度為15mg/L,人參皂苷的濃度為50mg/L。
以上所述,僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此,任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi),根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。