本發(fā)明涉及一種高效液相色譜分析方法，尤其是一種用高效液相色譜法測定依維莫司中間體有關(guān)物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

依維莫司(everolimus)是新一代大環(huán)內(nèi)酯類雷帕霉素衍生物藥物。該藥由諾華制藥公司開發(fā)并于2004年首先在德國上市，主要用于：1)其它藥物治療無效的晚期腎癌；2)可增補神經(jīng)鈣蛋白抑制劑環(huán)孢素的免疫抑制作用，用于預(yù)防心臟或腎臟移植的排異反應(yīng)；3)藥物支架用藥，是目前藥物洗脫支架最常用的藥物之一。

(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-十六氫-9,27–二羥基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-[2-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙氧基]-3-甲氧環(huán)己基]-1-甲基乙基]-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-環(huán)氧-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]-氧雜氮雜三十一環(huán)烯-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-戊酮是合成依維莫司的重要中間體，其化學式為C₆₂H₁₀₅NO₁₄Si₂，結(jié)構(gòu)式如下：其中，TBS為叔丁基二甲基硅基，TMS為三甲基硅基。

專利WO2012103959A1和CN101175760A中雖然記載了依維莫司及雷帕霉素相關(guān)衍生物的分析方法，但并未記載該中間體的有關(guān)物質(zhì)測定方法，而且該中間體的有關(guān)物質(zhì)測定對反應(yīng)控制和收率提高有著重要的作用，同時也直接影響著終產(chǎn)品依維莫司的質(zhì)量，所以 建立一種穩(wěn)定有效的有關(guān)物質(zhì)測定方法對該中間體進行質(zhì)量控制是非常必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用高效液相色譜法測定依維莫司中間體有關(guān)物質(zhì)的方法，用于依維莫司中間體的質(zhì)量控制。

為解決上述技術(shù)問題，發(fā)明人通過大量試驗，最終獲得如下技術(shù)方案：

一種用高效液相色譜法測定依維莫司中間體有關(guān)物質(zhì)的方法，是以辛烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以水為流動相A，以乙腈為流動相B，進行梯度洗脫，包括以下步驟：

A、取依維莫司中間體樣品適量，用70％(體積比)乙腈水溶液溶解，配制成每1ml含依維莫司中間體0.20～1.40mg的樣品溶液；

B、設(shè)置流動相流速為0.7～1.1ml/min，檢測波長為262～272nm，柱溫為50～60℃；

C、取A的樣品溶液20μl注入液相色譜儀，完成依維莫司中間體有關(guān)物質(zhì)的測定；

所述的梯度洗脫設(shè)置如下：

進一步的，梯度洗脫的設(shè)置優(yōu)選為：

所述色譜柱的規(guī)格為4.6×150mm，5μm。

所述流動相的流速優(yōu)選為1.0ml/min，檢測波長優(yōu)選為267nm，柱溫優(yōu)選為55℃。

通過各實施例中的數(shù)據(jù)說明，本發(fā)明涉及的有關(guān)物質(zhì)測定方法，可以有效的將依維莫司中間體及其雜質(zhì)分開，而且該方法分離度及靈敏度高，重復(fù)性及耐用性好，分析時間短，操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠，從而可用于依維莫司中間體的質(zhì)量控制，為最終成品的質(zhì)量提供有效保障。

附圖說明

圖1實施例1的依維莫司中間體HPLC圖譜。

圖2實施例2的依維莫司中間體HPLC圖譜。

圖3實施例3的依維莫司中間體HPLC圖譜。

圖4實施例8的依維莫司中間體線性與范圍工作曲線。

具體實施方式

以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的描述，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

實施例1

儀器與條件：Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C8(4.6×150mm，5μm)，檢測波長267nm，柱溫55℃，流速1.0ml/min，以水為流動相A，乙腈為流動相B，按下表進行梯度洗脫。

實驗步驟：將依維莫司中間體用70％(體積比)乙腈水溶液溶解并定量稀釋制成每1ml 中含依維莫司中間體1mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取供試品溶液20μl注入液相色譜儀，按上述條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見附圖1。

附圖1表明，在該色譜條件下，依維莫司中間體峰和雜質(zhì)峰可以完全分離，依維莫司中間體峰的分離度為1.53，保留時間在23.897min。

實施例2

儀器與條件：Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C8(4.6×150mm，5μm)，檢測波長267nm，柱溫55℃，流速1.1ml/min，以水為流動相A，乙腈為流動相B，按下表進行梯度洗脫。

實驗步驟：將依維莫司中間體用70％(體積比)乙腈水溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中含依維莫司中間體1mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取供試品溶液20μl注入液相色譜儀，按上述條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見附圖2。

附圖2表明，在該色譜條件下，依維莫司中間體峰和雜質(zhì)峰可以完全分離，依維莫司中間體峰的分離度為1.58，保留時間在21.918min。

實施例3

儀器與條件：Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C8(4.6×150mm，5μm)，檢測波長267nm，柱溫55℃，流速0.7ml/min，以水為流動相A，乙腈為流動相B，按下表進行梯度洗脫。

實驗步驟：將依維莫司中間體用70％(體積比)乙腈水溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中含依維莫司中間體1mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取供試品溶液20μl注入液相色譜儀，按上述條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見附圖3。

附圖3表明，在該色譜條件下，依維莫司中間體峰和雜質(zhì)峰可以完全分離，依維莫司中間體峰的分離度為3.06，保留時間在26.878min。

實施例4

系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

儀器與條件：同實施例1。

實驗步驟：取本品適量，精密稱定，加70％(體積比)乙腈水溶液溶解并稀釋制成每1ml中含1mg的溶液，作為供試品溶液。取供試品溶液，連續(xù)進樣六次，分別計算依維莫司中間體峰峰面積以及保留時間的相對標準偏差，實驗結(jié)果見表1。

表1 依維莫司中間體系統(tǒng)適用性實驗結(jié)果

由表1可知，依維莫司中間體峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均高于2500，峰面積的相對標準偏差為0.16％(限度2.0％)，保留時間的相對標準偏差為0.15％(限度1.0％)?？梢?，該色譜條件下，依維莫司中間體及其雜質(zhì)可以完全分離，而且相對標準偏差均在中國藥典規(guī)定的限度內(nèi)，所得結(jié)果穩(wěn)定可靠。

實施例5

重復(fù)性實驗

儀器與條件：同實施例1。

實驗步驟：取本品適量，精密稱定，加70％(體積比)乙腈水溶液溶解并稀釋制成每1ml中含1mg的溶液，作為供試品溶液，同法配制6份供試品溶液。取供試品溶液，連續(xù)進樣六次，按面積歸一化法計算依維莫司中間體的有關(guān)物質(zhì)，并計算其相對標準偏差，實驗結(jié)果見表2。

表2 依維莫司中間體重復(fù)性實驗結(jié)果

由表2可知，各供試品溶液中依維莫司中間體的有關(guān)物質(zhì)沒有明顯差異，相對標準偏差為0.0259％，可見本分析檢測方法的重復(fù)性良好。

實施例6

耐用性實驗

儀器與條件：Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C8(4.6×150mm，5μm)，以水為流動相A，乙腈為流動相B，按下表進行梯度洗脫。

實驗步驟：取本品適量，精密稱定，加70％(體積比)乙腈水溶液溶解并稀釋制成每1ml中含1mg的溶液，作為供試品溶液。分別通過改變柱溫、流速和檢測波長，記錄依維莫司中間體有關(guān)物質(zhì)及含量的變化情況(按面積歸一化法計算)，實驗結(jié)果見表3。

表3 依維莫司中間體耐用性實驗結(jié)果

由表3可知，改變柱溫、流速和檢測波長后，依維莫司中間體有關(guān)物質(zhì)及含量的測定結(jié)果沒有明顯差異，可見本發(fā)明分析檢測方法的耐用性良好。

實施例7

檢測限

儀器與條件：同實施例1。

實驗步驟：精密稱取依維莫司中間體9.6mg，置于10ml量瓶中，加70％(體積比)乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度，作為檢測限儲備液。采用加溶劑逐步稀釋法，以S/N≈3時的濃度作為檢測限濃度，此時依維莫司中間體的濃度為0.0288ug/ml，檢測限為0.576ng?？梢姳痉椒皟x器的靈敏度較高。

實施例8

線性與范圍

儀器與條件：同實施例1。

實驗步驟：取依維莫司中間體249.30mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加70％(體積比)乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度，即得線性儲備液。精密量取線性儲備液1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，7.0ml分別置25ml量瓶中，加70％(體積比)乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，依法測定。以供試品溶液的濃度為橫坐標，以依維莫司中間體峰峰面 積為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程為y＝23567.4633x-131.6271，工作曲線見附圖4。

由附圖4可知，圖中趨勢線的相關(guān)系數(shù)r＝0.9994，可見在該色譜條件下，依維莫司中間體在0.20～1.40mg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。