本發(fā)明涉及一種馬克斯克魯維酵母菌凍干菌劑的制備方法及其用途，屬于酵母菌制品的生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬克斯克魯維酵母作為一種廣泛存在于發(fā)酵乳中的酵母，不僅可以發(fā)酵乳糖，更能對(duì)半乳糖進(jìn)行利用，發(fā)酵過(guò)程中可以單獨(dú)或與乳酸菌一起用于發(fā)酵乳品，賦予了產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)特性。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于馬克斯克魯維酵母菌的應(yīng)用，主要集中在新型乳制品的研發(fā)和酯類(lèi)、羧酸、醇類(lèi)、乙酸異戊酯等風(fēng)味物質(zhì)的制備方面。新疆天潤(rùn)生物科技股份有限公司申請(qǐng)的發(fā)明專(zhuān)利<一種優(yōu)質(zhì)酵母菌及其奶啤飲料的制備>(專(zhuān)利號(hào)zl201010256427.x)公布了采用馬克斯克魯維酵母(保藏登記號(hào)cgmccno.3781)生產(chǎn)奶啤的技術(shù)。
在歐洲，食品安全局已將馬克斯克魯維酵母列入食品和飼料添加的安全生物制劑范圍，表明了馬克斯克魯維酵母的安全性和重要價(jià)值。在國(guó)內(nèi)，研究者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到馬克斯克魯維酵母的商業(yè)化價(jià)值，但嚴(yán)重缺乏相關(guān)馬克斯克魯維酵母凍干菌粉的研究，極度不利于馬克斯克魯維酵母高活性菌劑的工業(yè)化應(yīng)用。新疆天潤(rùn)生物科技股份有限公司申請(qǐng)的發(fā)明專(zhuān)利<一種優(yōu)質(zhì)酵母菌及其奶啤飲料的制備>(專(zhuān)利號(hào)zl201010256427.x)，采用馬克斯克魯維酵母生產(chǎn)奶啤時(shí)，需要不斷擴(kuò)培酵母菌種用于生產(chǎn)，存在菌種制備環(huán)節(jié)多，操作復(fù)雜，菌種易污染的問(wèn)題，由于菌種制備的水平不同，也容易造成菌種質(zhì)量的波動(dòng)，由此造成奶啤產(chǎn)品品質(zhì)的波動(dòng)，不利于大規(guī)模奶啤生產(chǎn)的品質(zhì)控制。
真空冷凍干燥技術(shù)是將濕物料或溶液在較低的溫度下凍結(jié)成固態(tài)，然后在真空條件下使其中的水分不經(jīng)液態(tài)直接升華成氣態(tài)，最終使物料脫水的干燥技術(shù)。酵母菌可通過(guò)這種干燥技術(shù)保持較高的生理特性及生物活性，并可直接投入食品發(fā)酵生產(chǎn)中。鑒于馬克斯克魯維酵母優(yōu)良特性及其廣泛使用，對(duì)馬克斯克魯維酵母進(jìn)行凍干菌劑的研究是十分有價(jià)值的。酵母菌株的不同導(dǎo)致菌株對(duì)干燥的耐性產(chǎn)生差異。制備活性干酵母菌劑應(yīng)該有高濃度的酵母菌體和最佳保護(hù)劑，冷凍干燥所得酵母菌菌劑才能夠保持較高的活性。因此，為了確保酵母菌干粉的存活率和發(fā)酵性能，制備過(guò)程中需要注意提高菌體細(xì)胞濃度，篩選最佳的冷凍干燥保護(hù)劑成分組合。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種馬克斯克魯維酵母菌凍干菌劑的制備方法及其用途，所述方法中涉及的馬克斯克魯維酵母菌(kluyveromycesmarxianusvar.marxianus)，已于2010年4月27日保藏于中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，保藏號(hào)：cgmccno.3781，菌株編號(hào)：a3，地址：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)白辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101；本發(fā)明是在專(zhuān)利號(hào)zl201010256427.x的基礎(chǔ)上，對(duì)馬克斯克魯維酵母菌的進(jìn)一步研究，所述的馬克斯克魯維酵母菌高密度培養(yǎng)液中活菌數(shù)可達(dá)3.2×108cfu/ml以上，比yepd培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)果至少高1.1個(gè)數(shù)量級(jí)；發(fā)酵菌液經(jīng)離心后收集菌泥，加入冷凍保護(hù)劑溶液，采用真空冷凍干燥技術(shù)制備凍干菌劑，其保護(hù)劑成分為麥芽糖和脫脂奶粉，可使冷凍干燥活菌率達(dá)到75％以上。該菌劑制備工藝簡(jiǎn)單，制備所得凍干菌劑具有含菌量高、保存時(shí)間長(zhǎng)，使用方便、無(wú)污染、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，可用于奶啤、奶酪的發(fā)酵以及乳清酒、果醋、果汁等的釀造。在奶制品的發(fā)酵中，酒味醇香、產(chǎn)氣性能好、發(fā)酵性能穩(wěn)定。
本發(fā)明所述的一種馬克斯克魯維酵母菌凍干菌劑的制備方法，該方法中涉及的馬克斯克魯維酵母菌kluyveromycesmarxianusvar.marxianus，已于2010年4月27日保藏于中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，保藏號(hào)：cgmccno.3781，菌株編號(hào)：a3，具體操作按下列步驟進(jìn)行：
高密度培養(yǎng)：
a、種子液體的制備：將馬克斯克魯維酵母菌劃線(xiàn)于yepd培養(yǎng)基平板上，放置溫度28-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2天，挑取飽滿(mǎn)的菌種再次劃線(xiàn)于yepd培養(yǎng)基平板上，放置溫度28-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2天后再將菌種接入yepd液體培養(yǎng)基中，溫度28-30℃，160-180r/min搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液；
b、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：稱(chēng)取蔗糖67.37g，酵母浸粉29.7g，玉米漿15.61g，磷酸二氫鉀4.13g，硫酸鎂0.3g，溶于1l蒸餾水中，混合均勻后，溫度121℃滅菌20min；
c、高密度發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟a制得的種子液接入步驟b滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3×106cfu/ml，培養(yǎng)的溫度28-30℃，160-180r/min，搖瓶培養(yǎng)16h后終止發(fā)酵，得到高密度的馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵菌液；
真空冷凍干燥法制備凍干菌劑：
d、離心濃縮：將步驟c制得的高密度馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵菌液在溫度4℃，6000r/min的條件下離心15min，倒掉上清液，得到馬克斯克魯維酵母菌活性菌泥；
e、保護(hù)劑的制備：配制濃度為20-100g/l的麥芽糖，溫度121℃滅菌20min；配制30-120g/l濃度的脫脂奶粉，溫度115℃，滅菌15min，再將配制的兩種保護(hù)劑冷卻后按體積比1:1進(jìn)行混合，得到復(fù)合保護(hù)劑；
f、真空冷凍干燥：將步驟d制備的馬克斯克魯維酵母菌活性菌泥與步驟e得到的復(fù)合保護(hù)劑按體積比1:1充分混合，置于溫度-80℃冰箱中預(yù)凍3h后，在冷阱溫度-40℃，真空度10帕下真空冷凍干燥24h，即得到馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑。
所述方法獲得的馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑在制備發(fā)酵食品添加劑中的用途。
本發(fā)明提供一種馬克斯克魯維酵母菌凍干菌劑的制備方法及其用途，所述方法中涉及的馬克斯克魯維酵母菌(kluyveromycesmarxianusvar.marxianus)，已于2010年4月27日保藏于中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，保藏號(hào)：cgmccno.3781，菌株編號(hào)：a3，地址：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)白辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101。
本發(fā)明所述的一種馬克斯克魯維酵母菌凍干菌劑制備方法及其用途，該菌劑中種子液體培養(yǎng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常用操作，其中用到的yepd培養(yǎng)基平板和液體yepd培養(yǎng)基也均為本領(lǐng)域技術(shù)人員在種子活化時(shí)的常用培養(yǎng)基，均采用標(biāo)準(zhǔn)配方配制。
為了取得很好的種子活化效果，本發(fā)明對(duì)常規(guī)甘油溫度-80℃保存的馬克斯克魯維酵母菌種進(jìn)行兩次平板活化，兩次平板活化后再進(jìn)行液體yepd培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜，從而得到所需種子液，因?yàn)榻?jīng)過(guò)了兩次平板活化，所以能夠確保甘油的完全去除，菌種完全恢復(fù)，有利于后期實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明所述為一種馬克斯克魯維酵母菌的制備方法及其用途，其有益效果如下：本發(fā)明的重點(diǎn)是對(duì)高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行了研究改進(jìn)，發(fā)酵時(shí)所用的馬克斯克魯維酵母菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基配方的組分及其用量是通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析后優(yōu)選而得的，采用此技術(shù)發(fā)酵活菌數(shù)可達(dá)3.2×108cfu/ml以上，比yepd培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)果高1.1個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)馬克斯克魯維酵母菌的生長(zhǎng)繁殖非常有利。
本發(fā)明所述方法獲得的馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑只包含麥芽糖和脫脂奶粉，具有成分簡(jiǎn)單，成本低，無(wú)毒害，凍干保護(hù)效果好等優(yōu)點(diǎn)，能使凍干菌劑活菌率達(dá)到75％以上。
本發(fā)明提供的馬克斯克魯維酵母菌的凍干菌劑具有存活率高、保存時(shí)間長(zhǎng)，成本低，使用方便、無(wú)污染、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)。
本發(fā)明提供的馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑可用于奶啤、奶酪的發(fā)酵；乳清酒、果醋、果汁的釀造；同時(shí)可利于風(fēng)味物質(zhì)乙酸乙酯的生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
高密度培養(yǎng)：
a、種子液體的制備:將馬克斯克魯維酵母菌劃線(xiàn)于yepd培養(yǎng)基平板上，放置溫度28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天，挑取飽滿(mǎn)的菌種再次劃線(xiàn)于yepd培養(yǎng)基平板上，放置溫度28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后再將菌種接入yepd液體培養(yǎng)基中，溫度28℃，160r/min搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液；
b、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：稱(chēng)取蔗糖67.37g，酵母浸粉29.7g，玉米漿15.61g，磷酸二氫鉀4.13g，硫酸鎂0.3g，溶于1l蒸餾水中，混合均勻后，溫度121℃滅菌20min；
c、高密度發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟a制得的種子液接入步驟b滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3×106cfu/ml，培養(yǎng)的溫度28℃，160r/min，搖瓶培養(yǎng)16h后終止發(fā)酵，得到高密度的馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵菌液，培養(yǎng)液中活菌數(shù)可達(dá)3.22×108cfu/ml；
真空冷凍干燥法制備凍干菌劑：
d、離心濃縮：將步驟c制得的高密度馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵菌液在溫度4℃，6000r/min的條件下離心15min，倒掉上清液，得到馬克斯克魯維酵母菌活性菌泥，菌體離心收得率為83.5％；
e、保護(hù)劑的制備：配制濃度為20g/l的麥芽糖，溫度121℃滅菌20min；配制濃度30g/l的脫脂奶粉，溫度115℃，滅菌15min，再將配制的兩種保護(hù)劑冷卻后按體積比1:1進(jìn)行混合，得到復(fù)合保護(hù)劑；
f、真空冷凍干燥：將步驟d制備的馬克斯克魯維酵母菌活性菌泥與步驟e得到的復(fù)合保護(hù)劑按體積比1:1充分混合，置于溫度-80℃冰箱中預(yù)凍3h后，在冷阱溫度-40℃，真空度10帕下真空冷凍干燥24h，即得到馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑，菌體存活率為75.12％。
實(shí)施例2
高密度培養(yǎng)：
a、種子液體的制備:將馬克斯克魯維酵母菌劃線(xiàn)于yepd培養(yǎng)基平板上，放置溫度30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，挑取飽滿(mǎn)的菌種再次劃線(xiàn)于yepd培養(yǎng)基平板上，放置溫度30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后再將菌種接入yepd液體培養(yǎng)基中，溫度30℃，180r/min搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液；
b、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：稱(chēng)取蔗糖67.37g，酵母浸粉29.7g，玉米漿15.61g，磷酸二氫鉀4.13g，硫酸鎂0.3g，溶于1l蒸餾水中，混合均勻后，溫度121℃滅菌20min；
c、高密度發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟a制得的種子液接入步驟b滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3×106cfu/ml，培養(yǎng)的溫度30℃，180r/min，搖瓶培養(yǎng)16h后終止發(fā)酵，得到高密度的馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵菌液，培養(yǎng)液中活菌數(shù)可達(dá)3.32×108cfu/ml；
真空冷凍干燥法制備凍干菌劑：
d、離心濃縮：將步驟c制得的高密度馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵菌液在溫度4℃，6000r/min的條件下離心15min，倒掉上清液，得到馬克斯克魯維酵母菌活性菌泥，菌體離心收得率為83.5％；
e、保護(hù)劑的制備：配制濃度為50g/l的麥芽糖，溫度121℃滅菌20min；配制濃度80g/l的脫脂奶粉，溫度115℃，滅菌15min，再將配制的兩種保護(hù)劑冷卻后按體積比1:1進(jìn)行混合，得到復(fù)合保護(hù)劑；
f、真空冷凍干燥：將步驟d制備的馬克斯克魯維酵母菌活性菌泥與步驟e得到的復(fù)合保護(hù)劑按體積比1:1充分混合，置于溫度-80℃冰箱中預(yù)凍3h后，在冷阱溫度-40℃，真空度10帕下真空冷凍干燥24h，即得到馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑，菌體存活率為76.32％。
實(shí)施例3
高密度培養(yǎng)：
a、種子液體的制備:將馬克斯克魯維酵母菌劃線(xiàn)于yepd培養(yǎng)基平板上，放置溫度29℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，挑取飽滿(mǎn)的菌種再次劃線(xiàn)于yepd培養(yǎng)基平板上，放置溫度29℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后再將菌種接入yepd液體培養(yǎng)基中，溫度29℃，170r/min搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液；
b、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：稱(chēng)取蔗糖67.37g，酵母浸粉29.7g，玉米漿15.61g，磷酸二氫鉀4.13g，硫酸鎂0.3g，溶于1l蒸餾水中，混合均勻后，溫度121℃滅菌20min；
c、高密度發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟a制得的種子液接入步驟b滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3×106cfu/ml，培養(yǎng)的溫度29℃，170r/min，搖瓶培養(yǎng)16h后終止發(fā)酵，得到高密度的馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵菌液，培養(yǎng)液中活菌數(shù)可達(dá)3.28×108cfu/ml；
真空冷凍干燥法制備凍干菌劑：
d、離心濃縮：將步驟c制得的高密度馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵菌液在溫度4℃，6000r/min的條件下離心15min，倒掉上清液，得到馬克斯克魯維酵母菌活性菌泥，菌體離心收得率為83.5％；
e、保護(hù)劑的制備：配制濃度為100g/l的麥芽糖，溫度121℃滅菌20min；配制濃度120g/l的脫脂奶粉，溫度115℃，滅菌15min，再將配制的兩種保護(hù)劑冷卻后按體積比1:1進(jìn)行混合，得到復(fù)合保護(hù)劑；
f、真空冷凍干燥：將步驟d制備的馬克斯克魯維酵母菌活性菌泥與步驟e得到的復(fù)合保護(hù)劑按體積比1:1充分混合，置于溫度-80℃冰箱中預(yù)凍3h后，在冷阱溫度-40℃，真空度10帕下真空冷凍干燥24h，即得到馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑，菌體存活率為76.87％。
實(shí)施例4(對(duì)照)
對(duì)照組將離心后菌泥與滅菌蒸餾水混合均勻，滅菌蒸餾水體積與復(fù)合保護(hù)劑溶液相同，置于溫度-80℃冰箱中預(yù)凍3h后，在冷阱溫度-40℃，真空度10帕下真空冷凍干燥24h，得到馬克斯克魯維酵母菌的凍干粉。
實(shí)施例5
將實(shí)施例1-3中所得馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑與對(duì)照通過(guò)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)，添加復(fù)合保護(hù)劑的馬克斯克魯維酵母菌活菌率可達(dá)75％以上，只添加蒸餾水的對(duì)照組活菌率為6.82％，結(jié)果表明添加凍干保護(hù)劑能夠顯著提高凍干后的菌劑活菌數(shù)。
實(shí)施例6
以奶啤生產(chǎn)為例：
將常規(guī)方法制備的酸奶200kg、水700kg、菠蘿汁50kg、果膠1.5kg、羥甲基纖維素鈉1.5kg、蔗糖酯1.3kg、單甘脂1.2kg、白糖10㎏、蜂蜜5㎏、果葡糖漿5㎏斤，乳酸1.2㎏混合，攪拌均勻，預(yù)熱到60℃均質(zhì)，巴氏滅菌，降溫到20℃，形成發(fā)酵基液；
將實(shí)施例1-3中任意一種所得馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑稱(chēng)取10g，溶解到200g滅菌后降溫至20℃的脫脂奶中，混合攪拌均勻，形成酵母菌液；
將得到的酵母菌液全部倒入發(fā)酵基液中，溫度在20℃，發(fā)酵20小時(shí)，灌裝到玻璃瓶中密封，溫度控制在35℃，發(fā)酵4小時(shí)，經(jīng)滅菌制得奶啤飲料。
采用本發(fā)明所述方法獲得的馬克斯克魯維酵母的凍干菌劑生產(chǎn)奶啤具有工藝簡(jiǎn)單，品質(zhì)穩(wěn)定，易于控制，便于擴(kuò)大生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。