技術領域

本發(fā)明涉及可同時促進釀酒酵母產酒精和風味物質的芽孢桿菌及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

釀造酒行業(yè)是我國的優(yōu)勢民族傳統(tǒng)制造業(yè)，也是食品工業(yè)的重要組成部分。2013年生產總值達6000億元以上，占食品工業(yè)總值約6-7％。因此釀造酒行業(yè)的發(fā)展對于我國食品行業(yè)甚至國民經濟的發(fā)展都具有重要的意義。

中國白酒是釀造酒的典型代表。但是，與國際釀造酒制造行業(yè)相比，存在如下問題：首先，生產效率偏低，即白酒出酒率低。白酒固態(tài)酒醅中乙醇最高濃度僅為7％左右，最高原料出酒率僅50％(小曲清香)，最低僅35％左右(濃香)，遠低于理論出酒率(65％)；其次，白酒風味代謝不可控，重要風味物質合成代謝較弱，導致優(yōu)質品率偏低，目前每年生產的優(yōu)質白酒僅占全國白酒產量的5～10％。例如，清香型白酒的優(yōu)質品率僅6％(代表性企業(yè)內部數據)，無法滿足人民群眾對優(yōu)質產品的消費需求。因此，提高白酒的出酒率以及優(yōu)質品率是白酒產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然要求。

釀酒酵母是白酒生產的重要微生物，不僅提供了酒精，而且提供了重要的風味物質，因此提高釀酒酵母的酒精代謝及風味代謝是白酒發(fā)酵需要調控的重要內容。但是由于白酒生產屬于敞開式自然發(fā)酵，釀酒酵母菌株及其代謝都難以控制，盡管在白酒生產中采用了一定的方法，但是都收效甚微。例如，在白酒生產中添加代謝活性更強的酵母，但是既能夠滿足酒精活力高，又能夠滿足風味代謝活性高的酵母較少，且很多酵母都難以適應白酒發(fā)酵的惡劣環(huán)境，并且，強化的釀酒酵母在數量上并沒有優(yōu)勢，也不能取代本土的釀酒酵母，因此，直接強化優(yōu)質釀酒酵母的方式效果并不明顯。因此，如果能夠直接調控實際生產環(huán)境中釀酒酵母的代謝是一種更為有效的途徑。但是不同于可控發(fā)酵，白酒生產的自然發(fā)酵決定了其代謝調控的困難性。另外，目前白酒生產中，出酒率與風味提升很難同時能夠滿足，一般出酒率提高時風味則會下降，而風味提高時，出酒率則會下降。除了以上困難外，還難以同時提高酵母乙醇與風味代謝。

本發(fā)明發(fā)現了4株芽孢桿菌，能夠有效調控釀酒酵母的酒精代謝與風味代謝能力，由于 上述菌株來自于白酒釀造中，因此適合于白酒釀造環(huán)境，將其應用于白酒生產中，可同時以有效提高生產體系中釀酒酵母的酒精與風味代謝能力，最終同時提高白酒的出酒率與品質，解決目前白酒生產中存在的出酒率與風味品質難以同時提高的困難。符合白酒產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。同時，本發(fā)明可以應用于其它釀造食品領域，對于促進釀造食品的高效與優(yōu)質生產具有重要實踐意義。

技術實現要素：

本發(fā)明提供提高釀酒酵母代謝酒精及風味物質的芽孢桿菌，及其應用于白酒生產中提高白酒出酒率與品質的方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供4株能同時促進釀酒酵母產酒精和風味物質的芽孢桿菌。

所述芽孢桿菌為地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis CGMCC NO.3963；蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus BC-1，即B.cereus CCTCC NO:M 2013369；遲緩芽孢桿菌Bacillus lentus BL-1，即B.lentus CCTCC NO:M 2013370；甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus BM-1，即B.methylotrophicusCCTCC NO:M 2013371。

所述地衣芽胞桿菌B.licheniformis CGMCC NO.3963，于2010年6月28日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC NO.3963；所述蠟樣芽孢桿菌B.cereus CCTCC NO:M 2013369，于2013年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013369；所述遲緩芽孢桿菌B.lentus CCTCC NO:M 2013370，于2013年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013370；所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371，于2013年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013371。

所述風味物質包括：醛類的乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚，醇類的2-甲基丙醇、3-甲基丁醇，芳香族類的苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、異丁酸苯乙酯，酮與呋喃類的2,3-二氫苯并呋喃，酸類2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸，以及法呢醇、β-香茅醇。

所述地衣芽胞桿菌B.licheniformis CGMCC NO.3963，其特征在于，將其與釀酒酵母混合發(fā)酵，可以提高釀酒酵母酒精代謝能力；同時增加釀酒酵母代謝風味物質的能力，包括乙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、異丁酸苯乙酯、2,3-二氫苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、反式-橙花叔醇、法呢醇、四甲基吡嗪。

所述的蠟樣芽孢桿菌B.cereus CCTCC NO:M 2013369，其特征在于，將其與釀酒酵母混 合發(fā)酵，可以提高釀酒酵母酒精代謝能力；同時增加釀酒酵母代謝風味物質的能力，包括乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、異丁酸苯乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2,3-二氫苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、反式-橙花叔醇、法呢醇、β-香茅醇、β-大馬酮。

所述的遲緩芽孢桿菌B.lentus CCTCC NO:M 2013370，其特征在于，將其與釀酒酵母混合發(fā)酵，可以提高釀酒酵母酒精代謝能力；同時增加釀酒酵母代謝風味物質的能力，包括乙醛、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、異丁酸苯乙酯、癸酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2,3-二氫苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、反式-橙花叔醇、法呢醇、β-香茅醇。

所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.Methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371，其特征在于，將其與釀酒酵母混合發(fā)酵，可以提高釀酒酵母酒精代謝能力；同時增加釀酒酵母代謝風味物質的能力，包括乙醛、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2-甲基丙醇、2-甲基-4-戊烯-1-醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、異丁酸苯乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2,3-二氫苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、法呢醇、β-大馬酮。

所述的4株芽孢桿菌都具有以下微生物學特征：革蘭氏陽性、兼性厭氧，可水解酪蛋白、明膠和淀粉；可直接在高粱固體培養(yǎng)基中生長，其特點在于不需要對高粱固體培養(yǎng)基進行糖化處理，能直接利用高粱淀粉而生長與代謝；能耐受60℃高溫生長，耐受15～18％的NaCl和KCl，在pH3.8～4可以生長，可以耐受10～12％的乙醇。以上特征使其能夠存活于白酒釀造復雜的環(huán)境，并對釀酒酵母代謝形成促進作用。同時，由于該菌長期在白酒釀造環(huán)境中與釀酒酵母共同生存，進化使其能夠與酵母產生相互作用，并促進釀酒酵母的生長與代謝。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種同時促進釀酒酵母產酒精和風味物質的方法，是將釀酒酵母與以下至少一種芽孢桿菌進行混合培養(yǎng)：地衣芽胞桿菌B.licheniformis CGMCC NO.3963、蠟樣芽孢桿菌B.cereus CCTCC NO:M 2013369、遲緩芽孢桿菌B.lentus CCTCC NO:M 2013370、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371。

所述釀酒酵母是任意一種釀酒酵母。

所述方法具體是：將釀酒酵母和芽孢桿菌種子液，按照接種后菌體數量比為0.001:1000至1000：0.001接種于培養(yǎng)基中，于25℃至40℃、0rpm至200rpm培養(yǎng)16h至72h。

所述方法，對培養(yǎng)基無要求。在本發(fā)明的一種實施方式中，所述培養(yǎng)基為高粱液體培養(yǎng) 基。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述芽孢桿菌在釀酒方面的應用。

所述應用是將芽孢桿菌應用于釀造酒生產中提高釀造酒出酒率與品質。

所述應用是將芽孢桿菌液體菌劑或固體菌劑，與釀酒酒曲種或發(fā)酵原料混合后，進行發(fā)酵，釀造酒的出酒率以及品質均明顯提高。

所述應用，在本發(fā)明的一種實施方式中是所述芽孢桿菌在釀造酒生產中的強化應用，采用液體菌劑或固體菌劑的方式接種于生產體系中，提高出酒率與產品風味物質種類與含量。

所述液體菌劑制作方式，在本發(fā)明的一種實施方式中，是將活化的種子液按1～5％(w/w)的接種量(即每100g液態(tài)培養(yǎng)基接種種子液1-5g)接種于滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基中，25～40℃培養(yǎng)24h～72h。

所述液態(tài)培養(yǎng)基，在本發(fā)明的一種實施方式中，為高粱液體培養(yǎng)基，制作方法為：20～200g高粱樣品經粉碎后，加mL/g計1～4倍的水，蒸煮1-5h，呈糊狀，冷卻后加入10～50單位/g的糖化酶，于40～100℃保持2～10h，過濾、離心所得濾液，糖度為10～15^oBx。

所述固體菌劑的制作方式，在本發(fā)明的一種實施方式中，是將活化的種子液接種(一級種子)高粱固體培養(yǎng)基中(接種量為1～5％，w/w)，在25～40℃環(huán)境中固態(tài)發(fā)酵32～72h，制成固態(tài)菌制劑。高粱固體培養(yǎng)基制作方式：將高粱粉碎，按1：1～1：2的比例加水后，蒸煮30－60min即可。

本發(fā)明的芽孢桿菌是從中國醬香型白酒釀造環(huán)境中篩選獲得的，由于醬香型白酒釀造具有高溫、高酸、高乙醇濃度等特征，賦予了以上芽孢桿菌不同于常規(guī)的芽孢桿菌，具有獨特的耐受高溫、高酸及高乙醇濃度的特征，可以適應釀造酒惡劣的釀造環(huán)境，并促進釀酒酵母的代謝作用。同時，混合發(fā)酵中酵母風味代謝的提高并不是由芽孢桿菌自身代謝的物質，首先混合發(fā)酵后，芽孢桿菌的生長受到了一定的抑制，同時酵母提高的代謝物質絕大部分并不是芽孢桿菌所能代謝產生的，因此，所述芽孢桿菌與酵母混合可以提高釀酒酵母的代謝能力。

本發(fā)明發(fā)現了4株芽孢桿菌，能夠同時有效提高生產體系中釀酒酵母的酒精與風味代謝能力，最終同時提高白酒的出酒率與品質，解決目前白酒生產中存在的出酒率與風味品質難以同時提高的困難，符合白酒產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。

生物材料保藏

蠟樣芽孢桿菌Bacillus.cereus BC-1，于2013年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2013369；

遲緩芽孢桿菌Bacillus.lentus BL-1，于2013年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2013370；

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus.methylotrophicus BM-1，于2013年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2013371。

附圖說明

圖1：單獨培養(yǎng)與混合培養(yǎng)后釀酒酵母的生長，A，釀酒酵母，□，單培養(yǎng)；●，添加地衣芽胞桿菌；△，添加蠟樣芽孢桿菌；▼，添加遲緩芽孢桿菌；◇，添加甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。

具體實施方式

風味物質檢測：運用頂空固相微萃取技術(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)方法對揮發(fā)性產物進行分析，取8mL樣品，放入裝有3gNaCl的頂空進樣瓶中，加入10μL濃度為42.60mg·L^-1的4-甲基-2-戊醇為內標。將頂空瓶于50℃恒溫萃取45min。萃取完后進行GC-MS分析。

實施例1釀酒酵母與芽孢桿菌的混合培養(yǎng)

釀酒酵母種子液：挑取一環(huán)釀酒酵母菌泥接種于YEPD液體培養(yǎng)基，30℃，200rpm培養(yǎng)16h。芽孢桿菌種子液：挑取一環(huán)芽孢桿菌菌泥接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)16h。配制高粱浸出汁，接種釀酒酵母種子液與芽孢桿菌種子液，兩者終濃度均為1×10⁶cfu/mL。在30℃，200rpm培養(yǎng)。取樣通過平板涂布的方法測定菌體濃度；培養(yǎng)24～48h，菌液于8000rpm離心10min，測定乙醇濃度與風味物質成分及含量。釀酒酵母菌體濃度隨時間的變化曲線見圖1，乙醇濃度變化見表1，風味成分變化見表2至表3。

通過測定發(fā)酵過程中芽孢桿菌和酵母菌的菌體濃度，發(fā)現芽孢桿菌的生長會降低，釀酒酵母的生長與單獨培養(yǎng)相比變化不大。

從表1可以看出，與芽孢桿菌混合培養(yǎng)后，釀酒酵母的產乙醇能力提高17％-40.2％。

從表2至表3可以看出，芽孢桿菌與酵母混合培養(yǎng)后，風味物質含量都有提高的包括：所述風味物質包括：醛類的乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚，醇類的2-甲基丙醇、3-甲基丁醇，芳香族類的苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、異丁酸苯乙酯，酮與呋喃類的2,3-二氫苯并呋喃，酸類2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸，以及法呢醇、β-香茅醇。

實驗證明，芽孢桿菌是不產或極低產醇、酸、酯的。由于混合培養(yǎng)時芽孢桿菌生長降低、酵母生長，而風味物質的種類及其濃度會提高，表明了并非芽孢桿菌自身具有高產乙醇以及重要醇、酸、酯類風味物質的代謝能力，而是芽孢桿菌促進了釀酒酵母的代謝能力。

表1添加不同芽孢桿菌釀酒酵母產生乙醇濃度(g/l)

表2添加不同芽孢桿菌后醛類、醇類及芳香族風味物質的變化(μg/L)

表3添加不同芽孢桿菌后酯類、酸類及其他風味物質的變化(μg/L)

實施例2芽孢桿菌應用于釀造酒生產中提高釀造酒出酒率與品質

將本發(fā)明的芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013369和CCTCC NO:M 2013370分別制成液體菌劑或固體菌劑，與釀酒酒曲種或發(fā)酵原料混合后進行發(fā)酵。

所述液體菌劑制作方式：將活化的種子液按1～5％(w/w)的接種量(即每100g液態(tài)培養(yǎng)基接種種子液1-5g)接種于滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基中，25～40℃培養(yǎng)24h～72h。

所述液態(tài)培養(yǎng)基為高粱提取物培養(yǎng)基，制作方法為：20～200g高粱樣品經粉碎后，加mL/g計1～4倍的水，蒸煮1-5h，呈糊狀，冷卻后加入10～50單位/g的糖化酶，于40～100℃ 保持2～10h，過濾、離心所得濾液，糖度為10～15^oBx。

所述固體菌劑的制作方式是將活化的種子液接種(一級種子)高粱固體培養(yǎng)基中(接種量為1～5％，w/w)，在25～40℃環(huán)境中固態(tài)發(fā)酵32～72h，制成固態(tài)菌制劑。

高粱固體培養(yǎng)基制作方式：將高粱粉碎，按1：1～1：2的比例加水后，蒸煮30－60min即可。

在醬香型白酒生產中分別應用這兩種芽孢桿菌，對應用生產的白酒進行感官品評，結果如表4所示，可以看出，應用芽孢桿菌后白酒質量得到提高。其中，根據芽孢桿菌與酵母風味代謝特征，芽孢桿菌產酸、醇、酯的能力很低，白酒中所提高的醇香、甜度、酸感主要為酵母代謝的醇類物及酸類物質貢獻，放香強度主要為酵母代謝產生的酯類物質貢獻。結果表明，白酒中酸、醇、酯等重要的風味是有芽孢桿菌促進釀酒酵母代謝產生。

表4應用關鍵細菌組合生產白酒品評結果

評酒人員：國家白酒評委1名；省級白酒評委5名；酒廠評委2名。

計分方法：按排序排在第一位加權3分，第二位加權2分，第三位加權1分。

在醬香型白酒生產的出酒的1～4輪次進行了芽孢桿菌的應用，所生產白酒品質均得到提 高且出酒率得到提高，結果如表5所示。

表5應用芽孢桿菌細菌生產白酒的出酒率(％)

實施例3釀酒酵母與芽孢桿菌的混合培養(yǎng)

將釀酒酵母與B.licheniformis CGMCC NO.3963、B.lentus CCTCC NO:M 2013370分別制成種子液。將按B.licheniformis CGMCC3963、B.lentus CCTCC NO:M 2013370按菌數1:1的比例混合后，與釀酒酵母一起接種于YPD培養(yǎng)基中，使接種后酵母與芽孢桿菌的菌數分別為10⁴個/mL、10¹⁰個/mL，與30℃靜置培養(yǎng)72h。結果發(fā)現，與單獨培養(yǎng)相比，乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、異丁酸苯乙酯、2,3-二氫苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、法呢醇、β-香茅醇等物質含量都有一定程度的升高。

實施例4釀酒酵母與芽孢桿菌的混合培養(yǎng)

將釀酒酵母與B.cereus CCTCC NO:M 2013369、B.lentus CCTCC NO:M 2013370、B.methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371分別制成種子液。將按B.cereus CCTCC NO:M 2013369、B.lentus CCTCC NO:M 2013370、B.methylotrophicus CCTCC NO:M 2013371按菌數1:2:2的比例混合后，與釀酒酵母一起接種于培養(yǎng)基中，使接種后酵母與芽孢桿菌的菌數分別為10⁸個/mL、10³個/mL，與40℃100rpm培養(yǎng)16h。結果發(fā)現，與單獨培養(yǎng)相比，乙醛、2-甲基丙醛、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、己酸苯乙酯、異丁酸苯乙酯、2,3-二氫苯并呋喃、2-甲基丙酸、己酸、辛酸、癸酸、法呢醇、β-香茅醇等物質含量都有一定程度的升高。同時，酵母的產酒率也提高了22.3％。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。