本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及類胡蘿卜素制備領(lǐng)域，更具體地，涉及一種念珠藻黃素生產(chǎn)菌鞘氨醇單胞菌，以及用其生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法。

背景技術(shù)：

類胡蘿卜素是高度不飽和多烯類化合物，含有一系列共軛雙鍵和甲基支鏈。色素的顏色隨著共軛雙鍵的數(shù)目而變化。由于類胡蘿卜素獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它們?cè)卺t(yī)療保健領(lǐng)域起著重要作用。類胡蘿卜素具有抗氧化作用，能夠清除單線態(tài)氧和過氧化自由基，降低自由基對(duì)核酸、蛋白質(zhì)和脂類等的損傷，從而延緩衰老和預(yù)防血栓,動(dòng)脈硬化等疾病。類胡蘿卜素具有增強(qiáng)免疫功能的作用，提高t淋巴細(xì)胞的活力，協(xié)助b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。許多醫(yī)學(xué)研究表明，類胡蘿卜素在預(yù)防心血管疾病、抗癌防癌等方面起著十分重要的作用。目前，類胡蘿卜素作為食用色素、著色劑、營養(yǎng)增補(bǔ)劑等被廣泛應(yīng)用在食品、保健品等領(lǐng)域。然而，動(dòng)物和人體并不能合成類胡蘿卜素，主要依賴飲食中類胡蘿卜素的供應(yīng)。隨著類胡蘿卜素藥用價(jià)值的不斷發(fā)現(xiàn)，人類對(duì)類胡蘿卜素的種類和產(chǎn)量需求越來越大，但現(xiàn)在采用的微生物如薇藻，細(xì)菌等發(fā)酵制備天然類胡蘿卜素成本較高，產(chǎn)量較低，還有很大的提升空間。

鞘氨醇單胞菌屬是一類豐富的新型微生物資源，其在地球上分布及其廣泛，在各種水體，土壤，大氣以及極端環(huán)境都有它存在的蹤影。鞘氨醇單胞菌生長環(huán)境粗糙，生長迅速，操作方便，培養(yǎng)條件易于控制，能夠利用生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)且不易污染。大多數(shù)的鞘氨醇單胞菌會(huì)產(chǎn)生一種叫念珠藻黃素的黃色類胡蘿卜素，念珠藻黃素是一種β-胡蘿卜素的聚羥基衍生物，其生物合成步驟為：牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸→八氫番茄紅素→番茄紅素→β胡蘿卜素→玉米黃素→念珠藻黃素，催化酶依次為crte，crti，crty,crtz，crtg,其中crtg還可以β胡蘿卜素為底物，在β環(huán)2’位加羥基。目前只在某種原核生物及一些藍(lán)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了這種罕見類胡蘿卜素，由于念珠藻黃素在自然界的存在量有限，至今還未對(duì)它進(jìn)行深入的功能研究。本發(fā)明分離得到的鞘氨醇單胞菌念珠藻黃素含量高，可達(dá)3.98±0.5mg/g，占總色素的90％及以上，具有極大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力，也可為念珠藻黃素功能研究提供較好的基礎(chǔ)條件。

玉米黃質(zhì)是眼睛晶狀體中僅有的2種類胡蘿卜素之一，是一種強(qiáng)氧化劑，它可以淬滅單線態(tài)氧和光敏劑的三重態(tài)，清除損害性氧自由基，防止膜脂過氧化，減少脂褐素的形成，進(jìn)而防止白內(nèi)障的形成。如果沒有正常功能的黃斑區(qū)，認(rèn)得主要視力功能會(huì)逐漸損壞，甚至有失明的危險(xiǎn)。在黃斑區(qū)中心點(diǎn)，入射光最強(qiáng)，產(chǎn)生的活性氧也最多。大量流行病學(xué)研究結(jié)果也表明，玉米黃質(zhì)具有特異性吸收對(duì)視網(wǎng)膜最具損傷性的藍(lán)色光線的作用，從而保護(hù)視網(wǎng)膜中央凹的視錐細(xì)胞。許多研究表明，短期增加玉米黃質(zhì)的攝入量，可以使黃斑色素增加，從而增強(qiáng)黃斑區(qū)對(duì)抗有害物質(zhì)和光射線損害的能力，預(yù)防和減緩老年性黃斑變性。另外，玉米黃質(zhì)本身具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，對(duì)促進(jìn)人體的生長發(fā)育、保護(hù)視力與上皮細(xì)胞、提高抗病能力、延長壽命等具有特殊的功效。而人體并不能合成玉米黃質(zhì)，必須從飲食中獲取。

蝦青素，是一種獨(dú)特的酮式類胡蘿卜素，也是類胡蘿卜素合成的最高級(jí)別產(chǎn)物，呈深粉紅色，化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于β-胡蘿卜素。而β-胡蘿卜素、葉黃素、角黃質(zhì)等都是類胡蘿卜素合成的中間產(chǎn)物。蝦青素具有極強(qiáng)的抗氧化活性，廣泛存在于生物界，特別是蝦、蟹、魚、藻體，是海洋生物內(nèi)主要的類胡蘿卜素之一。蝦青素最初被用作水產(chǎn)業(yè)的飼料添加劑，后來人們發(fā)現(xiàn)它具有極強(qiáng)的抗氧化活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫力活性及抗腫瘤活性，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景。到目前為止，蝦青素的來源主要有：化學(xué)合成、從甲殼類動(dòng)物的廢棄物中提取、雨生紅球藻、紅發(fā)夫酵母?；瘜W(xué)合成的動(dòng)物利用率低；甲殼類動(dòng)物的廢棄物提取成本高，產(chǎn)量低；雨生紅球藻生長條件苛刻，周期長，占地面積大。所以有必要尋找新型蝦青素生產(chǎn)來源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鞘氨醇單胞菌，一種類胡蘿卜素生產(chǎn)菌株的培育方法,及其在生產(chǎn)類胡蘿卜素中的應(yīng)用；同時(shí)還提供類胡蘿卜素?zé)o色八氫番茄紅素生產(chǎn)菌sp-phy，紅色番茄紅素生產(chǎn)菌sp-lyc，深黃色玉米黃素生產(chǎn)菌sp-zea的培育方法，在工業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素中的應(yīng)用；蝦青素生產(chǎn)菌株的培育方法所得蝦青素生產(chǎn)菌株sp-ast，及其在在工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種鞘氨醇單胞菌，保藏號(hào)為cgmccno.12394。

類胡蘿卜素生產(chǎn)菌株的培育方法,該方法包括下述步驟：

(1)菌種準(zhǔn)備：以念珠藻黃素生產(chǎn)菌保藏號(hào)為cgmccno.12394的鞘氨醇單胞菌野生型菌株為出發(fā)菌株，將鞘氨醇單胞菌出發(fā)菌株接種至lb瓊脂培養(yǎng)基斜面中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-28℃，培養(yǎng)時(shí)間為40-48h；從活化的斜面上挑一環(huán)菌體接種到tb培養(yǎng)基中搖瓶振蕩培養(yǎng)12-20h，tb培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5，使od600＝0.7-0.9；得到培養(yǎng)菌液后，取培養(yǎng)菌液10ml離心，得到菌體，用等體積磷酸緩沖鹽溶液將菌體洗滌2次，將洗滌后的菌液離心收集；

(2)ntg誘變：向(1)得到的菌體中加入10ml磷酸緩沖鹽溶液，再加入0.05-0.2mg/mlntg，在20-25℃,60-80rpm搖床中避光處理20-30min，取出用ntg處理后的液體，離心收集菌體，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，再用濃度為1mol/l的nacl重懸，將誘變后的菌體于再生培養(yǎng)基中再生誘變菌株，28攝氏度培養(yǎng)，220rpm,避光培養(yǎng)6小時(shí)。再生培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)將步驟(2)中再生后的誘變菌株，離心收集菌體，用1ml滅菌ddh2o懸浮菌體，涂布于10到15個(gè)lb固體培養(yǎng)平板上，放于28攝氏度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48小時(shí)后可長出單克隆。

(4)菌株初篩：取出步驟(3)中的已長出單克隆的lb固體培養(yǎng)平板，挑取有顏色變化的菌落；

(5)菌株復(fù)篩：將初篩得到的有顏色變化的菌株挑到tb培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，用hplc方法檢測(cè)其色素種類和含量；

(6)連續(xù)傳代穩(wěn)定性考察：經(jīng)hplc檢測(cè)誘變菌株色素組成和含量，共獲得三株有色素變化的突變株，將有色素變化的突變株連續(xù)傳代五代，重復(fù)測(cè)其色素種類及產(chǎn)量，檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性，得到無色八氫番茄紅素生產(chǎn)菌sp-phy，紅色番茄紅素生產(chǎn)菌sp-lyc，深黃色玉米黃素生產(chǎn)菌sp-zea。

所述的類胡蘿卜素生產(chǎn)菌株的培育方法所得無色八氫番茄紅素生產(chǎn)菌sp-phy，紅色番茄紅素生產(chǎn)菌sp-lyc，深黃色玉米黃素生產(chǎn)菌sp-zea。

所述的無色八氫番茄紅素生產(chǎn)菌sp-phy，紅色番茄紅素生產(chǎn)菌sp-lyc，深黃色玉米黃素生產(chǎn)菌sp-zea在工業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素中的應(yīng)用。

鞘氨醇單胞菌八氫番茄紅素生產(chǎn)菌株sp-phy的選育方法，該方法包括如下步驟：

(1)將鞘氨醇單胞菌出發(fā)菌株kib接種至lb瓊脂培養(yǎng)基斜面中，于28℃培養(yǎng)48h，lb瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，ph6.5；

(2)從活化的斜面上挑取一環(huán)菌體接種到搖瓶，28℃,220rpm培養(yǎng)12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中搖瓶培養(yǎng)基為tb，tb培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培養(yǎng)好的菌液10ml,離心收集菌體，用等體積的磷酸緩沖鹽溶液將菌體洗滌兩次，將洗滌后的菌液離心收集；

(4)ntg誘變：向離心得到的菌體中加入10ml磷酸緩沖鹽溶液，然后加入ntg，使ntg終濃度為0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光處理60min；

(5)取出上述用ntg處理后的液體，離心收集菌體，用10ml磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次，再用濃度為1mol/l的nacl重懸，將誘變后的菌體于再生培養(yǎng)基中再生誘變菌株，28攝氏度培養(yǎng)，220rpm,避光培養(yǎng)6小時(shí)。再生培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)將步驟(5)中再生后的誘變菌株，離心收集菌體，用1ml滅菌ddh2o懸浮菌體，涂布于10到15個(gè)lb固體培養(yǎng)平板上，放于28攝氏度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48小時(shí)后可長出單克隆。

(7)菌株初篩：取出步驟(6)中的已長出單克隆的lb固體培養(yǎng)平板，光下觀察，根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行初篩；類胡蘿卜素的顏色隨著共軛雙鍵的數(shù)目而變動(dòng)，共軛雙鍵的數(shù)目越多，顏色移向紅色越深，從八氫番茄紅素、番茄紅素、玉米黃素、念珠藻黃素顏色依次遞增，挑取顏色變化成白色的菌落若干；

(8)菌株復(fù)篩：將上述挑選好的有顏色變化成白色的菌落若干，轉(zhuǎn)接到tb培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm搖床培養(yǎng)48h，測(cè)其類胡蘿卜素種類及含量；

(9)類胡蘿卜素含量測(cè)定：取步驟(8)挑選的菌株發(fā)酵液1ml加入離心管中，用200μl丙酮振蕩，萃取類胡蘿卜素，將萃取液用0.22μm有機(jī)相過濾膜過濾，濾液用于hplc色素分析，其色素譜中，如圖1，信號(hào)峰ⅴ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-phy的色素組成，主要成分為八氫番茄紅色，獲得八氫番茄紅素生產(chǎn)菌。

鞘氨醇單胞菌番茄紅素生產(chǎn)菌株sp-lyc的選育方法，該方法包括下述步驟：

(1)將鞘氨醇單胞菌出發(fā)菌株接種至lb瓊脂培養(yǎng)基斜面中，于28℃培養(yǎng)48h。lb瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，ph6.5；

(2)從活化的斜面上挑取一環(huán)菌體接種到搖瓶，28℃,220rpm培養(yǎng)12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中搖瓶培養(yǎng)基為tb培養(yǎng)基：為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培養(yǎng)好的菌液10ml,離心收集菌體，用等體積的磷酸緩沖鹽溶液將菌體洗滌兩次，將洗滌后的菌液離心收集；

(4)ntg誘變：向離心得到的菌體中加入10ml磷酸緩沖鹽溶液，然后加入ntg，使ntg終濃度為0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光處理60min；

(5)取出上述用ntg處理后的液體，離心收集菌體，用10ml磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次，再用1.0mol/l的nacl10ml重懸，將誘變后的菌體于再生培養(yǎng)基中再生誘變菌株，28攝氏度培養(yǎng)，220rpm,避光培養(yǎng)6小時(shí)。再生培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)將步驟(5)中再生后的誘變菌株，離心收集菌體，用1ml滅菌ddh2o懸浮菌體，涂布于10到15個(gè)lb固體培養(yǎng)平板上，放于28攝氏度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48小時(shí)后可長出單克隆。

(7)菌株初篩：取出步驟(6)中的已長出單克隆的lb固體培養(yǎng)平板，光下觀察，根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行初篩；類胡蘿卜素的顏色隨著共軛雙鍵的數(shù)目而變動(dòng)，共軛雙鍵的數(shù)目越多，顏色移向紅色越深，從八氫番茄紅素、番茄紅素、玉米黃素、念珠藻黃素顏色依次遞增，挑取顏色變化成紅色的菌落若干；

(8)菌株復(fù)篩：將上述挑選好的有顏色變化成紅色的菌落若干，轉(zhuǎn)接到tb培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm搖床培養(yǎng)48h，測(cè)其類胡蘿卜素種類及含量；

(9)類胡蘿卜素測(cè)定：取步驟(8)挑選的菌株發(fā)酵液1ml加入離心管中，用200μl丙酮振蕩，萃類胡蘿卜素，將萃取液用0.22μm有機(jī)相過濾膜過濾，濾液用于hplc色素分析，其色素譜中，如圖1，信號(hào)峰ⅳ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-lyc的色素組成，主要成分是番茄紅素，獲得番茄紅素生產(chǎn)菌。

鞘氨醇單胞菌玉米黃素生產(chǎn)菌株sp-zea的選育方法，該方法包括下述步驟：

(1)將鞘氨醇單胞菌出發(fā)菌株kib接種至lb瓊脂培養(yǎng)基斜面中，于28℃培養(yǎng)48h，lb瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，ph6.5；

(2)從活化的斜面上挑取一環(huán)菌體接種到搖瓶，28℃,220rpm培養(yǎng)12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中搖瓶培養(yǎng)基為tb。tb培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培養(yǎng)好的菌液10ml,離心收集菌體，用等體積的磷酸緩沖鹽溶液將菌體洗滌兩次，將洗滌后的菌液離心收集；

(4)ntg誘變：向離心得到的菌體中加入10ml磷酸緩沖鹽溶液，然后加入ntg，使ntg終濃度為0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光處理60min；

(5)取出上述用ntg處理后的液體，離心收集菌體，用10ml磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次，再用1.0mol/l的nacl10ml重懸，將誘變后的菌體于再生培養(yǎng)基中再生誘變菌株，28攝氏度培養(yǎng)，220rpm,避光培養(yǎng)6小時(shí)。再生培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)將步驟(5)中再生后的誘變菌株，離心收集菌體，用1ml滅菌ddh2o懸浮菌體，涂布于10到15個(gè)lb固體培養(yǎng)平板上，放于28攝氏度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48小時(shí)后可長出單克隆。

(7)菌株初篩：取出步驟(6)中的已長出單克隆的lb固體培養(yǎng)平板，光下觀察，根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行初篩；類胡蘿卜素的顏色隨著共軛雙鍵的數(shù)目而變動(dòng)，共軛雙鍵的數(shù)目越多，顏色移向紅色越深，從八氫番茄紅素、番茄紅素、玉米黃素、念珠藻黃素顏色依次遞增，挑取深黃色的菌落；

(8)菌株復(fù)篩：將上述挑選好的深黃色的菌落若干，轉(zhuǎn)接到tb培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm搖床培養(yǎng)48h，測(cè)其類胡蘿卜素種類及含量；

(9)類胡蘿卜素測(cè)定：取步驟(8)挑選的菌株發(fā)酵液1ml加入離心管中，用200μl丙酮振蕩，萃取類胡蘿卜素，將萃取液用0.22μm有機(jī)相過濾膜過濾，濾液用于hplc色素分析，其色素譜中，如圖1，信號(hào)峰ⅲ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-zea的色素組成，主要成分為玉米黃素，獲得玉米黃素生產(chǎn)菌。

蝦青素生產(chǎn)菌株的培育方法,該方法包括下述步驟：

(1)菌種準(zhǔn)備：以念珠藻黃素生產(chǎn)菌保藏號(hào)為cgmccno.12394的鞘氨醇單胞菌野生型菌株kib為出發(fā)菌株。將鞘氨醇單胞菌出發(fā)菌株kib接種至lb瓊脂培養(yǎng)基斜面中，于28℃培養(yǎng)48h，lb瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，ph6.5；

(2)從活化的斜面上挑取一環(huán)菌體接種到搖瓶，28℃,220rpm培養(yǎng)12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中搖瓶培養(yǎng)基為tb。tb培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培養(yǎng)好的菌液10ml,離心收集菌體，用等體積的磷酸緩沖鹽溶液將菌體洗滌兩次，將洗滌后的菌液離心收集；

(4)ntg誘變：向離心得到的菌體中加入10ml磷酸緩沖鹽溶液，然后加入ntg，使ntg終濃度為0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光處理60min；

(5)取出上述用ntg處理后的液體，離心收集菌體，用10ml磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次，再用1.0mol/l的nacl10ml重懸，將誘變后的菌體于再生培養(yǎng)基中再生誘變菌株，28攝氏度培養(yǎng)，220rpm,避光培養(yǎng)6小時(shí)。再生培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)將步驟(5)中再生后的誘變菌株，離心收集菌體，用1ml滅菌ddh2o懸浮菌體，涂布于10到15個(gè)lb固體培養(yǎng)平板上，放于28攝氏度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48小時(shí)后可長出單克隆。

(7)菌株初篩：取出步驟(6)中的已長出單克隆的lb固體培養(yǎng)平板，光下觀察，根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行初篩；類胡蘿卜素的顏色隨著共軛雙鍵的數(shù)目而變動(dòng)，共軛雙鍵的數(shù)目越多，顏色移向紅色越深，從八氫番茄紅素、番茄紅素、玉米黃素、念珠藻黃素顏色依次遞增，挑取深黃色的菌落；

(8)菌株復(fù)篩：將上述挑選好的深黃色的菌落若干，轉(zhuǎn)接到tb培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm搖床培養(yǎng)48h，測(cè)其類胡蘿卜素種類及含量；

(9)類胡蘿卜素測(cè)定：取步驟(8)挑選的菌株發(fā)酵液1ml加入離心管中，用200μl丙酮振蕩，萃取類胡蘿卜素，將萃取液用0.22μm有機(jī)相過濾膜過濾，濾液用于hplc色素分析，其色素譜中，如圖1，信號(hào)峰ⅲ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-zea的色素組成，主要成分為玉米黃素，獲得玉米黃素生產(chǎn)菌sp-zea。

(9)受體細(xì)胞sp-zea感受態(tài)的制備：1)取出從4℃冰箱中保藏的(9)所得玉米黃素生產(chǎn)菌sp-zea,挑取至lb液體培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm過夜培養(yǎng)15-18小時(shí)，活化菌體；2)用移液槍吸取2.5ml步驟1的培養(yǎng)物在無菌超凈臺(tái)接種于50mltb培養(yǎng)基中，28℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至od600nm＝0.8；3)將步驟2的菌液冰浴10min后，放入離心管中，4℃/5000rpm離心5min，棄上清，收集細(xì)胞；4)在無菌超凈臺(tái)上用4℃預(yù)冷的20ml的10％甘油通過移液槍吹懸上一步驟所得細(xì)胞，4℃、5000rpm離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，漂洗2次；5)在無菌超凈臺(tái)上用2ml10％甘油吹懸步驟4得到的細(xì)胞，分裝于離心管中，-80℃保存；

(10)載體構(gòu)建：1)將質(zhì)粒phsg398-reps用限制性內(nèi)切酶smaⅰ酶切及去磷酸化，回收dna片段，2)以衣藻基因組為模板，以bktf和bktr分別為上下游引物，擴(kuò)增酮化酶bkt基因，3)連接步驟1,2所得到的dna片段，得到重組質(zhì)粒phsg398-reps-bkt；

(11)電擊轉(zhuǎn)化：1)取上述步驟所構(gòu)建的質(zhì)粒phsg398-reps-bkt100ng，分別加入到1管步驟1制備的感受態(tài)細(xì)胞中，在冰上通過移液槍輕微吐吸使所述質(zhì)粒dna和感受態(tài)細(xì)胞充分混勻，冰浴2min；2)將完成步驟1)的體系轉(zhuǎn)移至0℃預(yù)冷的電擊杯中，用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊；3)完成步驟2)后，立即向電擊杯中加入tb培養(yǎng)基，混勻；4)完成步驟3)后，將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，28℃,220rpm振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，5)將完成步驟4的培養(yǎng)體系涂布于含有終濃度為15μg/ml氯霉素的lb固體培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)48小時(shí)；

(12)轉(zhuǎn)化子色素分析：1)隨機(jī)挑取若干轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接到tb培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm搖床培養(yǎng)48h，測(cè)其類胡蘿卜素種類及含量；2)類胡蘿卜素測(cè)定：取上述挑選的菌株發(fā)酵液1ml加入離心管中，用200μl丙酮振蕩，萃取類胡蘿卜素，將萃取液用0.22μm有機(jī)相過濾膜過濾，濾液用于hplc，經(jīng)hplc色素分析其色素譜，如圖1，信號(hào)峰ⅱ為鞘氨醇單胞菌工程菌株sp-ast的色素組成，主要成分為蝦青素，得到蝦青素生產(chǎn)菌株sp-ast。

所述的蝦青素生產(chǎn)菌株的培育方法所得蝦青素生產(chǎn)菌株sp-ast。

所述的蝦青素生產(chǎn)菌株sp-ast在工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的方法得到的八氫番茄紅素生產(chǎn)菌sp-phy、番茄紅素生產(chǎn)菌sp-lyc及玉米黃素生產(chǎn)菌sp-zea可用于工業(yè)化生產(chǎn)八氫番茄紅素、番茄紅素及玉米黃素。

本發(fā)明得到的3種突變株連續(xù)傳代5次后，類胡蘿卜素種類及產(chǎn)量穩(wěn)定。同時(shí)將這3株搖瓶培養(yǎng)，其八氫番茄紅素、番茄紅素、玉米黃素的含量分別可達(dá)3.7±0.5mg/g，3.9±0.5mg/g，4.0±0.5mg/g，分別占總色素的90％及以上。具有極大的工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

本發(fā)明向突變株玉米黃素生產(chǎn)菌sp-zea引入酮化酶基因bkt，使其改造成蝦青素生產(chǎn)菌sp-ast，sp-ast的蝦青素含量可達(dá)4.05mg/g，占總色素的90％及以上，具有極大的工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1-4中sp-kib，sp-ast，sp-zea，sp-lyc，sp-phy的hplc色素分析圖譜。信號(hào)峰ⅰ為鞘氨醇單胞菌野生型菌株sp-kib的色素組成，主要成分為念珠藻黃素，其保留時(shí)間為2.198min,最大吸收波長為480.8nm；信號(hào)峰ⅱ為鞘氨醇單胞菌工程菌株sp-ast的色素組成，主要成分為蝦青素，其保留時(shí)間為2.842min,最大吸收波長為480.8nm；信號(hào)峰ⅲ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-zea的色素組成，主要成分為玉米黃素，其保留時(shí)間為3.137min，最大吸收波長為480.0nm；信號(hào)峰ⅳ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-lyc的色素組成，主要成分是番茄紅素，其保留時(shí)間為5.396min，最大吸收波長為480.8nm；信號(hào)峰ⅴ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-phy的色素組成，主要成分為八氫番茄紅色，其保留時(shí)間為8.121min，最大吸收波長為280.8nm。

圖2為實(shí)施例1中sp-kib及sp-phy的crti部分氨基酸比對(duì)圖。第一行為sp-kib菌株的crti部分氨基酸序列，第二行為sp-phy菌株的crti部分氨基酸序列，由圖可以看出誘變株的crti蛋白第476位氨基酸由甘氨酸變成天冬氨酸。

圖3為實(shí)施例1中sp-phy誘變株5次連續(xù)傳代穩(wěn)定性研究。

圖4為實(shí)施例2中sp-kib及sp-lyc的crty部分氨基酸比對(duì)圖。第一行為sp-kib菌株的crty部分氨基酸序列，第二行為sp-lyc菌株crty部分氨基酸序列，由圖可以看出誘變株的crty蛋白第308位氨基酸由色氨酸變成終止密碼子。

圖5為實(shí)施例2中sp-lyc誘變株5次連續(xù)傳代穩(wěn)定性研究。

圖6為實(shí)施例3中sp-kib及sp-zea的crtg部分氨基酸比對(duì)圖。第一行為sp-kib菌株的crtg部分氨基酸序列，第二行為sp-zea菌株crtg部分氨基酸序列，，由圖可以看出誘變株的crtg蛋白第127位氨基酸由組氨酸變成酪氨酸。

圖7為實(shí)施例3中sp-zea誘變株5次連續(xù)傳代穩(wěn)定性研究。

圖8為實(shí)施例4中的sp-ast工程菌株5次連續(xù)傳代穩(wěn)定性研究。

具體實(shí)施方法

以下結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步地說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，便于更好的理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。

下述實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

儀器或設(shè)備：

色譜柱購自：美國安捷倫科技有限公司，eclipseplusc18rrhd1.8μm，pcr儀購自：美國abi公司，veriti。超高效液相色譜購自：美國安捷倫科技有限公司，1290infinity。超凈工作臺(tái)購自：北京恒奧生物科技有限公司，9sw-cj-1f。ph計(jì)購自：丹佛儀器(北京)有限公司，ub-7。恒溫?fù)u床購自：上海比朗生物科技有限公司，bilon-cos-211b。高壓滅菌器購自：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，yxq-ls-50s。電擊轉(zhuǎn)化儀購自：美國bio-rad公司，genepulserxcell。電泳儀購自：美國bio-rad公司，powerpac。凝膠自動(dòng)成像儀購自：美國labnet公司，uvpec3-310。恒溫水浴鍋購自：常州國宇儀器制造有限公司，hh。普通分光光度計(jì)購自：美國thermoscientific公司，biomate3s。高速離心機(jī)購自：德國eppendorf公司，5804r。

實(shí)施例1：

鞘氨醇單胞菌八氫番茄紅素生產(chǎn)菌株sp-phy的選育。

鞘氨醇單胞菌出發(fā)菌株kib：由本實(shí)驗(yàn)室分離，是在培養(yǎng)海洋微藻aurantiochytriumsp.sk4時(shí)，平板培養(yǎng)基上的污染物，平板培養(yǎng)基配方為：將5g葡萄糖、2g酵母提取物、50％人工海水、8g瓊脂粉和蒸餾水充分混勻并用蒸餾水定容至1l；121攝氏度高溫滅菌20min；人工海水培養(yǎng)為：30gnacl、0.7gkcl、10.8gmgcl2·6h2o、2.638gmgso4、0.756gcacl2和蒸餾水充分混勻并用蒸餾水定容至1l。該菌顏色鮮艷，菌落光滑圓潤，挑取單克隆于lb培養(yǎng)液中，28攝氏度，220rpm培養(yǎng)。鞘氨醇菌(sphingobiumsp.)于2016年4月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，電話：010-64807355，傳真：010-64807288，電子郵件：cgmcc@im.ac.cn，網(wǎng)址：http://www.im.ac.cn)，保藏號(hào)為cgmccno.12394。該生物材料(株)的存活性經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏中心于2016.04.25檢測(cè)為“存活”。

(1)將鞘氨醇單胞菌出發(fā)菌株kib接種至lb瓊脂培養(yǎng)基斜面中，于28℃培養(yǎng)48h，lb瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，ph6.5；

(2)從活化的斜面上挑取一環(huán)菌體接種到搖瓶，28℃,220rpm培養(yǎng)12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中搖瓶培養(yǎng)基為tb，tb培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培養(yǎng)好的菌液10ml,離心收集菌體，用等體積的磷酸緩沖鹽溶液將菌體洗滌兩次，將洗滌后的菌液離心收集；

(4)ntg誘變：向離心得到的菌體中加入10ml磷酸緩沖鹽溶液，然后加入ntg，使ntg終濃度為0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光處理60min；

(5)取出上述用ntg處理后的液體，離心收集菌體，用10ml磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次，再用濃度為1mol/l的nacl重懸，將誘變后的菌體于再生培養(yǎng)基中再生誘變菌株，28攝氏度培養(yǎng)，220rpm,避光培養(yǎng)6小時(shí)。再生培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)將步驟(5)中再生后的誘變菌株，離心收集菌體，用1ml滅菌ddh2o懸浮菌體，涂布于10到15個(gè)lb固體培養(yǎng)平板上，放于28攝氏度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48小時(shí)后可長出單克隆。

(7)菌株初篩：取出步驟(6)中的已長出單克隆的lb固體培養(yǎng)平板，光下觀察，根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行初篩；類胡蘿卜素的顏色隨著共軛雙鍵的數(shù)目而變動(dòng)，共軛雙鍵的數(shù)目越多，顏色移向紅色越深，從八氫番茄紅素、番茄紅素、玉米黃素、念珠藻黃素顏色依次遞增，挑取顏色變化成白色的菌落若干；

(8)菌株復(fù)篩：將上述挑選好的有顏色變化成白色的菌落若干，轉(zhuǎn)接到tb培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm搖床培養(yǎng)48h，測(cè)其類胡蘿卜素種類及含量；

(9)類胡蘿卜素含量測(cè)定：取步驟(8)挑選的菌株發(fā)酵液1ml加入離心管中，用200μl丙酮振蕩，萃取類胡蘿卜素，將萃取液用0.22μm有機(jī)相過濾膜過濾，濾液用于hplc色素分析，其色素譜中，如圖1，信號(hào)峰ⅴ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-phy的色素組成，主要成分為八氫番茄紅色，其保留時(shí)間為8.121min，最大吸收波長為280.8nm。獲得八氫番茄紅素生產(chǎn)菌。

(10)基因水平檢測(cè)誘變體：分別以突變株sp-phy和野生型念珠藻黃素生產(chǎn)菌sp-kib基因組為模板，以spcrtif-ctgatgaccaggaaagcgataat和spcrtir-ctagcccagatcttccagcatc為上下游引物擴(kuò)增后分別得到片段pcrti和kcrti，測(cè)序后，氨基酸序列比對(duì)。pcr體系和步驟如下：

pcrti擴(kuò)增步驟如下：

總反應(yīng)體積20μl，98℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，56℃退火5s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增得到pcrti。

kcrti擴(kuò)增步驟如下：

總反應(yīng)體積20μl，98℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，56℃退火5s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增得到kcrti。

將擴(kuò)增得到的pcrti和kcrti送去測(cè)序公司測(cè)序，得到的測(cè)序結(jié)果在http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/網(wǎng)站在線翻譯成氨基酸并比對(duì)，其誘變株的pcrti蛋白第476位氨基酸由甘氨酸變成天冬氨酸(圖2)，導(dǎo)致其喪失酶活性，類胡蘿卜素合成通路中斷，八氫番茄紅素?zé)o法進(jìn)行脫氫反應(yīng)，造成誘變株中八氫番茄紅素的積累。

連續(xù)傳代穩(wěn)定性考察：將突變株sp-phy在lb平板上連續(xù)傳代，培養(yǎng)24h，取一環(huán)接種到搖瓶再培養(yǎng)48h，測(cè)定每一代的生物量及八氫番茄紅素含量，觀察其穩(wěn)定性。由圖3可發(fā)現(xiàn)突變株sp-phy的生物量和八氫番茄紅素含量略有波動(dòng)，但總體比較穩(wěn)定。突變株sp-phy即為八氫番茄紅素生產(chǎn)菌株。

實(shí)施例2

鞘氨醇單胞菌番茄紅素生產(chǎn)菌株sp-lyc的選育。

(1)將鞘氨醇單胞菌出發(fā)菌株接種至lb瓊脂培養(yǎng)基斜面中，于28℃培養(yǎng)48h。lb瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，ph6.5；

(2)從活化的斜面上挑取一環(huán)菌體接種到搖瓶，28℃,220rpm培養(yǎng)12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中搖瓶培養(yǎng)基為tb培養(yǎng)基：為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培養(yǎng)好的菌液10ml,離心收集菌體，用等體積的磷酸緩沖鹽溶液將菌體洗滌兩次，將洗滌后的菌液離心收集；

(4)ntg誘變：向離心得到的菌體中加入10ml磷酸緩沖鹽溶液，然后加入ntg，使ntg終濃度為0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光處理60min；

(5)取出上述用ntg處理后的液體，離心收集菌體，用10ml磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次，再用1.0mol/l的nacl10ml重懸，將誘變后的菌體于再生培養(yǎng)基中再生誘變菌株，28攝氏度培養(yǎng)，220rpm,避光培養(yǎng)6小時(shí)。再生培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)將步驟(5)中再生后的誘變菌株，離心收集菌體，用1ml滅菌ddh2o懸浮菌體，涂布于10到15個(gè)lb固體培養(yǎng)平板上，放于28攝氏度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48小時(shí)后可長出單克隆。

(7)菌株初篩：取出步驟(6)中的已長出單克隆的lb固體培養(yǎng)平板，光下觀察，根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行初篩；類胡蘿卜素的顏色隨著共軛雙鍵的數(shù)目而變動(dòng)，共軛雙鍵的數(shù)目越多，顏色移向紅色越深，從八氫番茄紅素、番茄紅素、玉米黃素、念珠藻黃素顏色依次遞增，挑取顏色變化成紅色的菌落若干；

(8)菌株復(fù)篩：將上述挑選好的有顏色變化成紅色的菌落若干，轉(zhuǎn)接到tb培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm搖床培養(yǎng)48h，測(cè)其類胡蘿卜素種類及含量；

(9)類胡蘿卜素測(cè)定：取步驟(8)挑選的菌株發(fā)酵液1ml加入離心管中，用200μl丙酮振蕩，萃類胡蘿卜素，將萃取液用0.22μm有機(jī)相過濾膜過濾，濾液用于hplc色素分析，其色素譜中，如圖1，信號(hào)峰ⅳ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-lyc的色素組成，主要成分是番茄紅素，其保留時(shí)間為5.396min，最大吸收波長為480.8nm。獲得番茄紅素生產(chǎn)菌。

(10)基因水平檢測(cè)誘變體：分別以突變株sp-lyc和野生型念珠藻黃素生產(chǎn)菌sp-kib基因組為模板，以spcrtyf-atgacaaaccggttggactgcgat和spcrtyr-tcaggcgggcggattcagc為上下游引物擴(kuò)增后分別得到片段lcrty和kcrty，測(cè)序后，氨基酸序列比對(duì)。pcr體系和步驟如下：

pcrti擴(kuò)增步驟如下：

總反應(yīng)體積20μl，98℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，58℃退火5s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增得到lcrty。

kcrty擴(kuò)增步驟如下：

總反應(yīng)體積20μl，98℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，58℃退火5s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增得到kcrty。

將擴(kuò)增得到的lcrty和kcrty送去測(cè)序公司測(cè)序，得到的測(cè)序結(jié)果在http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/網(wǎng)站在線翻譯成氨基酸并比對(duì)，其誘變株的lcrty蛋白第308位氨基酸由色氨酸變成終止密碼子(如圖4)，導(dǎo)致其喪失酶活性，類胡蘿卜素合成通路中斷，番茄紅素?zé)o法進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，造成誘變株中番茄紅素的積累。

連續(xù)傳代穩(wěn)定性考察：將突變株sp-lyc在lb平板上連續(xù)傳代，培養(yǎng)24h，取一環(huán)接種到搖瓶再培養(yǎng)48h，測(cè)定每一代的生物量及番茄紅素含量，觀察其穩(wěn)定性。有圖5可發(fā)現(xiàn)突變株sp-lyc的生物量和番茄紅素含量略有波動(dòng)，但總體比較穩(wěn)定。突變株sp-lyc即為番茄紅素生產(chǎn)菌株。

實(shí)施例3

鞘氨醇單胞菌玉米黃素生產(chǎn)菌株sp-zea的選育。

(1)將鞘氨醇單胞菌出發(fā)菌株kib接種至lb瓊脂培養(yǎng)基斜面中，于28℃培養(yǎng)48h，lb瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，ph6.5；

(2)從活化的斜面上挑取一環(huán)菌體接種到搖瓶，28℃,220rpm培養(yǎng)12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中搖瓶培養(yǎng)基為tb。tb培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培養(yǎng)好的菌液10ml,離心收集菌體，用等體積的磷酸緩沖鹽溶液將菌體洗滌兩次，將洗滌后的菌液離心收集；

(4)ntg誘變：向離心得到的菌體中加入10ml磷酸緩沖鹽溶液，然后加入ntg，使ntg終濃度為0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光處理60min；

(5)取出上述用ntg處理后的液體，離心收集菌體，用10ml磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次，再用1.0mol/l的nacl10ml重懸，將誘變后的菌體于再生培養(yǎng)基中再生誘變菌株，28攝氏度培養(yǎng)，220rpm,避光培養(yǎng)6小時(shí)。再生培養(yǎng)基為酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)將步驟(5)中再生后的誘變菌株，離心收集菌體，用1ml滅菌ddh2o懸浮菌體，涂布于10到15個(gè)lb固體培養(yǎng)平板上，放于28攝氏度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48小時(shí)后可長出單克隆。

(7)菌株初篩：取出步驟(6)中的已長出單克隆的lb固體培養(yǎng)平板，光下觀察，根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行初篩；類胡蘿卜素的顏色隨著共軛雙鍵的數(shù)目而變動(dòng)，共軛雙鍵的數(shù)目越多，顏色移向紅色越深，從八氫番茄紅素、番茄紅素、玉米黃素、念珠藻黃素顏色依次遞增，挑取深黃色的菌落；

(8)菌株復(fù)篩：將上述挑選好的深黃色的菌落若干，轉(zhuǎn)接到tb培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm搖床培養(yǎng)48h，測(cè)其類胡蘿卜素種類及含量；

(9)類胡蘿卜素測(cè)定：取步驟(8)挑選的菌株發(fā)酵液1ml加入離心管中，用200μl丙酮振蕩，萃取類胡蘿卜素，將萃取液用0.22μm有機(jī)相過濾膜過濾，濾液用于hplc色素分析，其色素譜中，如圖1，信號(hào)峰ⅲ為鞘氨醇單胞菌誘變株sp-zea的色素組成，主要成分為玉米黃素，其保留時(shí)間為3.137min，最大吸收波長為480.0nm。獲得玉米黃素生產(chǎn)菌。

(10)基因水平檢測(cè)誘變體：分別以突變株sp-zea和野生型念珠藻黃素生產(chǎn)菌sp-kib基因組為模板，以spcrtgf-atggtcgcagctattcttttgtccg和spcrtgr-ggcatccgggtgacgcagac為上下游引物擴(kuò)增后分別得到片段zcrtg和kcrtg，測(cè)序后，氨基酸序列比對(duì)。pcr體系和步驟如下：

zcrtg擴(kuò)增步驟如下：

總反應(yīng)體積20μl，98℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，60℃退火5s，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增得到zcrtg。

kcrtg擴(kuò)增步驟如下：

總反應(yīng)體積20μl，98℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，60℃退火5s，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增得到kcrtg。

將擴(kuò)增得到的zcrtg和kcrtg送去測(cè)序公司測(cè)序，得到的測(cè)序結(jié)果在http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/網(wǎng)站在線翻譯成氨基酸并比對(duì)，其誘變株的127位氨基酸由組氨酸變成酪氨酸(如圖6)，導(dǎo)致其喪失酶活性，類胡蘿卜素合成通路中斷，玉米黃素的β環(huán)無法進(jìn)行2’羥化反應(yīng)，造成誘變株中玉米黃素的積累。

連續(xù)傳代穩(wěn)定性考察：將突變株sp-zea在lb平板上連續(xù)傳代，培養(yǎng)24h，取一環(huán)接種到搖瓶再培養(yǎng)48h，測(cè)定每一代的生物量及玉米黃素含量，觀察其穩(wěn)定性。有圖7可發(fā)現(xiàn)突變株sp-lyc的生物量和玉米黃素含量略有波動(dòng)，但總體比較穩(wěn)定。突變株sp-zea即為玉米黃素生產(chǎn)菌株。

實(shí)施例4

鞘氨醇單胞菌蝦青素生產(chǎn)菌株sp-ast的構(gòu)建。

(1)受體細(xì)胞sp-zea感受態(tài)的制備：1)取出從4℃冰箱中保藏的玉米黃素生產(chǎn)菌sp-zea,挑取至lb液體培養(yǎng)基中，于28℃,220rpm過夜培養(yǎng)15-18小時(shí)，活化菌體；2)用移液槍吸取2.5ml步驟1的培養(yǎng)物在無菌超凈臺(tái)接種于50mltb培養(yǎng)基中，28℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至od600nm＝0.8；3)將步驟2的菌液冰浴10min后，放入離心管中，4℃/5000rpm離心5min，棄上清，收集細(xì)胞；4)在無菌超凈臺(tái)上用4℃預(yù)冷的20ml的10％甘油通過移液槍吹懸步驟3得到的細(xì)胞，4℃、5000rpm離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，漂洗2次；5)在無菌超凈臺(tái)上用2ml10％甘油吹懸步驟4得到的細(xì)胞，分裝于離心管(100μl/管)中，-80℃保存。

(2)載體構(gòu)建：1)質(zhì)粒phsg398-reps是由phsg398插入鞘氨醇單胞菌自身復(fù)制子改造而成，可在鞘氨醇單胞菌體內(nèi)復(fù)制。將質(zhì)粒phsg398-reps用限制性內(nèi)切酶smaⅰ消化，回收dna片段。酶切及去磷酸化反應(yīng)的步驟如下所示：

總反應(yīng)體積20μl，在25℃溫浴兩小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳回收相應(yīng)dna片段?；厥账闷稳チ姿峄?，步驟如下：

總反應(yīng)體積50μl，在37℃溫浴30min，過回收柱終止反應(yīng)。

2)以衣藻基因組為模板，以bktf和bktr分別為上下游引物，擴(kuò)增酮化酶bkt基因。pcr體系和步驟如下：

總反應(yīng)體積20μl，98℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，60℃退火5s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。將擴(kuò)增得到的dna片段，膠回收后末端磷酸化，磷酸化反應(yīng)步驟如下所示：

總反應(yīng)體積25μl，37℃溫浴30min，過回收柱終止反應(yīng)。

3)連接步驟1,2所得到的dna片，得到質(zhì)粒phsg398-reps-bkt，步驟如下：

總反應(yīng)體積為10μl，16℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109，隨機(jī)挑取單克隆于搖菌管中，37℃過夜培養(yǎng)，取2ml培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，pcr檢測(cè)，確認(rèn)構(gòu)建成功后得到重組質(zhì)粒phsg398-reps-bkt。

(3)電擊轉(zhuǎn)化：1)取100ng步驟2所構(gòu)建的質(zhì)粒phsg398-reps-bkt，分別加入到1管步驟1制備的感受態(tài)細(xì)胞中，在冰上通過移液槍輕微吐吸使所述質(zhì)粒dna和感受態(tài)細(xì)胞充分混勻，冰浴2min；2)將完成步驟1)的體系轉(zhuǎn)移至0℃預(yù)冷的電擊杯(1mm)中，用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊(電壓25kv/cm，時(shí)間常數(shù)＝5ms)；3)完成步驟2)后，立即向電擊杯中加入1mltb培養(yǎng)基，混勻；4)完成步驟3)后，將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，28℃,220rpm振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。5)將完成步驟4的培養(yǎng)體系涂布于含有終濃度為15μg/ml氯霉素的lb固體培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)48小時(shí)。

(4)轉(zhuǎn)化子色素分析：1)隨機(jī)挑取若干轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接到tb培養(yǎng)基中于28℃,220rpm搖床培養(yǎng)48h，測(cè)其類胡蘿卜素種類及含量。2)類胡蘿卜素測(cè)定：取上述挑選的菌株發(fā)酵液1ml加入離心管中，用200μl丙酮振蕩，萃取類胡蘿卜素，類胡蘿卜素極易提取。將萃取液用0.22μm有機(jī)相過濾膜過濾，濾液用于hplc。經(jīng)hplc色素分析，其色素譜如圖1，紅色信號(hào)峰為鞘氨醇單胞菌工程菌株sp-ast的色素組成，主要成分為蝦青素，其保留時(shí)間為2.842min,最大吸收波長為480.8nm，將sp-zea改造成了一株蝦青素工程菌sp-ast。

(5)連續(xù)傳代穩(wěn)定性考察：將sp-ast在lb平板上連續(xù)傳代，培養(yǎng)24h，取一環(huán)接種到搖瓶再培養(yǎng)48h，測(cè)定每一代的生物量及蝦青素含量，觀察其穩(wěn)定性。有圖8可發(fā)現(xiàn)sp-ast的生物量和蝦青素含量略有波動(dòng)，但總體比較穩(wěn)定。工程菌sp-ast即為蝦青素生產(chǎn)菌株。