本發(fā)明涉及石油微生物領域，尤其涉及一種在高鹽條件下降解烷烴的鹽東方菌菌株。

背景技術：

在石油開采過程中會產(chǎn)生大量的采出水(producedwater)，即使相當部分回注產(chǎn)油層和含鹽層，但是仍有相當體積的采出水需要排放，基于物理、化學方法去除石油污染物而達到排放標準是普遍采取的方法。生物法如活性污泥法以其成本低廉和環(huán)境友好的優(yōu)點廣泛應用于水處理工藝中，科學家也很早就開展石油污染物的微生物處理的研究。地質(zhì)環(huán)境的差異，有些采出水除含有石油污染物外，還含有較高鹽度(100-400,000mg/l，海水鹽度是35,000mg/l)。石油污染物本就屬于較難生物降解的化合物，而鹽分(尤其是較高濃度的鹽分)會顯著抑制微生物的代謝活性，進一步增加了處理難度。很多海洋細菌(如alcanivorax屬)和耐鹽細菌(如marinobacter屬)通過代謝合成或從胞外轉入水溶性溶質(zhì)進而在胞內(nèi)累積，來維持胞內(nèi)的滲透壓，在0-3mnacl的條件下具有較好的降解石油污染物的能力，在低鹽度和中鹽度采出水的處理中具有潛在的應用前景；而極端嗜鹽古菌普遍采取在極端高鹽條件下最節(jié)能的“鹽泵入”策略，在3-5mnacl的條件下，均能夠維持正常的菌體生長和代謝能力。

近年來，已有多株能夠在高鹽條件下降解石油污染物的極端嗜鹽古菌被分離到。早在1990年，科學家從鹽沼分離到一株能夠降解烷烴的極端嗜鹽古菌eh4，在最適鹽度3.5mnacl條件下培養(yǎng)30天，十四烷烴，十六烷烴和二十烷烴的降解率分別為88％，66％和64％。截至目前，已有多株降解烷烴的極端嗜鹽古菌被分離到，分屬于haloarcula屬，haloferax屬，halobacterium屬和halococcus屬等，他們都能在不小于3mnacl的條件下降解烷烴，且對鉀離子和鎂離子的優(yōu)化可以進一步提高石油污染物的降解率?；旌暇呐闻囵B(yǎng)實驗顯示，在3.9mnacl條件下酸水解酪素和光照可以顯著提高石油污染物的去除率；而且在添加細菌特異的抗生素(不抑制或殺死古菌)后降解效率反而提高，暗示了極端嗜鹽古菌在烷烴降解過程中發(fā)揮的重要作用。haloferaxsp.msnc14菌株還具有降解多環(huán)芳烴菲的能力，并可以產(chǎn)生表面活性劑，利于烷烴等水溶性較差的石油污染物的溶解和吸收。

在高鹽條件下降解芳香族化合物的極端嗜鹽古菌同樣受到科學家的關注。早在1994年科學家就分離到一株能夠在高鹽條件下降解多種芳香族化合物(如對甲基苯甲酸，苯丙酸，肉桂酸和苯甲酸等)的極端嗜鹽古菌haloferaxsp.d1227。巴西科學家對從玻利維亞、智利、波多黎各、沙特阿拉伯和約旦五個國家的高鹽樣品中分離到的44株能夠以對羥基苯甲酸為唯一碳源生長的極端嗜鹽古菌的代謝和遺傳多樣性以及分布規(guī)律進行分析，結果顯示極端嗜鹽古菌可能普遍具有對羥基苯甲酸的降解能力。對其中10株haloferax屬菌株的深入研究表明，很多菌株能夠在高達20％nacl的培養(yǎng)基中以單環(huán)芳香族化合物的混合物(苯甲酸、對羥基苯甲酸和水楊酸)和多環(huán)芳香族化合物的混合物(萘、蒽、菲、芘、苯并[a]蒽)為碳源生長，而且可以降解這些芳香族化合物；將這些極端嗜鹽古菌添加到石油開采的含油含鹽廢水中，可以明顯降低cod(化學需氧量，是有機物相對含量的綜合指標之一)，且遠好于過氧化氫單獨處理。隨后又有多篇極端嗜鹽古菌降解芳香族化合物的報道，包括在174g/lnacl條件下能夠降解對羥基苯甲酸的haloarculasp.d1和在20％nacl條件下具有苯酚降解能力的a235(與haloarcula菌株近緣)。

到目前為止，已有多株能夠在高鹽條件下降解石油污染物的極端嗜鹽古菌被分離獲得，主要集中在haloferax屬和haloarcula屬，但是通過非培養(yǎng)的方式對石油污染的高鹽樣品進行分析，結果顯示halomicrobium屬，halorussus屬和halorientalis屬的菌株是極端嗜鹽古菌的主要類群，暗示可能有降解效率更高的極端嗜鹽古菌尚未被分離和報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一株鹽東方菌菌株(halorientalissp.)im1011，該菌株已于2017年3月15日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.13754。此菌株具有在高鹽條件下降解烷烴的能力，在高鹽采出水的生物處理領域具有潛在的應用前景。

本發(fā)明提供的鹽東方菌菌株分離自天津長蘆塘沽鹽場，此鹽場靠近大港油田，可能會富集有大量具有烷烴降解能力的嗜鹽菌。分離方法是在以十六烷烴為唯一碳源的總鹽度高達20％的合成培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)三周后，涂布在相同培養(yǎng)基固體平板上；經(jīng)兩次劃線獲得單克隆，實驗室內(nèi)部編號為im1011。

經(jīng)測定，該極端嗜鹽古菌有兩個16srrna基因，rrna基因(序列1)與halorientalispersicusd108^t和halorientalisregularistnn28^t的同源性分別為98.40％和98.12％，而rrnb(序列2)基因與halorientalispersicusibrc-m10043^t(＝d108^t)和halorientalisregularisibrc-m10760^t(＝tnn28^t)的同源性分別為98.43％和96.93％，其與halorientalis屬的模式菌株的16srrna序列同源性較高，屬于halorientalis屬，故命名為halorientalissp.im1011。

本發(fā)明提供的鹽東方菌菌株(halorientalissp.)im1011可以在20-25％高鹽條件下降解烷烴，以十六烷烴為例，初始濃度為5克/升，培養(yǎng)3周后降解率高達54％，在含鹽采出水的處理領域具有潛在應用價值。

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1進化樹分析菌株的分類地位。

圖2im1011降解十六烷烴(hexadecane)的氣相色譜圖(dodecane為內(nèi)標)。

具體實施方式

下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

鹽東方菌的分離、制備、培養(yǎng)

本發(fā)明提供的鹽東方菌分離自天津長蘆塘沽鹽場的樣品，分離方法是在以十六烷烴為唯一碳源的總鹽度20％的合成培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)三周后，涂布在相同培養(yǎng)基固體平板上；經(jīng)兩次劃線獲得單克隆，實驗室內(nèi)部編號為im1011。

經(jīng)測定，該菌株有兩個16srrna基因，rrna基因(序列1)與halorientalispersicusd108^t和halorientalisregularistnn28^t的同源性分別為98.40％和98.12％，而rrnb(序列2)基因與halorientalispersicusibrc-m10043^t(＝d108^t)和halorientalisregularisibrc-m10760^t(＝tnn28^t)的同源性分別為98.43％和96.93％，其與halorientalis屬的模式菌株的16srrna基因序列同源性較高，屬于halorientalis屬，故命名為halorientalissp.im1011。

本發(fā)明提供鹽東方菌菌株(halorientalissp.)im1011可以在高達20％鹽度的條件下以十六烷烴為唯一碳源生長，培養(yǎng)基成分為：氯化鈉160克/升，六水合氯化鎂20克/升，七水合硫酸鎂24克/升，氯化鈣0.5克/升，氯化鉀5克/升，碳酸氫鈉0.2克/升，溴化鈉0.6克/升，氯化銨2克/升，磷酸氫二鉀0.2克/升，檸檬鐵銨0.008克/升，微量元素溶液(sl-6)1毫升/升,維生素溶液(vitamin10)3毫升/升，緩沖劑(pipes)8克/升，十六烷烴5克/升，ph7.0。

實施例2

鹽東方菌菌株具有十六烷烴降解能力

在添加了10克/升酵母提取物和7.5克/升酸水解酪素的msm培養(yǎng)基(氯化鈉210克/升，六水合氯化鎂20克/升，七水合硫酸鎂24克/升，氯化鈣0.5克/升，氯化鉀5克/升，碳酸氫鈉0.2克/升，溴化鈉0.6克/升，氯化銨2克/升，磷酸氫二鉀0.2克/升，檸檬鐵銨0.008克/升，微量元素溶液(sl-6)1毫升/升,維生素溶液(vitamin10)3毫升/升，緩沖劑(pipes)8克/升，ph7.0)中活化培養(yǎng)菌體，生長至對數(shù)后期以4％的接種量接種于50毫升msm培養(yǎng)基中，以5克/升十六烷烴為唯一碳源，在250毫升的三角瓶中培養(yǎng)；以不接種菌體的相同培養(yǎng)基作為對照。180轉/分，37度培養(yǎng)24天后，在培養(yǎng)基中添加十二烷烴作為內(nèi)標，用10毫升正己烷萃取培養(yǎng)基中的烷烴，萃取三次，將三份正己烷樣品混合。取1微升混合液，通過配備db-1氣相色譜柱和fid檢測器的agilenttechnology6820氣相色譜儀分析殘留烷烴的含量。樣品氣化程序為40度1分鐘；由40度提高至140度，5度/分；由140度提高至280度，10度/分。進樣器和檢測器的溫度設定為280度。

以烷烴的特征峰的面積作為其定量指標，圖2顯示內(nèi)標十二烷烴特征峰面積的差異并不明顯，而目標污染物十六烷烴經(jīng)halorientalissp.im1011處理后顯著降低。

對降解率進行定量分析，ht為im1011處理后殘留的十六烷烴含量(十六烷烴含量需經(jīng)內(nèi)標歸一化)，hc為對照，降解率(％)＝(hc-ht)/hc。經(jīng)計算，降解率為54％。

實施例3

降解效率的優(yōu)化提高

十六烷烴屬于較難生物降解的石油污染物，以十六烷烴直接培養(yǎng)菌體不僅生長速率較低，而且會額外引入污染物。通過對菌體利用碳源的情況進行研究，發(fā)現(xiàn)該菌以乙酸為碳源可以良好生長。

通過調(diào)整乙酸濃度、培養(yǎng)方式等對菌體生長條件進行優(yōu)化。在添加了酵母提取物和酸水解酪素的msm培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)菌體，生長至對數(shù)后期以4％的接種量接種于50毫升msm培養(yǎng)基中，以2克/升乙酸作碳源，在250毫升的三角瓶中培養(yǎng)6天；然后再添加5克/升十六烷烴，繼續(xù)培養(yǎng)。7天后，十六烷烴降解率將近60％；14天后，十六烷烴降解率大于70％。不僅提高了十六烷烴的降解率，而且縮短了處理時間。

序列表

<110>中國科學院微生物研究所

<120>一株在高鹽條件下降解烷烴的鹽東方菌菌株及其培養(yǎng)方法

<160>2

<210>1

<211>1474

<212>dna

<213>鹽東方菌halorientalissp.

<400>1

attccggttgatcctgccggaggccattgctatcggagtccgatttagccatgctagtcg60

cacgagttcaggctcgtggcagatagctcagtaacacgtggccaaactgccctatggatg120

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