【
技術(shù)領(lǐng)域：
：】本發(fā)明涉及目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化方法。
背景技術(shù)：
：：向大腸桿菌、酵母、細(xì)胞等的宿主導(dǎo)入編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的重組基因，可使重組蛋白質(zhì)表達(dá)。對(duì)于表達(dá)的重組蛋白質(zhì)，解析功能或結(jié)構(gòu)，或?yàn)榱俗鳛橹苿┑壤枚枰叩募兓?。在蛋白質(zhì)的純化中，一般使用各種的層析等。在mayanksaraswat,et.al.reviewarticle：preparativepurificationofrecombinantproteins.vol2013:18,2013中，作為重組蛋白質(zhì)的純化方法之一，記載了離子交換層析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】本發(fā)明以提供可簡(jiǎn)便地得到高純度的重組蛋白質(zhì)的純化方法作為課題。【解決課題的技術(shù)方案】本發(fā)明是目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化方法，其包括使含肽標(biāo)簽的氨基酸序列、蛋白質(zhì)分解酶的切斷位點(diǎn)的氨基酸序列及目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列的融合蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)分解酶在溶液中接觸，從融合蛋白質(zhì)切斷肽標(biāo)簽的工序、及通過(guò)使含肽標(biāo)簽、目標(biāo)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)分解酶的溶液與離子交換樹(shù)脂接觸，分離目標(biāo)蛋白質(zhì)和肽標(biāo)簽，取得含目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶液的工序，在融合蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)分解酶的切斷位點(diǎn)的氨基酸序列在肽標(biāo)簽的氨基酸序列和目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間，肽標(biāo)簽是聚陰離子性或聚陽(yáng)離子性。【發(fā)明效果】可由簡(jiǎn)便的方法得到純化度高的重組蛋白質(zhì)。【附圖說(shuō)明】【圖1】是模式地顯示本實(shí)施方式的純化方法的原理的圖。(a)顯示混雜蛋白質(zhì)除去工序、(b)顯示肽標(biāo)簽切斷工序、(c)顯示目標(biāo)蛋白質(zhì)取得工序?！緢D2】是顯示在實(shí)施例1中的sds(十二烷基硫酸鈉)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)的結(jié)果的圖?！緢D3】是顯示在實(shí)施例2中的sds-page的結(jié)果的圖。【圖4】是顯示在實(shí)施例3中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D5】是顯示在實(shí)施例4中的sds-page的結(jié)果的圖。【圖6】是顯示在實(shí)施例5中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D7】是顯示在實(shí)施例6中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D8】是顯示在實(shí)施例7中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D9】是顯示在實(shí)施例8中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D10】是顯示在實(shí)施例9中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D11】是顯示在實(shí)施例10中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D12】是顯示在實(shí)施例11中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D13】是顯示在實(shí)施例12中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D14】是顯示在實(shí)施例13中的sds-page的結(jié)果的圖。【圖15】是顯示在比較例1中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D16】是顯示在實(shí)施例14中的sds-page的結(jié)果的圖。【圖17】是顯示在實(shí)施例15中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D18】是顯示在實(shí)施例16中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D19】是顯示在實(shí)施例17中的sds-page的結(jié)果的圖。【圖20】是顯示在實(shí)施例18中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D21】是顯示在實(shí)施例19中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D22】是顯示在實(shí)施例20中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D23】是顯示在實(shí)施例21中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D24】是顯示在實(shí)施例22中的sds-page的結(jié)果的圖。【圖25】是顯示在實(shí)施例23中的sds-page的結(jié)果的圖。【圖26】是顯示在實(shí)施例24中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D27】是顯示在實(shí)施例25中的sds-page的結(jié)果的圖。【圖28】是顯示在實(shí)施例26中的sds-page的結(jié)果的圖。【圖29】是顯示在實(shí)施例27中的sds-page的結(jié)果的圖?！緢D30】是顯示在實(shí)施例28中的sds-page的結(jié)果的圖。【實(shí)施方式】本發(fā)明的純化方法包括從融合蛋白質(zhì)切斷肽標(biāo)簽的工序(肽標(biāo)簽切斷工序)，及分離目標(biāo)蛋白質(zhì)和肽標(biāo)簽而取得目標(biāo)蛋白質(zhì)的工序(目標(biāo)蛋白質(zhì)取得工序)。(肽標(biāo)簽切斷工序)在肽標(biāo)簽切斷工序中，在溶液中使蛋白質(zhì)分解酶接觸于含肽標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)而從融合蛋白質(zhì)切斷肽標(biāo)簽。融合蛋白質(zhì)含肽標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。肽標(biāo)簽是含2個(gè)殘基以上的酸性氨基酸殘基的聚陰離子性肽標(biāo)簽或含2以上堿性氨基酸殘基的聚陽(yáng)離子性肽標(biāo)簽。作為肽標(biāo)簽，使用聚陰離子性肽標(biāo)簽時(shí)，就酸性氨基酸殘基的數(shù)而言，為了基于肽標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的等電點(diǎn)的差異，由離子交換樹(shù)脂的分離變得更良好，優(yōu)選12個(gè)殘基以上，更優(yōu)選18個(gè)殘基以上，再優(yōu)選24個(gè)殘基以上，特別優(yōu)選30個(gè)殘基以上，最優(yōu)選36個(gè)殘基以上。一方面，酸性氨基酸殘基數(shù)的上限不特別限定，但從對(duì)融合蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)的影響等的觀點(diǎn)來(lái)看優(yōu)選100殘基以下，更優(yōu)選70殘基以下。聚陰離子性肽標(biāo)簽中所含的酸性氨基酸殘基可為天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的任一方，也可為兩方。聚陰離子性肽標(biāo)簽除了酸性氨基酸殘基之外，也可含中性氨基酸殘基及/或堿性氨基酸殘基，酸性氨基酸殘基數(shù)對(duì)肽標(biāo)簽整體的氨基酸殘基數(shù)的比例，為了與切斷的肽標(biāo)簽等的分離變得更良好，優(yōu)選20％以上，更優(yōu)選60％以上。另外，在肽標(biāo)簽整體的序列中，含酸性氨基酸殘基的氨基酸序列可以是酸性氨基酸殘基全部連續(xù)的序列，也可為1個(gè)或多個(gè)的中性氨基酸殘基及/或堿性氨基酸殘基介于酸性氨基酸殘基之間。聚陰離子性肽標(biāo)簽的等電點(diǎn)，為了與目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離變得更良好，優(yōu)選5以下，更優(yōu)選4以下。等電點(diǎn)是水溶液中的正和負(fù)的離子濃度變得相等之時(shí)的ph的值，例如，可由等電點(diǎn)電泳等測(cè)定。作為聚陰離子性肽標(biāo)簽的優(yōu)選的具體例，可舉出下述肽標(biāo)簽1～8(d；天冬氨酸殘基、e；谷氨酸殘基)。<聚陰離子性肽標(biāo)簽>肽標(biāo)簽1eeeeeedddddd(de12，seqidno：1)肽標(biāo)簽2eeeeeeeeeddddddddd(de18，seqidno：2)肽標(biāo)簽3eeeeeeeeeeeedddddddddddd(de24，seqidno：3)肽標(biāo)簽4eeeeeeeeeeeeeeeddddddddddddddd(de30，seqidno：4)肽標(biāo)簽5eeeeeeeeeeeeeeeeeedddddddddddddddddd(de36，seqidno：5)肽標(biāo)簽6nvegktgnatdeeeeeeeeeeeeddddddddddddedsgaeiqdddeegfddeeefddddddehddddleneeneleeleervearkk(ded，seqidno：6)肽標(biāo)簽7dlsnvegktgnatdeeeeeeeeeeeeddddddddddddedsgae(des，seqidno：7)肽標(biāo)簽8eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee(eo24，seqidno：8)當(dāng)作為肽標(biāo)簽使用聚陽(yáng)離子性標(biāo)簽時(shí)，就堿性氨基酸殘基的數(shù)而言，為了基于肽標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的等電點(diǎn)的差異，由離子交換樹(shù)脂的分離變得更良好，優(yōu)選12個(gè)殘基以上，更優(yōu)選18個(gè)殘基以上，還優(yōu)選24個(gè)殘基以上。一方面，堿性氨基酸殘基數(shù)的上限不特別限定，但從對(duì)融合蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)的影響等的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選100殘基以下，更優(yōu)選70殘基以下。聚陽(yáng)離子性肽標(biāo)簽中所含的堿性氨基酸殘基是選自精氨酸酸殘基、組氨酸殘基及賴氨酸殘基的1種或2種以上。聚陽(yáng)離子性肽標(biāo)簽除了堿性氨基酸殘基之外，也可含中性氨基酸殘基及/或酸性氨基酸殘基，就堿性氨基酸殘基數(shù)對(duì)肽標(biāo)簽整體的氨基酸殘基數(shù)的比例而言，為了與切斷的肽標(biāo)簽等的分離變得更良好，優(yōu)選20％以上，更優(yōu)選60％以上。另外，在肽標(biāo)簽整體的序列中，含堿性氨基酸殘基的氨基酸序列可以堿性氨基酸殘基全部連續(xù)的序列，也可為1個(gè)或多個(gè)的中性氨基酸殘基及/或酸性氨基酸殘基介于堿性氨基酸殘基之間。聚陽(yáng)離子性肽標(biāo)簽的等電點(diǎn)，為了與目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離變得更良好，優(yōu)選10以上，更優(yōu)選11以上。目標(biāo)蛋白質(zhì)不特別限定，例如，可舉出酶、受體、干擾素類、白細(xì)胞介素類、抗體、熒光蛋白質(zhì)等的蛋白質(zhì)。目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不特別限定，但當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陰離子性時(shí)，為了與肽標(biāo)簽等的分離變得更良好，優(yōu)選5以上，更優(yōu)選6以上。一方面，當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陽(yáng)離子性時(shí)，等電點(diǎn)優(yōu)選8以下，更優(yōu)選7以下。在融合蛋白質(zhì)中，肽標(biāo)簽也可結(jié)合于目標(biāo)蛋白質(zhì)的n末端側(cè)或c末端側(cè)的任一側(cè)。蛋白質(zhì)分解酶識(shí)別的切斷位點(diǎn)的氨基酸序列插入于目標(biāo)蛋白質(zhì)和肽標(biāo)簽的氨基酸序列之間。蛋白質(zhì)分解酶識(shí)別的切斷位點(diǎn)不特別限定，但例如，可舉出hrv3c、prescission蛋白酶、因子xa、凝血酶、tev蛋白酶等的蛋白質(zhì)分解酶的識(shí)別序列等。通過(guò)使蛋白質(zhì)分解酶在溶液中與融合蛋白質(zhì)接觸，可從融合蛋白質(zhì)切斷肽標(biāo)簽。反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)蛋白質(zhì)分解酶的種類等適宜設(shè)定。融合蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不特別限定，但當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陰離子性時(shí)，為了切斷的肽標(biāo)簽等和目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離變得更良好，優(yōu)選不足6，更優(yōu)選不足5。一方面，當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陽(yáng)離子性時(shí)，優(yōu)選9以上，更優(yōu)選10以上。(目標(biāo)蛋白質(zhì)取得工序)在目標(biāo)蛋白質(zhì)取得工序中，使經(jīng)蛋白質(zhì)分解酶處理的試樣溶液接觸離子交換樹(shù)脂，分離目標(biāo)蛋白質(zhì)和肽標(biāo)簽而取得含目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶液。在蛋白質(zhì)分解酶反應(yīng)后的溶液中，含被切斷的肽標(biāo)簽、目標(biāo)蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)分解酶。從融合蛋白質(zhì)切斷肽標(biāo)簽，則由于在目標(biāo)蛋白質(zhì)和肽標(biāo)簽上發(fā)生等電點(diǎn)的差異，通過(guò)使蛋白質(zhì)分解酶反應(yīng)后的溶液與離子交換樹(shù)脂接觸，基于等電點(diǎn)的差異分離目標(biāo)蛋白質(zhì)和肽標(biāo)簽。當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陰離子性時(shí)，優(yōu)選作為離子交換樹(shù)脂使用陰離子交換樹(shù)脂。如果使含由蛋白質(zhì)分解酶反應(yīng)后的聚陰離子性肽標(biāo)簽、目標(biāo)蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)分解酶的溶液通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂，則聚陰離子性肽標(biāo)簽與陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合，但目標(biāo)蛋白質(zhì)不與離子交換樹(shù)脂結(jié)合而通過(guò)?？赏ㄟ^(guò)采集此通過(guò)級(jí)分取得含目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶液。作為陰離子交換樹(shù)脂的離子交換基，不特別限定，可使用季銨(qa)、季氨基乙基(qae)、二乙基氨基乙基(deae)等，具體而言可舉出hitraphpq(gehealthcare公司)、toyopearlgigacapq-650m、toyopearlq-600car、toyopearlqae-550、toyopearldeae-650m、toyopearlsuperq-650m(以上、tosoh公司)、q101、de101(以上、三菱化學(xué)公司)等。作為離子交換基的載體，可使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、親水性乙烯基聚合物等。含聚陰離子性肽標(biāo)簽、目標(biāo)蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)分解酶的溶液的鹽濃度，為了與聚陰離子性肽標(biāo)簽的分離變得更良好，優(yōu)選500mm以下，更優(yōu)選250mm以下。另外，溶液的ph優(yōu)選5以上、9以下，更優(yōu)選6以上、8以下。作為在溶液的鹽濃度及ph的調(diào)整中使用的緩沖液，可使用磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、tris緩沖液、mops緩沖液、hepes緩沖液等。在這些的緩沖液中，含為了得到緩沖作用而使用的與弱酸或弱堿的鹽，但除此之外，可使用氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等的鹽。在本說(shuō)明書(shū)中，緩沖液或試樣溶液等的鹽濃度是指以這樣的緩沖作用作為目的的鹽以外的鹽的濃度。當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陽(yáng)離子性時(shí)，優(yōu)選使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。與聚陰離子性肽標(biāo)簽同樣地，如果使含由蛋白質(zhì)分解酶反應(yīng)后的聚陽(yáng)離子性肽標(biāo)簽、目標(biāo)蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)分解酶的溶液通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，則聚陽(yáng)離子性肽標(biāo)簽與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合，但由于目標(biāo)蛋白質(zhì)不與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合而通過(guò)，可通過(guò)采集此通過(guò)級(jí)分取得含目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶液。作為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的離子交換基，不特別限定，可使用磺基丙基(sp)、羧基甲基(cm)等，具體而言可舉出spsepharose,cmsepharose(以上gehealthcare公司)、sp-5pw,sp-npr,cm-5pw,cm-stat(以上、tosoh公司)等。作為離子交換基的載體，可使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、親水性乙烯基聚合物等。含聚陽(yáng)離子性肽標(biāo)簽、目標(biāo)蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)分解酶的溶液的鹽濃度，為了與聚陽(yáng)離子性肽標(biāo)簽的分離變得更良好，優(yōu)選500mm以下，更優(yōu)選250mm以下。另外，溶液的ph優(yōu)選5以上、9以下，更優(yōu)選6以上、8以下。蛋白質(zhì)分解酶的等電點(diǎn)優(yōu)選與目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同。由此，用蛋白質(zhì)分解酶切斷肽標(biāo)簽之后，可容易地分離目標(biāo)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)分解酶。蛋白質(zhì)分解酶也可融合肽標(biāo)簽。由此，可將蛋白質(zhì)分解酶的等電點(diǎn)調(diào)整到期望的值。作為與蛋白質(zhì)分解酶融合的肽標(biāo)簽，可使用和與上述的融合蛋白質(zhì)結(jié)合的肽標(biāo)簽相同的肽標(biāo)簽。結(jié)合于蛋白質(zhì)分解酶的肽標(biāo)簽的氨基酸序列和與融合蛋白質(zhì)結(jié)合的肽標(biāo)簽的氨基酸序列可相同，也可不同。為了可將被切斷的肽標(biāo)簽和蛋白質(zhì)分解酶由離子交換樹(shù)脂同時(shí)分離，當(dāng)結(jié)合于融合蛋白質(zhì)的肽標(biāo)簽是聚陰離子性時(shí)，優(yōu)選將蛋白質(zhì)分解酶的肽標(biāo)簽也作為聚陰離子性，當(dāng)結(jié)合于融合蛋白質(zhì)的肽標(biāo)簽是聚陽(yáng)離子性時(shí)，優(yōu)選使聚陽(yáng)離子性肽標(biāo)簽也結(jié)合于蛋白質(zhì)分解酶。更適宜地是與融合蛋白質(zhì)中所含的肽標(biāo)簽相同的氨基酸序列。由此，蛋白質(zhì)分解酶達(dá)到與目標(biāo)蛋白質(zhì)不同的等電點(diǎn)，并且達(dá)到與目標(biāo)蛋白質(zhì)不同的等電點(diǎn)。融合肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶，為了回避由自身分解，優(yōu)選無(wú)此蛋白質(zhì)分解酶識(shí)別的切斷位點(diǎn)。如果使用融合肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶，則在蛋白質(zhì)分解酶反應(yīng)后的溶液中，含被切斷的肽標(biāo)簽、目標(biāo)蛋白質(zhì)及融合了肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶。如果使此溶液通過(guò)離子交換樹(shù)脂，則融合肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶與被切斷的肽標(biāo)簽一同與離子交換樹(shù)脂結(jié)合。一方面，目標(biāo)蛋白質(zhì)不與離子交換樹(shù)脂結(jié)合而通過(guò)。因此，不另行經(jīng)分離蛋白質(zhì)分解酶的工序，可在通過(guò)級(jí)分中取得高純度的目標(biāo)蛋白質(zhì)。在本實(shí)施方式中，在肽標(biāo)簽切斷工序之前，也可包括使融合蛋白質(zhì)表達(dá)的工序及除去混雜蛋白質(zhì)的工序。(表達(dá)工序)融合蛋白質(zhì)可通過(guò)根據(jù)公知的表達(dá)重組蛋白質(zhì)的方法，向載體導(dǎo)入含編碼肽標(biāo)簽的堿基序列和編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的堿基序列的多核苷酸之后，向宿主細(xì)胞導(dǎo)入載體，使融合蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞表達(dá)而取得。編碼肽標(biāo)簽的多核苷酸及編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸可由化學(xué)合成等公知的方法取得，可將其作為模板根據(jù)公知的基因擴(kuò)增方法擴(kuò)增。通過(guò)將擴(kuò)增的多核苷酸和表達(dá)載體由限制性內(nèi)切酶處理，使用適當(dāng)?shù)膁na連接酶使其結(jié)合，可構(gòu)建含各自編碼肽標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)重組的載體。對(duì)于表達(dá)載體的構(gòu)建，編碼肽標(biāo)簽的多核苷酸也可配置于編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸的5’側(cè)或3’側(cè)的任一側(cè)。在編碼肽標(biāo)簽的堿基序列和編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的堿基序列之間，插入有編碼蛋白質(zhì)分解酶識(shí)別的切斷位點(diǎn)的堿基序列。作為宿主，不特別限定，可使用大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、蟲(chóng)體、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等。作為表達(dá)載體，無(wú)特別限制，可舉出質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體等，可根據(jù)使用的宿主適宜選擇。在表達(dá)載體中，也可含復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列等的調(diào)節(jié)序列、選擇標(biāo)志物等的序列。向宿主導(dǎo)入表達(dá)載體可根據(jù)宿主根據(jù)公知的方法進(jìn)行，例如，可舉出磷酸鈣法、電穿孔法、脂轉(zhuǎn)染法等。這樣，可得到向宿主細(xì)胞導(dǎo)入表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。使得到的轉(zhuǎn)化體在適宜的條件下溫育，可使融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生。使融合蛋白質(zhì)表達(dá)之后，對(duì)于宿主的細(xì)胞、組織、蟲(chóng)體等，根據(jù)需要，進(jìn)行提取、破碎、離心分離、增溶、體液采集等的處理，作為細(xì)胞培養(yǎng)液、提取液、勻漿物、溶解液、體液等取得試樣溶液。在試樣溶液的調(diào)制中，可使用磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、tris緩沖液、mops緩沖液、hepes緩沖液等的緩沖液。在這些緩沖液中，含為了得到緩沖作用而使用的與弱酸或弱堿的鹽，但除此之外，可使用氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等的鹽。在本說(shuō)明書(shū)中，緩沖液的鹽濃度是指以這樣的緩沖作用作為目的的鹽以外的鹽的濃度。緩沖液的鹽濃度，從融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及在分離工序中的調(diào)整的容易性等的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選50mm以上500mm以下，更優(yōu)選50mm以上250mm以下。另外緩沖液的ph，從融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及在分離工序中的調(diào)整的容易性等的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選5以上9以下，更優(yōu)選6以上8以下。使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)取得試樣時(shí)，作為表達(dá)載體，可使用質(zhì)粒載體。作為質(zhì)粒載體，具體而言，可舉出pet、pgex、pcold、pmal、pcal等。在表達(dá)載體中，也可含復(fù)制起點(diǎn)、lac、t7、tac等的啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、氨芐西林抗性基因、卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因等的選擇標(biāo)志物的序列。向大腸桿菌導(dǎo)入表達(dá)載體可由磷酸鈣法、電穿孔法、脂轉(zhuǎn)染法等進(jìn)行。表達(dá)載體導(dǎo)入后，通過(guò)用含選擇標(biāo)志物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，可選擇向大腸桿菌導(dǎo)入表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。使這樣得到的轉(zhuǎn)化體在適宜的條件下增殖之后，根據(jù)選擇的啟動(dòng)子表達(dá)誘導(dǎo)，使融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生。使融合蛋白質(zhì)表達(dá)之后，可對(duì)大腸桿菌進(jìn)行破碎等而取得含融合蛋白質(zhì)及大腸桿菌來(lái)源的混雜蛋白質(zhì)的試樣溶液。作為表達(dá)系統(tǒng)使用蠶等的蟲(chóng)體或昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)，可使用轉(zhuǎn)移載體。將轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒dna一同轉(zhuǎn)導(dǎo)到昆蟲(chóng)細(xì)胞中之后，可由同源重組向桿狀病毒dna插入目的基因。作為轉(zhuǎn)移載體，具體而言，可舉出pm01、pm02、phs01、phs02等。轉(zhuǎn)移載體優(yōu)選含多角體蛋白啟動(dòng)子、p10啟動(dòng)子等的啟動(dòng)子。作為昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如可舉出sf9、sf21、high5、tn-368、bm5等。作為桿狀病毒，例如，可舉出核多角體病病毒(npv)，具體而言，可例示acmnpv、bmnpv等。通過(guò)向昆蟲(chóng)細(xì)胞導(dǎo)入轉(zhuǎn)移載體和線性化的桿狀病毒dna，發(fā)生同源重組，得到了插入目的基因的重組桿狀病毒。通過(guò)向蟲(chóng)體或昆蟲(chóng)細(xì)胞接種等含重組桿狀病毒的病毒溶液，可使重組桿狀病毒感染。蠶等的蟲(chóng)體可為成蟲(chóng)、蛹及幼蟲(chóng)的任何的形態(tài)。通過(guò)使重組桿狀病毒感染于蟲(chóng)體或昆蟲(chóng)細(xì)胞，飼育或培養(yǎng)1～7天，可使融合蛋白質(zhì)表達(dá)。使融合蛋白質(zhì)表達(dá)之后，可對(duì)蟲(chóng)體或昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行破碎等而取得含融合蛋白質(zhì)和蟲(chóng)體或昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)源的混雜蛋白質(zhì)的試樣溶液。蛋白質(zhì)分解酶也可同樣地由公知的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。在上述融合蛋白質(zhì)的表達(dá)中，通過(guò)以蛋白質(zhì)分解酶作為目標(biāo)蛋白質(zhì)，可得到融合肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶。融合蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)分解酶可向宿主導(dǎo)入插入含編碼兩方的氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸的載體而使表達(dá)。另外，也可向宿主導(dǎo)入了導(dǎo)入編碼融合蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體和插入編碼蛋白質(zhì)分解酶的多核苷酸的載體而使表達(dá)。另外，也可向宿主導(dǎo)入插入編碼融合蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體，向宿主導(dǎo)入插入編碼蛋白質(zhì)分解酶的多核苷酸的載體，各自單獨(dú)表達(dá)之后，混合。此時(shí)，宿主可為同種，也可為異種，從表達(dá)后的處理容易性等來(lái)看，優(yōu)選同種。作為融合蛋白質(zhì)，例如，可舉出將作為目標(biāo)蛋白質(zhì)的nad(p)h脫氫酶,醌1人(nq01，pi＝8.91，seqidno：9)或螢光素酶(pi＝6.71，seqidno：10)和上述肽標(biāo)簽1～8融合，其間插入蛋白質(zhì)分解酶hrv3c識(shí)別的切斷位點(diǎn)的下述構(gòu)建體1～12。另外，作為融合了肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶，可舉出將作為蛋白質(zhì)分解酶的hrv3c(pi＝8.46，seqidno：11)和上述肽標(biāo)簽7融合的下述構(gòu)建體13。構(gòu)建體1de12-hrv3csite-nq01(seqidno：12)構(gòu)建體2de18-hrv3csite-nq01(seqidno：13)構(gòu)建體3de24-hrv3csite-nq01(seqidno：14)構(gòu)建體4de30-hrv3csite-nq01(seqidno：15)構(gòu)建體5de36-hrv3csite-nq01(seqidno：16)構(gòu)建體6ded-hrv3csite-nq01(seqidno：17)構(gòu)建體7des-hrv3csite-nq01(seqidno：18)構(gòu)建體8eo24-hrv3csite-nq01(seqidno：19)構(gòu)建體9nq01-hrv3csite-ded(seqidno：20)構(gòu)建體10nq01-hrv3csite-des(seqidno：21)構(gòu)建體11ded-hrv3csite-螢光素酶(seqidno：22)構(gòu)建體12des-hrv3csite-螢光素酶(seqidno：23)構(gòu)建體13ded-hrv3c(seqidno：24)(混雜蛋白質(zhì)除去工序)在含如上所述表達(dá)的融合蛋白質(zhì)的試樣溶液中，含宿主來(lái)源的內(nèi)源性蛋白質(zhì)等的混雜蛋白質(zhì)。因此，在目標(biāo)蛋白質(zhì)取得工序前，也可包括分離融合蛋白質(zhì)和混雜蛋白質(zhì)，除去混雜蛋白質(zhì)的工序?！胺蛛x融合蛋白質(zhì)和混雜蛋白質(zhì)”包括將融合蛋白質(zhì)提?。兓杖莸脚c混雜蛋白質(zhì)不同的容器中?；祀s蛋白質(zhì)可基本上被完全地分離，也可將混雜蛋白質(zhì)的一部分分離。通過(guò)分離混雜蛋白質(zhì)的一部分或全部，可使融合蛋白質(zhì)的純度提高?；祀s蛋白質(zhì)是指宿主來(lái)源的內(nèi)源性蛋白質(zhì)等融合蛋白質(zhì)或目標(biāo)蛋白質(zhì)以外的蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)通過(guò)使肽標(biāo)簽融合于目標(biāo)蛋白質(zhì)，達(dá)到以可與混雜蛋白質(zhì)充分地分離的程度發(fā)生等電點(diǎn)的差。如上所述，融合蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陰離子性時(shí)，優(yōu)選不足6，更優(yōu)選不足5，當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陽(yáng)離子性時(shí)，優(yōu)選9以上，更優(yōu)選10以上。多數(shù)蛋白質(zhì)由于等電點(diǎn)一般是6～7，如果融合蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是這樣的范圍，則融合蛋白質(zhì)和混雜蛋白質(zhì)的分離變得更容易，可使融合蛋白質(zhì)的純度提高。作為分離手段，不特別限定，可使用公知的分離手段，但優(yōu)選為了得到了與混雜蛋白質(zhì)的良好的分離而由離子交換樹(shù)脂分離。當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陰離子性時(shí)，更優(yōu)選由陰離子交換樹(shù)脂分離。作為陰離子交換樹(shù)脂的離子交換基，不特別限定，可使用季銨(qa)、季氨基乙基(qae)、二乙基氨基乙基(deae)等，具體而言可舉出hitraphpq(gehealthcare公司)、toyopearlgigacapq-650m、toyopearlq-600car、toyopearlqae-550、toyopearldeae-650m、toyopearlsuperq-650m(以上、tosoh公司)、q101、de101(以上、三菱化學(xué)公司)等。作為離子交換基的載體，可使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、親水性乙烯基聚合物等。通過(guò)使含融合蛋白質(zhì)和混雜蛋白質(zhì)的試樣溶液通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂，使融合蛋白質(zhì)與陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合。其后，例如使溶出液的鹽濃度升高而使混雜蛋白質(zhì)溶出之后，通過(guò)用高鹽濃度的溶出液將融合蛋白質(zhì)從離子交換樹(shù)脂溶出，可純化融合蛋白質(zhì)。作為使溶出液的鹽濃度升高的方法，可舉出階段性地改變鹽濃度而使目的蛋白質(zhì)溶出的逐步法、連續(xù)地改變鹽濃度而使目的蛋白質(zhì)溶出的梯度法。作為緩沖液，可使用磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、tris緩沖液、mops緩沖液、hepes緩沖液等的緩沖液。緩沖液的鹽濃度，從與混雜蛋白質(zhì)分離及融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選設(shè)為50mm以上、2000mm以下的范圍，更優(yōu)選50mm以上、1000mm以下的范圍。特別是，如果將緩沖液的鹽濃度設(shè)為600mm以上、更優(yōu)選為750mm以上，則與混雜蛋白質(zhì)的分離變得更良好。另外，緩沖液的ph的范圍雖不特別限制，但從與混雜蛋白質(zhì)分離及融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選5以上9以下的范圍，更優(yōu)選6以上8以下的范圍。當(dāng)肽標(biāo)簽是聚陽(yáng)離子性時(shí)，優(yōu)選使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。作為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的離子交換基，不特別限定，可使用磺基丙基(sp)、羧基甲基(cm)等，具體而言可舉出spsepharose,cmsepharose(以上gehealthcare公司)、sp-5pw,sp-npr,cm-5pw,cm-stat(以上、tosoh公司)等。作為離子交換基的載體，可使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、親水性乙烯基聚合物等。與使用陰離子交換樹(shù)脂時(shí)同樣地，通過(guò)使溶出液的鹽濃度升高，可純化融合蛋白質(zhì)，但緩沖液的鹽濃度，從與混雜蛋白質(zhì)的分離及融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選設(shè)為50mm以上、2000mm以下的范圍，更優(yōu)選50mm以上、1000mm以下的范圍。另外，緩沖液的ph的范圍雖不特別限制，但從與混雜蛋白質(zhì)分離及融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選5以上9以下的范圍，更優(yōu)選6以上8以下的范圍。圖1是顯示本發(fā)明的一實(shí)施方式的模式圖，(a)顯示混雜蛋白質(zhì)除去工序、(b)顯示肽標(biāo)簽切斷工序、(c)顯示目標(biāo)蛋白質(zhì)取得工序?；诖藞D說(shuō)明本實(shí)施方式的純化方法的原理。使融合蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)，在細(xì)胞破碎液等的試樣溶液中，除了融合蛋白質(zhì)20之外，含宿主來(lái)源的內(nèi)源性蛋白質(zhì)等的混雜蛋白質(zhì)21a～21f。混雜蛋白質(zhì)21的等電點(diǎn)從低到高依a到f的順序。在此實(shí)施方式中，使聚陰離子性肽標(biāo)簽20b結(jié)合于目標(biāo)蛋白質(zhì)20a，由此，融合蛋白質(zhì)20的等電點(diǎn)降低。等電點(diǎn)降低的融合蛋白20可在陰離子交換樹(shù)脂10保持至高鹽濃度。一方面，大部分宿主來(lái)源的混雜蛋白質(zhì)無(wú)法在陰離子交換樹(shù)脂10保持至同程度的鹽濃度?；谶@樣的等電點(diǎn)的差異分離融合蛋白質(zhì)和混雜蛋白質(zhì)。具體而言，如果使試樣接觸陰離子交換樹(shù)脂10，則等電點(diǎn)高的混雜蛋白質(zhì)21a不與陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合而通過(guò)。此外的混雜蛋白質(zhì)和融合蛋白質(zhì)20與陰離子樹(shù)脂20結(jié)合。如果使溶出液的鹽濃度升高，則從等電點(diǎn)高的混雜蛋白質(zhì)順序溶出(21b～d)。融合蛋白質(zhì)20進(jìn)一步由高鹽濃度的溶出液溶出。在此溶出級(jí)分中含與融合蛋白質(zhì)20等電點(diǎn)相近的混雜蛋白質(zhì)21e及21f。通過(guò)這樣調(diào)整溶出液的鹽濃度，因?yàn)榭煞蛛x多種混雜蛋白質(zhì)，可得到高純度的融合蛋白質(zhì)。另外，由于融合蛋白質(zhì)和混雜蛋白質(zhì)之間的等電點(diǎn)的差異相對(duì)大，由階段性地改變鹽濃度而使蛋白質(zhì)溶出的逐步法也得到良好的分離(圖1(a))。融合蛋白質(zhì)20在目標(biāo)蛋白質(zhì)20a和肽標(biāo)簽20b之間含蛋白質(zhì)分解酶22識(shí)別的切斷位點(diǎn)20c。在融合了肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶22中，在蛋白質(zhì)分解酶20a上結(jié)合了肽標(biāo)簽22b。如果在溶液中使融合蛋白質(zhì)20和蛋白質(zhì)分解酶22反應(yīng)，則從融合蛋白質(zhì)20切斷肽標(biāo)簽20b(圖1(b))。在反應(yīng)后的溶液中，含目標(biāo)蛋白質(zhì)20a、被切斷的肽標(biāo)簽20b、融合了肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶22及在混雜蛋白質(zhì)除去工序中殘留的混雜蛋白質(zhì)21e、21f。由于等電點(diǎn)低的肽標(biāo)簽20b被切斷，目標(biāo)蛋白質(zhì)20a與融合蛋白質(zhì)20相比等電點(diǎn)變高。另外，混雜蛋白質(zhì)21e及21f由于與融合蛋白質(zhì)20等電點(diǎn)比較接近，目標(biāo)蛋白質(zhì)20a的等電點(diǎn)變得比這些高。再者，目標(biāo)蛋白質(zhì)20a的等電點(diǎn)也變得比將被切斷的肽標(biāo)簽20b及肽標(biāo)簽22b融合的蛋白質(zhì)分解酶22高。因此，如果稀釋此溶液而使鹽濃度降低，使通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂10，則被切斷的肽標(biāo)簽20b、融合肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶22及混雜蛋白質(zhì)21e、21f與陰離子交換樹(shù)脂10結(jié)合，但目標(biāo)蛋白質(zhì)20a不結(jié)合而通過(guò)。通過(guò)采集此通過(guò)級(jí)分，可取得高純度的目標(biāo)蛋白質(zhì)20a(圖1(c))?！緦?shí)施例】以下，對(duì)于本發(fā)明還舉實(shí)施例詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明不以任何方式限于這些實(shí)施例?！緦?shí)施例1[融合蛋白質(zhì)de12-hrv3csite-nq01(構(gòu)建體1；pi＝5.84)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽1(de12)融合于作為目標(biāo)蛋白的nad(p)h脫氫酶,醌1人(nq01，pi＝8.91)的n末端側(cè)，nq01和de12之間含蛋白質(zhì)分解酶hrv3c識(shí)別的切斷位點(diǎn)hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。(1)pm01_de12載體的構(gòu)建構(gòu)建向pm01載體插入肽標(biāo)簽de12的載體pm01_de12。使編碼de12的多核苷酸(seqidno：25及26)退火成對(duì)，調(diào)制插入子部分。將pm01載體(sysmex公司)的nhei位點(diǎn)用nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化stellar感受態(tài)細(xì)胞之后，播種到lba板上，于37℃下培養(yǎng)16hr。從此轉(zhuǎn)化體根據(jù)常規(guī)方法挑選氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行質(zhì)粒的純化。為了確認(rèn)挑選的克隆的堿基序列，使用測(cè)序確認(rèn)用引物1(seqidno：27)及引物2(seqidno：28)，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進(jìn)行pcr反應(yīng)之后，用dna測(cè)序儀(thermoscientific公司)解析。將導(dǎo)入有插入子部分、此外的部分無(wú)變異的載體作為pm01_de12。(2)pm01_de12_hrv3csite_nq01的構(gòu)建構(gòu)建向pm01_de12插入編碼nq01(seqidno：9)的多核苷酸(seqidno：29)的表達(dá)載體pm01_de12_hrv3csite_nq01。插入子部分準(zhǔn)備編碼nq01的多核苷酸和對(duì)應(yīng)于插入子部分的引物3f(seqidno：30)及3r(seqidno：31)，作為pcr酶，使用kod-plus-(東洋紡公司)，用下述pcr條件擴(kuò)增。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進(jìn)行電泳，將與插入子部分的長(zhǎng)度一致的部分從凝膠切出而純化而調(diào)制插入子部分。將pm01_de12載體的smai位點(diǎn)用smai(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化stellar感受態(tài)細(xì)胞(clonetech公司)之后，播種到lba板上。于37℃下培養(yǎng)16hr，從此轉(zhuǎn)化體根據(jù)常規(guī)方法挑選氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行質(zhì)粒的純化。為了確認(rèn)挑選的克隆的堿基序列，使用測(cè)序確認(rèn)用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進(jìn)行pcr反應(yīng)之后，用dna測(cè)序儀(thermoscientific公司)解析。將導(dǎo)入有插入子部分、此外的部分無(wú)變異的載體作為pm01_de12_hrv3csite_nq01。<pcr條件>反應(yīng)1：94.0℃、2分鐘；反應(yīng)2：94.0℃、15秒鐘；反應(yīng)3：52.0℃、30秒鐘；反應(yīng)4：68.0℃、每1kbp1分鐘；反應(yīng)5：將反應(yīng)2～反應(yīng)4重復(fù)30次(3)重組桿狀病毒的制作及融合蛋白質(zhì)de12-hrv3csite-nq01的表達(dá)向蠶培養(yǎng)細(xì)胞(bmn細(xì)胞)導(dǎo)入pm01_de12_hrv3csite_nq01和桿狀病毒dna，進(jìn)行病毒的同源重組。將此培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)6天，回收重組病毒后，向蠶的蛹接種用milliq水稀釋50倍的病毒溶液，溫育6天。(4)de12-hrv3csite-nq01的純化溫育后，回收蠶的蛹，每1只加50ml的緩沖液(20mmtris-hcl(ph8.0),150mmnacl,1片完全無(wú)edta(1tabletcompleteedtafree)(roche),phenyltiourea)而勻漿，對(duì)溶液進(jìn)行離心(8,000g、10分鐘)后，將上清級(jí)分用0.8μm的濾劑過(guò)濾，回收濾液。將回收的濾液加載到離子交換樹(shù)脂(hitrapqhp(1ml))，使用混合20mmtris-hcl(ph8.0,150mmnacl，緩沖液a)和20mmtris-hcl(ph8.0,1000mmnacl，緩沖液b)的溶液純化。各回收首先僅使緩沖液a(nacl濃度150mm)流過(guò)離子交換樹(shù)脂(el0)、用緩沖液a：緩沖液b的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)溶出(el1)、用緩沖液a：緩沖液b的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)溶出(el2)、用緩沖液a：緩沖液b的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)溶出(el3)，最后僅用緩沖液b(nacl濃度1000mm)溶出(el4)的級(jí)分。(5)de12-hrv3csite-nq01的檢測(cè)sds(十二烷基硫酸鈉)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)使用5-20％梯度凝膠及電泳裝置(aproscience公司)實(shí)施。將樣品和trissdsβ-me樣品處理液(cosmo-bio公司)以1:1容量比混合，100℃下、處理3分鐘之后，將5μl加載到凝膠。作為分子量標(biāo)志物，將bluestar(日本genetics公司)加載到2.5μl凝膠。將加載樣品的凝膠以電壓400v電泳14分鐘之后，使用轉(zhuǎn)印turbo印跡系統(tǒng)(bio-rad公司)轉(zhuǎn)印到膜上。將轉(zhuǎn)印的膜設(shè)置于i-bind系統(tǒng)(thermofisherscientific公司)，實(shí)施抗原抗體反應(yīng)。在抗原抗體反應(yīng)中，將抗-flag(注冊(cè)商標(biāo))m2-過(guò)氧化物酶(hrp)抗體(merck公司)或抗-nq01抗體(cellsignaling公司和抗-igg(h+lchain)(mouse)pab-hrp(beckman公司)稀釋2000倍而使用，檢測(cè)的hrp試劑使用luminataforte(merck公司)、檢測(cè)機(jī)使用geldocxr+系統(tǒng)(bio-rad公司)。實(shí)施蛋白印跡之后，將使用的膜用gelcodebluestainreagent(thermofisherscientific公司)染色，使額外的染色脫色之后，使用geldocxr+系統(tǒng)(bio-rad公司)對(duì)圖像進(jìn)行攝影。結(jié)果示于圖2。在圖2中，m是分子量標(biāo)志物、泳道1是勻漿物溶液、泳道2是離心后的上清級(jí)分、泳道3是離心后的沉淀級(jí)分、泳道4～泳道7是離子交換樹(shù)脂的通過(guò)級(jí)分1～4、泳道8是由緩沖液a(nacl濃度150mm)的溶出級(jí)分(el0)、泳道9是由緩沖液a：緩沖液b的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)的溶出級(jí)分(el1)、泳道10是由緩沖液a：緩沖液b的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)的溶出級(jí)分(el2)、泳道11是由緩沖液a：緩沖液b的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)的溶液級(jí)分(el3)、泳道12是由緩沖液b(nacl濃度1000mm)的溶出級(jí)分(el4)的電泳結(jié)果。用虛線包圍的部分表示含目標(biāo)蛋白質(zhì)的條帶。各泳道的說(shuō)明在圖3～15中通用?！緦?shí)施例2[融合蛋白質(zhì)de18-hrv3csite-nq01(構(gòu)建體2；pi＝5.03)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽2(de18)融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的n末端側(cè)，nq01和de18之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。除了代替編碼肽標(biāo)簽de12的多核苷酸而使用編碼de18(seqidno：2)的多核苷酸(seqidno：32及33)調(diào)制插入子部分之外，與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建pm01_de18載體。再與實(shí)施例1同樣地，構(gòu)建pm01_de18_hrv3csite_nq01，制作重組桿狀病毒之后，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)de18-hrv3csite-nq01的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖3?！緦?shí)施例3[融合蛋白質(zhì)de24-hrv3csite-nq01(構(gòu)建體3；pi＝4.78)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽3(de24)融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的n末端側(cè)，nq01和de24之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。(1)pm01_de24載體的構(gòu)建向pm01載體插入編碼肽標(biāo)簽de24的多核苷酸的載體pm01_de24如以下一樣構(gòu)建。準(zhǔn)備編碼肽標(biāo)簽6(ded，seqidno：6)的多核苷酸(seqidno：34)和對(duì)應(yīng)于插入子部分的引物4f(seqidno：35)及4r(seqidno：36)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實(shí)施例1相同的pcr條件擴(kuò)增。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進(jìn)行電泳，將與插入子部分的長(zhǎng)度一致的部分從凝膠切出，純化而調(diào)制插入子部分。將pm01載體(sysmex公司)的smai位點(diǎn)用smai(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化stellar感受態(tài)細(xì)胞(clonetech公司)之后，播種到lba板上。于37℃下培養(yǎng)16hr，從此轉(zhuǎn)化體根據(jù)常規(guī)方法挑選氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行質(zhì)粒的純化。為了確認(rèn)挑選的克隆的堿基序列，使用測(cè)序確認(rèn)用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進(jìn)行pcr反應(yīng)之后，用dna測(cè)序儀(thermoscientific公司)解析。將導(dǎo)入有插入子部分、此外的部分無(wú)變異的載體作為pm01_de24。(2)與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建，pm01_de24_hrv3csite_nq01，制作重組桿狀病毒之后，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)de24-hrv3csite-nq01的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖4?！緦?shí)施例4[融合蛋白質(zhì)de30-hrv3csite-nq01(構(gòu)建體4；pi＝4.61)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽4(de30)融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的n末端側(cè)，nq01和de30之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。除了代替編碼肽標(biāo)簽de12的多核苷酸而使用編碼de30(seqidno：4)的多核苷酸(seqidno：37及38)調(diào)制插入子部分之外，與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建pm01_de30載體。再與實(shí)施例1同樣地，構(gòu)建pm01_de30_hrv3csite_nq01，制作重組桿狀病毒之后，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)de30-hrv3csite-nq01的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖5?！緦?shí)施例5[融合蛋白質(zhì)de36-hrv3csite-nq01(構(gòu)建體5；pi＝4.49)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽5(de36)融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的n末端側(cè)，nq01和de36之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。除了代替編碼肽標(biāo)簽de12的多核苷酸而使用編碼de36(seqidno：5)的多核苷酸(seqidno：39及40)調(diào)制插入子部分之外，與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建pm01_de36載體。再與實(shí)施例1同樣地，構(gòu)建pm01_de36_hrv3csite_nq01，制作重組桿狀病毒之后，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)de36-hrv3csite-nq01的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖6?！緦?shí)施例6[融合蛋白質(zhì)ded-hrv3csite-nq01(構(gòu)建體6；pi＝4.26)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽6(ded)融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的n末端側(cè)，nq01和ded之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。(1)phs01_ded載體的構(gòu)建向phs01載體插入肽標(biāo)簽ded(seqidno：6)的載體phs01_ded如以下一樣構(gòu)建。準(zhǔn)備編碼肽標(biāo)簽ded的多核苷酸(seqidno：34)和對(duì)應(yīng)于插入子部分的引物5f(seqidno：41)及5r(seqidno：42)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實(shí)施例1相同的pcr條件擴(kuò)增。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進(jìn)行電泳，將與插入子部分的長(zhǎng)度一致的部分從凝膠切出，純化而調(diào)制插入子部分。將phs01載體(sysmex公司)的nhei位點(diǎn)用nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化stellar感受態(tài)細(xì)胞之后，播種到lba板上。于37℃下培養(yǎng)16hr，從此轉(zhuǎn)化體根據(jù)常規(guī)方法挑選氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行質(zhì)粒的純化。為了確認(rèn)挑選的克隆的堿基序列，使用測(cè)序確認(rèn)用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進(jìn)行pcr反應(yīng)之后，用dna測(cè)序儀(thermoscientific公司)解析。將導(dǎo)入有插入子部分、此外的部分無(wú)變異的載體作為phs01_ded。(2)與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建hs01_ded_hrv3csite_nq01，制作重組桿狀病毒之后，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)ded-hrv3csite-nq01的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖7。【實(shí)施例7[融合蛋白質(zhì)des-hrv3csite-nq01(構(gòu)建體7；pi＝4.55)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽7(des)融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的n末端側(cè)，nq01和des之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。除了作為對(duì)應(yīng)于插入子部分的引物，使用引物6f(seqidno：43)及6r(seqidno：44)之外，與實(shí)施例6同樣地，構(gòu)建phs01_des。與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建phs01_des_hrv3csite_nq01，制作重組桿狀病毒之后，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)des-hrv3csite-nq01的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖8。【實(shí)施例8[融合蛋白質(zhì)eo24-hrv3csite-nq01(構(gòu)建體8；pi＝4.73)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽8(eo24)融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的n末端側(cè)，nq01和eo24之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。(1)phs01_eo24的構(gòu)建使編碼肽標(biāo)簽eo24的多核苷酸(seqidno：45及46)退火成對(duì)，調(diào)制插入子部分。將phs01載體(sysmex公司)的nhei位點(diǎn)用nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化stellar感受態(tài)細(xì)胞(clonetech公司)之后，播種到lba板上。于37℃下培養(yǎng)16hr，從此轉(zhuǎn)化體根據(jù)常規(guī)方法挑選氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行質(zhì)粒的純化。為了確認(rèn)挑選的克隆的堿基序列，使用測(cè)序確認(rèn)用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進(jìn)行pcr反應(yīng)之后，用dna測(cè)序儀(thermoscientific公司)解析。將導(dǎo)入有插入子部分、此外的部分無(wú)變異的載體作為phs01_eo24。(2)與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建phs01_eo24_hrv3csite_nq01，制作重組桿狀病毒之后，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)eo24-hrv3csite-nq01的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖9?！緦?shí)施例9[融合蛋白質(zhì)nq01-hrv3csite-ded(構(gòu)建體9；pi＝4.26)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽ded融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的c末端側(cè)，nq01和ded之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。(1)phs02_ded載體的構(gòu)建向phs02載體插入編碼肽標(biāo)簽ded的多肽的載體phs02_de12如以下一樣構(gòu)建。準(zhǔn)備編碼肽標(biāo)簽ded的多核苷酸(seqidno：34)和對(duì)應(yīng)于插入子部分的引物7f(seqidno：47)及7r(seqidno：48)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實(shí)施例1相同的pcr條件擴(kuò)增。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進(jìn)行電泳，將與插入子部分的長(zhǎng)度一致的部分從凝膠切出，純化而調(diào)制插入子部分。將phs02載體(sysmex公司)的nhei位點(diǎn)用nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化stellar感受態(tài)細(xì)胞(clonetech公司)之后，播種到lba板上。于37℃下培養(yǎng)16hr，從此轉(zhuǎn)化體根據(jù)常規(guī)方法挑選氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行質(zhì)粒的純化。為了確認(rèn)挑選的克隆的堿基序列，使用測(cè)序確認(rèn)用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進(jìn)行pcr反應(yīng)之后，用dna測(cè)序儀(thermoscientific公司)解析。將導(dǎo)入有插入子部分、此外的部分無(wú)變異的載體作為phs02_ded。(2)除了作為對(duì)應(yīng)于插入子部分的引物，使用引物8f(seqidno：49)及8r(seqidno：50)之外，與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建phs02_nq01_hrv3csite_ded。(3)還與實(shí)施例1同樣地制作重組桿狀病毒，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)nq01-hrv3csite-ded的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖10?！緦?shí)施例10[融合蛋白質(zhì)nq01-hrv3csite-des(構(gòu)建體10；pi＝4.55)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽des融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的c末端側(cè)，nq01和des之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。(1)除了作為引物，使用9f(seqidno：51)及9r(seqidno：52)之外，與實(shí)施例9同樣地，構(gòu)建phs02_des。(2)與實(shí)施例9同樣地構(gòu)建phs01_nq01_hrv3csite_des。(3)與實(shí)施例1同樣地制作重組桿狀病毒，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)nq01-hrv3csite-des的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖11。【實(shí)施例11[融合蛋白質(zhì)ded-hrv3csite-螢光素酶(構(gòu)建體11；pi＝4.47)的表達(dá)及純化]】(1)phs01_ded載體的構(gòu)建與實(shí)施例6同樣地構(gòu)建phs01_ded。(2)phs01_ded_hrv3csite_螢光素酶的構(gòu)建準(zhǔn)備編碼螢光素酶的多核苷酸(seqidno：53)和對(duì)應(yīng)于插入子部分的引物10f(seqidno：54)及10r(seqidno：55)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實(shí)施例1相同的pcr條件擴(kuò)增。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進(jìn)行電泳，將與插入子部分的長(zhǎng)度一致的部分從凝膠切出，純化而調(diào)制插入子部分。將phs01_ded載體的smai位點(diǎn)用smai(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化stellar感受態(tài)細(xì)胞(clonetech公司)之后，播種到lba板上。于37℃下培養(yǎng)16hr，從此轉(zhuǎn)化體根據(jù)常規(guī)方法挑選氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行質(zhì)粒的純化。為了確認(rèn)挑選的克隆的堿基序列，使用測(cè)序確認(rèn)用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進(jìn)行pcr反應(yīng)之后，用dna測(cè)序儀(thermoscientific公司)解析。將導(dǎo)入有插入子部分、此外的部分無(wú)變異的載體作為phs01_ded_hrv3csite_螢光素酶。(3)與實(shí)施例1同樣地制作重組桿狀病毒，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)ded-hrv3csite-螢光素酶的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖12?！緦?shí)施例12[融合蛋白質(zhì)des-hrv3csite-螢光素酶(構(gòu)建體12；pi＝4.75)的表達(dá)及純化]】除了代替phs01_ded載體而使用在實(shí)施例7中構(gòu)建的phs01_des載體之外，與實(shí)施例11同樣地構(gòu)建phs02_des_hrv3csite_螢光素酶。與實(shí)施例1同樣地，制作重組桿狀病毒，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)des-hrv3csite-螢光素酶的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖13?！緦?shí)施例13[融合蛋白質(zhì)ded-hrv3c(構(gòu)建體13；pi＝4.75)的表達(dá)及純化]】(1)pet17b_ded_hrv3c的構(gòu)建準(zhǔn)備編碼肽標(biāo)簽ded的多核苷酸(seqidno：34)及編碼hrv3c的多核苷酸(seqidno：56)和對(duì)應(yīng)于插入子部分的引物11f及11r(seqidno：57及58，ded)以及引物12f及12r(seqidno：59及60，hrv3c)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實(shí)施例1相同的pcr條件擴(kuò)增。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進(jìn)行電泳，將與插入子部分的長(zhǎng)度一致的部分從凝膠切出，純化而調(diào)制插入子部分。將phs01載體(sysmex公司)的smai位點(diǎn)和nhei位點(diǎn)用smai(寶生物公司)和nhei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入2個(gè)插入子部分。構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化stellar感受態(tài)細(xì)胞(clonetech公司)之后，播種到lba板上。于37℃下培養(yǎng)16hr，從此轉(zhuǎn)化體根據(jù)常規(guī)方法挑選氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行質(zhì)粒的純化。為了確認(rèn)挑選的克隆的堿基序列，使用測(cè)序確認(rèn)用的引物1及2，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進(jìn)行pcr反應(yīng)之后，用dna測(cè)序儀(thermoscientific公司)解析。將導(dǎo)入有插入子部分、此外的部分無(wú)變異的載體作為phs01_ded_hrv3c。接下來(lái)，調(diào)制pet17b用的插入子。將phs01_ded_hrv3c作為模板，準(zhǔn)備引物13f(seqidno：61)及13r(seqidno：62)，作為pcr酶使用kod-plus-(東洋紡公司)，用與實(shí)施例1相同的pcr條件擴(kuò)增。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物用1.0％(w/v)瓊脂糖電泳進(jìn)行電泳，將與插入子部分的長(zhǎng)度一致的部分從凝膠切出，純化而調(diào)制插入子部分。將pet17b載體(novagene公司)的ndei位點(diǎn)用ndei(寶生物公司)處理，使用in-fusionhd克隆試劑盒(clonetech公司)插入插入子部分。用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化stellar感受態(tài)細(xì)胞(clonetech公司)之后，播種到lba板上。于37℃下培養(yǎng)16hr，從此轉(zhuǎn)化體根據(jù)常規(guī)方法挑選氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行質(zhì)粒的純化。為了確認(rèn)挑選的克隆的堿基序列，使用測(cè)序確認(rèn)用的引物14(seqidno：63)及15(seqidno：64)，用bigdyeterminatorv3.1(thermoscientific公司)進(jìn)行pcr反應(yīng)之后，用dna測(cè)序儀(thermoscientific公司)解析。將導(dǎo)入有插入子部分、此外的部分無(wú)變異的載體作為pet17b_ded_hrv3c。(2)ded-hrv3c的表達(dá)及純化使用pet17b_ded_hrv3c轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將含氨芐西林的1.5l的lb培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，在濁度od＝0.6附近冷卻到15℃后，添加iptg而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。16小時(shí)后，用離心(8,000g15分鐘)集菌，于-80℃下冷凍。向冷凍的大腸桿菌添加120ml緩沖液(20mmtris-hcl(ph8.0),150mmnacl,1片完全無(wú)edta(1tabletcompleteedtafree)(roche)，用超聲波破碎。破碎的對(duì)溶液進(jìn)行離心(15,000g×30分鐘)后，將上清級(jí)分用0.8μm的濾劑過(guò)濾，回收濾液。使用將濾液加載到離子交換樹(shù)脂(hitrapqhp(1ml))，混合20mmtris-hcl(ph8.0,150mmnacl，緩沖液a)和20mmtris-hcl(ph8.0,1000mmnacl，緩沖液b)的溶液純化。各回收首先僅使緩沖液a(nacl濃度150mm)流過(guò)離子交換樹(shù)脂(el0)、用緩沖液a：緩沖液b的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)溶出(el1)、用緩沖液a：緩沖液b的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)溶出(el2)、用緩沖液a：緩沖液b的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)溶出(el3)，最后僅用緩沖液b(nacl濃度1000mm)溶出(el4)的級(jí)分。(3)與實(shí)施例1同樣地檢測(cè)融合蛋白質(zhì)。結(jié)果示于圖14。在圖14中，m是分子量標(biāo)志物、泳道1是勻漿物溶液、泳道2是離心后的上清級(jí)分、泳道3是離心后的沉淀級(jí)分、泳道4～泳道7是離子交換樹(shù)脂的通過(guò)級(jí)分1～4，泳道8是由緩沖液a(nacl濃度150mm)的溶出級(jí)分(el0)、泳道9是由緩沖液a：緩沖液b的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)的溶出級(jí)分(el1)、泳道10是由緩沖液a：緩沖液b的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)的溶出級(jí)分(el2)、泳道11是由緩沖液a：緩沖液b的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)的溶液級(jí)分(el3)、泳道12是由緩沖液b(nacl濃度1000mm)的溶出級(jí)分(el4)的電泳結(jié)果?！颈容^例1[融合蛋白質(zhì)de6-hrv3csite-nq01(pi＝6.4)的表達(dá)及純化]】對(duì)肽標(biāo)簽de6融合于作為目標(biāo)蛋白的nq01的n末端側(cè)，nq01和de6之間含hrv3csite的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)及純化。除了代替編碼肽標(biāo)簽de12的多核苷酸而使用編碼de6(eeeddd，seqidno：65)的多核苷酸(seqidno：66及67)調(diào)制插入子部分之外，與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建pm01_de6載體。再與實(shí)施例1同樣地構(gòu)建pm01_de6_hrv3csite_nq01，制作重組桿狀病毒之后，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)de6-hrv3csite-nq01的表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖15。(對(duì)于實(shí)施例1～13及比較例1的結(jié)果)在比較例1(de6-hrv3csite-nq01、pi＝6.4)中，所有的級(jí)分中含融合蛋白質(zhì)分離不充分。與此相比，在實(shí)施例1～13中均示良好的分離。特別是結(jié)合18個(gè)殘基以上的酸性氨基酸殘基的肽標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)保持于離子交換樹(shù)脂至500mm以上的高鹽濃度，與混雜蛋白質(zhì)的分離變得更良好(實(shí)施例2～13)。另外，在3種目標(biāo)蛋白質(zhì)的任一種中均得到了良好的分離(實(shí)施例6～7、11～13)。另外，肽標(biāo)簽，作為酸性氨基酸殘基，無(wú)論含天冬氨酸殘基及谷氨酸殘基兩方，還是僅含任一方均顯示同等良好的分離(實(shí)施例3、8)。肽標(biāo)簽的結(jié)合位置無(wú)論是目標(biāo)蛋白質(zhì)的n末端側(cè)或c末端側(cè)的任一側(cè)，分離均良好(實(shí)施例6～7、9～10)?！緦?shí)施例14[從融合蛋白質(zhì)de12-hrv3csite-nq01分離目標(biāo)蛋白質(zhì)nq01及檢測(cè)]】使蛋白質(zhì)分解酶ded-hrv3c反應(yīng)于de12-hrv3csite-nq01而從de12-hrv3csite-nq01切斷de12。向在實(shí)施例1中回收的級(jí)分el2混合其10分之1容量的在實(shí)施例13中回收的級(jí)分el3，于4℃下靜置。16小時(shí)后，向此反應(yīng)溶液添加20mmtris-hcl(ph8.0)而稀釋至nacl濃度約250mm，加載到用20mmtris-hcl(ph8.0),150mmnacl平衡化的離子交換樹(shù)脂(hitrapqhp(1ml))上。對(duì)于將通過(guò)級(jí)分回收(fr.1-6(nacl濃度約250mm))、最后僅用緩沖液b(nacl濃度1000mm)溶出(fr.7-10)的級(jí)分分別進(jìn)行回收。sds-page使用5-20％梯度凝膠及電泳裝置(aproscience公司)實(shí)施。將回收的各級(jí)分與trissdsβ-me樣品處理液(cosmo-bio公司)以1:1容量混合，100℃下、處理3分鐘之后，將5μl加載到凝膠。作為分子量標(biāo)志物，將bluestar(日本genetics公司)加載到2.5μl凝膠。將加載樣品的凝膠以電壓400v電泳14分鐘之后，用gelcodebluestainreagent(thermofisherscientific公司)染色，使額外的染色脫色之后，使用geldocxr+系統(tǒng)(bio-rad公司)對(duì)圖像進(jìn)行攝影。結(jié)果示于圖16。在圖16中，m是分子量標(biāo)志物、泳道1是el2(實(shí)施例1,8)或el3(實(shí)施例2～7、11～12)、泳道2是實(shí)施例13的el3、泳道3是實(shí)施例1～12的el2或el3和實(shí)施例13的el3的混合反應(yīng)液、泳道4～泳道8是離子交換樹(shù)脂的通過(guò)級(jí)分1～5，泳道9～13是由緩沖液b的溶出級(jí)分1～5的電泳結(jié)果。各泳道的說(shuō)明在圖17～25中通用?！緦?shí)施例15】除了代替實(shí)施例1的el2而使用實(shí)施例2的el2之外，與實(shí)施例14同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)nq01。結(jié)果示于圖17?！緦?shí)施例16】除了代替實(shí)施例1的el2而使用實(shí)施例3的el3之外，與實(shí)施例14同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)nq01。結(jié)果示于圖18?！緦?shí)施例17】除了代替實(shí)施例1的el2而使用實(shí)施例4的el3之外，與實(shí)施例14同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)nq01。結(jié)果示于圖19?！緦?shí)施例18】除了代替實(shí)施例1的el2而使用實(shí)施例5的el3之外，與實(shí)施例14同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)nq01。結(jié)果示于圖20?！緦?shí)施例19】除了代替實(shí)施例1的el2而使用實(shí)施例6的el3之外，與實(shí)施例14同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)nq01。結(jié)果示于圖21?！緦?shí)施例20】除了代替實(shí)施例1的el2而使用實(shí)施例7的el3之外，與實(shí)施例14同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)nq01。結(jié)果示于圖22?！緦?shí)施例21】除了代替實(shí)施例1的el2而使用實(shí)施例8的el2之外，與實(shí)施例14同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)nq01。結(jié)果示于圖23?！緦?shí)施例22】除了代替實(shí)施例1的el2而使用實(shí)施例11的el3之外，與實(shí)施例14同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)螢光素酶。結(jié)果示于圖24?！緦?shí)施例23】除了代替實(shí)施例1的el2而使用實(shí)施例12的el3之外，與實(shí)施例14同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)螢光素酶。結(jié)果示于圖25。(對(duì)于實(shí)施例14～23的結(jié)果)從實(shí)施例14～23的結(jié)果顯示，通過(guò)使蛋白質(zhì)分解酶作用于融合蛋白質(zhì)，可在陰離子樹(shù)脂的通過(guò)級(jí)分中取得目標(biāo)蛋白質(zhì)nq01或螢光素酶?！緦?shí)施例24[緩沖液的ph對(duì)分離的影響的評(píng)價(jià)]】與實(shí)施例6同樣地，構(gòu)建phs01_ded_hrv3csite_nq01。向蠶培養(yǎng)細(xì)胞(bmn細(xì)胞)導(dǎo)入phs01_ded_hrv3csite_nq01和桿狀病毒dna，進(jìn)行病毒的同源重組。將此培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)6天，回收重組病毒后，向蠶的蛹接種用milliq水稀釋50倍的病毒溶液，溫育6天?；厥招Q的蛹，每1只加50ml的緩沖液(20mmpipes(ph6.1),150mmnacl,1片完全無(wú)edta(1tabletcompleteedtafree)(roche),phenyltiourea)而勻漿，其對(duì)溶液進(jìn)行離心(8,000g、10分鐘)后，將上清級(jí)分用0.8μm的濾劑過(guò)濾，回收濾液。將濾液加載到離子交換樹(shù)脂(hitrapqhp(1ml))，使用混合20mmpipes(ph6.1,150mmnacl，緩沖液c)和20mmpipes(ph6.1,1000mmnacl，緩沖液d)的溶液純化。各回收首先僅使緩沖液c(nacl濃度150mm)流過(guò)離子交換樹(shù)脂(el0)，用緩沖液c：緩沖液d的混合比3：1(nacl濃度363mm)的溶液溶出(el1)、用緩沖液c：緩沖液d的混合比1:1(nacl濃度575mm)的溶液溶出(el2)、用緩沖液c：緩沖液d的混合比1:3(nacl濃度788mm)的溶液溶出(el3)，最后僅用緩沖液d(nacl濃度1000mm)溶出(el4)的級(jí)分。與實(shí)施例1同樣地檢測(cè)ded-hrv3csite-nq01。結(jié)果示于圖26。在圖26中，m是分子量標(biāo)志物、泳道1是勻漿物溶液、泳道2是離心后的上清級(jí)分、泳道3是離心后的沉淀級(jí)分、泳道4～泳道7是離子交換樹(shù)脂的通過(guò)級(jí)分1～4、泳道8是由緩沖液c(nacl濃度150mm)的溶出級(jí)分(el0)、泳道9是由緩沖液c：緩沖液d的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)的溶出級(jí)分(el1)、泳道10是由緩沖液c：緩沖液d的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)的溶出級(jí)分(el2)、泳道11是由緩沖液c：緩沖液d的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)的溶液級(jí)分(el3)、泳道12是由緩沖液d(nacl濃度1000mm)的溶出級(jí)分(el4)的電泳結(jié)果。各泳道的說(shuō)明在圖27～28中通用?！緦?shí)施例25】與實(shí)施例7同樣地構(gòu)建phs01_des_hrv3csite_nq01。再與實(shí)施例24同樣地將des-hrv3csite-nq01表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖27?！緦?shí)施例26】與實(shí)施例11同樣地構(gòu)建phs01_ded_hrv3csite_螢光素酶。再與實(shí)施例24同樣地將ded-hrv3csite-螢光素酶表達(dá)、純化及檢測(cè)。結(jié)果示于圖28?！緦?shí)施例27】與實(shí)施例7同樣地構(gòu)建phs01_des_hrv3csite_nq01。使用phs01_des_hrv3csite_nq01轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將含氨芐西林的1.5l的lb培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，在濁度od＝0.6附近冷卻到15℃后，添加iptg而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。16小時(shí)后，用離心(8,000g15分鐘)集菌，于-80℃下冷凍。向冷凍的大腸桿菌添加120ml緩沖液(20mmpipes(ph6.1),150mmnacl,1片完全無(wú)edta(1tabletcompleteedtafree)(roche))，用超聲波破碎。破碎的對(duì)溶液進(jìn)行離心(15,000g×30分鐘)后，將上清級(jí)分用0.8μm的濾劑過(guò)濾，回收濾液。將濾液加載到離子交換樹(shù)脂(hitrapqhp(1ml))，使用混合20mmpipes(ph6.1,150mmnacl，緩沖液c)和20mmpipes(ph6.1,1000mmnacl，緩沖液d)的溶液純化。各回收首先僅使緩沖液c(nacl濃度150mm)流過(guò)離子交換樹(shù)脂(el0)、用緩沖液c：緩沖液d的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)溶出(el1)、用緩沖液c：緩沖液d的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)溶出(el2)、用緩沖液c：緩沖液d的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)溶出(el3)，最后僅用緩沖液d(nacl濃度1000mm)溶出(el4)的級(jí)分。與實(shí)施例1同樣地檢測(cè)ded-hrv3csite-nq01。結(jié)果示于圖29。在圖29中，m是分子量標(biāo)志物、泳道1是勻漿物溶液、泳道2是離心后的上清級(jí)分、泳道3是離心后的沉淀級(jí)分、泳道4～泳道7是離子交換樹(shù)脂的通過(guò)級(jí)分1～4，泳道8是由緩沖液c(nacl濃度150mm)的溶出級(jí)分(el0)、泳道9是由緩沖液c：緩沖液d的3:1混合溶液(nacl濃度363mm)的溶出級(jí)分(el1)、泳道10是由緩沖液c：緩沖液d的1:1混合溶液(nacl濃度575mm)的溶出級(jí)分(el2)、泳道11是由緩沖液c：緩沖液d的1:3混合溶液(nacl濃度788mm)的溶液級(jí)分(el3)、泳道12是由緩沖液d(nacl濃度1000mm，el4)的溶出級(jí)分的電泳結(jié)果。【實(shí)施例28】向?qū)嵤├?4的el3混合10分之1容量的實(shí)施例27的el3，于4℃下靜置。16小時(shí)后，向反應(yīng)溶液添加20mmpipes(ph6.1)而稀釋至nacl濃度約250mm，加載到用20mmpipes(ph6.1,150mmnacl)平衡化的離子交換樹(shù)脂(hitrapqhp(1ml))上。對(duì)于將通過(guò)級(jí)分回收(fr.1-6(nacl濃度約250mm))、最后僅用緩沖液d(nacl濃度1000mm)溶出(fr.7-10)的級(jí)分分別進(jìn)行回收。與實(shí)施例1同樣地檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)eq01。結(jié)果示于圖30。在圖30中，m是分子量標(biāo)志物、泳道1是實(shí)施例24的el3、泳道2是實(shí)施例27的el3、泳道3是實(shí)施例24的el3和實(shí)施例27的el3混合反應(yīng)液、泳道4～泳道8是離子交換樹(shù)脂的通過(guò)級(jí)分1～5，泳道9～13是由緩沖液d的溶出級(jí)分1～5的電泳結(jié)果。(對(duì)于實(shí)施例24～28的結(jié)果)從實(shí)施例24～28的結(jié)果顯示，在融合蛋白質(zhì)的表達(dá)－純化及目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化中，即使使緩沖液的ph變低，也得到了良好的分離。【符號(hào)的說(shuō)明】10：離子交換樹(shù)脂20：融合蛋白質(zhì)20a：目標(biāo)蛋白質(zhì)20b：肽標(biāo)簽20c：蛋白質(zhì)分解酶的切斷位點(diǎn)21：混雜蛋白質(zhì)22：融合肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分解酶22a：蛋白質(zhì)分解酶22b：肽標(biāo)簽?序列表<110>sysmexcorporation<120>目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化方法<130>15-065cn<160>67<170>patentinversion3.5<210>1<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>de12<400>1glugluglugluglugluaspaspaspaspaspasp1510<210>2<211>18<212>prt<213>人工序列<220><223>de18<400>2gluglugluglugluglugluglugluaspaspaspaspaspaspasp151015aspasp<210>3<211>24<212>prt<213>人工序列<220><223>de24<400>3glugluglugluglugluglugluglugluglugluaspaspaspasp151015aspaspaspaspaspaspaspasp20<210>4<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>de30<400>4gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluasp151015aspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspasp202530<210>5<211>36<212>prt<213>人工序列<220><223>de36<400>5gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu151015glugluaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspaspasp202530aspaspaspasp35<210>6<211>88<212>prt<213>人工序列<220><223>ded<400>6asnvalgluglylysthrglyasnalathraspglugluglugluglu151015gluglugluglugluglugluaspaspaspaspaspaspaspaspasp202530aspaspaspgluaspserglyalagluileglnaspaspaspgluglu354045glypheaspaspglugluglupheaspaspaspaspaspaspgluhis505560aspaspaspaspleugluasnglugluasngluleuglugluleuglu65707580gluargvalglualaarglyslys85<210>7<211>44<212>prt<213>人工序列<220><223>des<400>7aspleuserasnvalgluglylysthrglyasnalathraspgluglu151015glugluglugluglugluglugluglugluaspaspaspaspaspasp202530aspaspaspaspaspaspgluaspserglyalaglu3540<210>8<211>24<212>prt<213>人工序列<220><223>eo24<400>8gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu151015gluglugluglugluglugluglu20<210>9<211>274<212>prt<213>人工序列<220><223>nq01<400>9metvalglyargargalaleuilevalleualahissergluargthr151015serpheasntyralametlysglualaalaalaalaalaleulyslys202530lysglytrpgluvalvalgluseraspleutyralametasnpheasn354045proileileserarglysaspilethrglylysleulysaspproala505560asnpheglntyrproalagluservalleualatyrlysgluglyhis65707580leuserproaspilevalalagluglnlyslysleuglualaalaasp859095leuvalilepheglnpheproleuglntrppheglyvalproalaile100105110leulysglytrpphegluargvalpheileglygluphealatyrthr115120125tyralaalamettyrasplysglypropheargserlyslysalaval130135140leuserilethrthrglyglyserglysermettyrserleuglngly145150155160ilehisglyaspmetasnvalileleutrpproileglnserglyile165170175leuhisphecysglypheglnvalleugluproglnleuthrtyrser180185190ileglyhisthrproalaaspalaargileglnileleugluglytrp195200205lyslysargleugluasniletrpaspgluthrproleutyrpheala210215220proserserleupheaspleuasnpheglnalaglypheleumetlys225230235240lysgluvalglnaspgluglulysasnlyslyspheglyleuserval245250255glyhishisleuglylysserileprothraspasnglnilelysala260265270arglys<210>10<211>546<212>prt<213>人工序列<220><223>熒光素酶<400>10gluaspalalysasnilelyslysglyproalaprophetyrproleu151015gluaspglythralaglygluglnleuhislysalametlysargtyr202530alaleuvalproglythrilealaphethraspalahisilegluval354045asnilethrtyralaglutyrpheglumetservalargleualaglu505560alametlysargtyrglyleuasnthrasnhisargilevalvalcys65707580sergluasnserleuglnphephemetprovalleuglyalaleuphe859095ileglyvalalavalalaproalaasnaspiletyrasngluargglu100105110leuleuasnsermetasnileserglnprothrvalvalphevalser115120125lyslysglyleuglnlysileleuasnvalglnlyslysleuproile130135140ileglnlysileileilemetaspserlysthrasptyrglnglyphe145150155160glnsermettyrthrphevalthrserhisleuproproglypheasn165170175glutyraspphevalprogluserpheaspargasplysthrileala180185190leuilemetasnserserglyserthrglyleuprolysglyvalala195200205leuprohisargthralacysvalargpheserhisalaargasppro210215220ilepheglyasnglnileileproaspthralaileleuservalval225230235240prophehishisglypheglymetphethrthrleuglytyrleuile245250255cysglypheargvalvalleumettyrargphegluglugluleuphe260265270leuargserleuglnasptyrlysileglnseralaleuleuvalpro275280285thrleupheserphephealalysserthrleuileasplystyrasp290295300leuserasnleuhisgluilealaserglyglyalaproleuserlys305310315320gluvalglyglualavalalalysargphehisleuproglyilearg325330335glnglytyrglyleuthrgluthrthrseralaileleuilethrpro340345350gluglyaspasplysproglyalavalglylysvalvalprophephe355360365glualalysvalvalaspleuaspthrglylysthrleuglyvalasn370375380glnargglygluleucysvalargglyprometilemetserglytyr385390395400valasnasnproglualathrasnalaleuileasplysaspglytrp405410415leuhisserglyaspilealatyrtrpaspgluaspgluhisphephe420425430ilevalaspargleulysserleuilelystyrlysglytyrglnval435440445alaproalagluleugluserileleuleuglnhisproasnilephe450455460aspalaglyvalalaglyleuproaspaspaspalaglygluleupro465470475480alaalavalvalvalleugluhisglylysthrmetthrglu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