本發(fā)明涉及一種從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法，屬于生化分離技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)鏈高級(jí)烷烴(c12-c16)具有較高的logp值(6.6-8.8),因此對(duì)細(xì)胞的毒性作用較小，有較好的生物相容性，常用來(lái)做植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞的兩相培養(yǎng)溶劑。有許多學(xué)者研究利用長(zhǎng)鏈高級(jí)烷烴為有機(jī)相，進(jìn)行紫草毛狀根兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫草素、東北紅豆杉兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇、杜氏鹽藻兩相培養(yǎng)生產(chǎn)類胡蘿卜素等，能夠有效地將代謝產(chǎn)物從細(xì)胞中轉(zhuǎn)移至有機(jī)相，并加快代謝產(chǎn)物的釋放速率，同時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用非常小。

長(zhǎng)鏈高級(jí)烷烴(c12-c16)對(duì)許多脂溶性活性產(chǎn)物都有較好的萃取發(fā)酵效果，但是其沸點(diǎn)較高，例如正十二烷的沸點(diǎn)高達(dá)215℃，這導(dǎo)致不能利用水浴的真空濃縮去除發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中的長(zhǎng)鏈高級(jí)烷烴溶劑而得到活性產(chǎn)物，采用溫度較高的油浴真空濃縮會(huì)使熱敏性成分分解，而且存在安全隱患；利用乙醇等溶劑萃取長(zhǎng)鏈高級(jí)烷烴也不能得到良好的效果，要消耗大量乙醇，萃取率較低，萃取后的十二烷烴中活性成分殘余較多，而且乙醇中仍然會(huì)溶解部分十二烷烴。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決難以從含有長(zhǎng)鏈高級(jí)烷烴的發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的問題而進(jìn)行的，目的在于提供一種從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法。

本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，將牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液與有機(jī)溶劑按體積比5:1-1:3的比例進(jìn)行混合，并攪拌萃取得到混合液。

步驟二，將混合液置于低溫環(huán)境中，攪拌20-60min，攪拌速率為50-200rpm，得到冰晶。

步驟三，在低溫環(huán)境下，將冰晶壓榨去除，得到剩余溶液。

步驟四，將剩余溶液重復(fù)步驟二以及步驟三直至無(wú)冰晶生成為止，得到最終溶液。

步驟五，將最終溶液進(jìn)行低溫真空濃縮，去除有機(jī)溶劑，所得膏狀物即為活性成分。

在本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法中，還可以具有這樣的特征：其中，牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物包括牛樟芝谷物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物以及牛樟芝原位萃取發(fā)酵產(chǎn)物。

在本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法中，還可以具有這樣的特征：其中，萃取液中的萃取劑為碳原子個(gè)數(shù)為12-16的長(zhǎng)鏈高級(jí)烷烴。

在本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法中，還可以具有這樣的特征：其中，活性成分包括麥角甾醇、安卓奎諾爾、不飽和脂肪酸。

在本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法中，還可以具有這樣的特征：其中，在步驟一中，有機(jī)溶劑為丙酮、乙醇或甲醇中的任意一種或任意兩種及以上的混合溶劑。

在本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法中，還可以具有這樣的特征：其中，在步驟一中，攪拌萃取的攪拌速率為300rpm，攪拌時(shí)間為30min。

在本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法中，還可以具有這樣的特征：其中，在步驟二中，低溫的溫度范圍為-10-0℃。

在本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法中，還可以具有這樣的特征：其中，在步驟三中，低溫的溫度為0℃。

在本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法中，還可以具有這樣的特征，在步驟一之前，還包括預(yù)處理步驟：將牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液5000rpm離心，去除固形雜質(zhì)以及殘余水分。

在本發(fā)明提供的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法中，還可以具有這樣的特征其特征在于，在步驟五之后，還包括萃取劑回收利用步驟：將冰晶融化處理得到含有萃取劑的溶液，將該溶液繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液的生產(chǎn)、制備。

發(fā)明的作用與效果

本發(fā)明所涉及的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法，利用冷凍濃縮的原理，將牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物的長(zhǎng)鏈高級(jí)烷烴萃取液中提取出來(lái)，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：分離提取的方法簡(jiǎn)單，活性成分提取率高達(dá)90％以上，克服了高溫提取破壞活性成分的活性的缺點(diǎn)，特別適用于熱敏性活性成分的提取分離，產(chǎn)品質(zhì)量容易控制，避免了高溫操作，安全可靠，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法作具體闡述。

實(shí)施例1

牛樟芝谷物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取分離

在本實(shí)施例中，牛樟芝谷物為牛樟芝青稞。

步驟一，取50g牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物粉末，加入十二烷烴500ml，50℃攪拌萃取1h，萃取結(jié)束后抽濾，獲得牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液，5000rpm離心去除固形雜質(zhì)以及殘余水分。

步驟二，將牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液與丙酮按體積比5:1的比例進(jìn)行混合，并攪拌萃取，攪拌速率為300rpm，萃取時(shí)間為30min，得到混合液。

步驟三，將混合液置于-10℃環(huán)境中，攪拌20min，攪拌速率為50rpm。

步驟四，在0℃環(huán)境下，將混合溶液中的冰晶迅速壓榨去除，得到剩余溶液。

步驟五，將剩余溶液重復(fù)步驟二以及步驟三直至無(wú)冰晶生成為止，得到最終溶液。

步驟六，將最終溶液進(jìn)行低溫真空濃縮，去除丙酮，所得膏狀物即為活性成分。

步驟七，將冰晶融化處理得到含有十二烷烴的溶液，將該溶液繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液的制備。

根據(jù)本實(shí)施例的分離純化方法，牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵的活性成分麥角甾醇、安卓奎諾爾antroquinonol、不飽和脂肪酸的提取率達(dá)到90％，回收的十二烷烴溶液為無(wú)色無(wú)味液體，能夠繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液的制備。

實(shí)施例2

牛樟谷物稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取分離

在本實(shí)施例中，牛樟芝谷物為牛樟芝青稞。

步驟一，取50g牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物粉末，加入十二烷烴500ml，50℃攪拌萃取1h，萃取結(jié)束后抽濾，獲得牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液，5000rpm離心去除固形雜質(zhì)以及殘余水分。

步驟二，將牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液與丙酮按體積比1:1的比例進(jìn)行混合，并攪拌萃取，攪拌速率為300rpm，萃取時(shí)間為30min，得到混合液。

步驟三，將混合液置于-6℃環(huán)境中，攪拌40min，攪拌速率為90rpm。

步驟四，在0℃環(huán)境下，將混合溶液中的冰晶迅速壓榨去除，得到剩余溶液。

步驟五，將剩余溶液重復(fù)步驟二以及步驟三直至無(wú)冰晶生成為止，得到最終溶液。

步驟六，將最終溶液進(jìn)行低溫真空濃縮，去除丙酮，所得膏狀物即為活性成分。

步驟七，將冰晶融化處理得到含有十二烷烴的溶液，將該溶液繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液的制備。

根據(jù)本實(shí)施例的分離純化方法，牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵的活性成分麥角甾醇、安卓奎諾爾antroquinonol、不飽和脂肪酸的提取率達(dá)到97％，回收的十二烷烴溶液為無(wú)色無(wú)味液體，能夠繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液的制備。

實(shí)施例3

牛樟芝谷物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取分離

在本實(shí)施例中，牛樟芝谷物為牛樟芝青稞。

步驟一，取50g牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物粉末，加入十二烷烴500ml，50℃攪拌萃取1h，萃取結(jié)束后抽濾，獲得牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液，5000rpm離心去除固形雜質(zhì)以及殘余水分。

步驟二，將牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液與丙酮按體積比1:3的比例進(jìn)行混合，并攪拌萃取，攪拌速率為300rpm，萃取時(shí)間為30min，得到混合液。

步驟三，將混合液置于0℃環(huán)境中，攪拌60min，攪拌速率為200rpm。

步驟四，在0℃環(huán)境下，將混合溶液中的冰晶迅速壓榨去除，得到剩余溶液。

步驟五，將剩余溶液重復(fù)步驟二以及步驟三直至無(wú)冰晶生成為止，得到最終溶液。

步驟六，將最終溶液進(jìn)行低溫真空濃縮，去除丙酮，所得膏狀物即為活性成分。

步驟七，將冰晶融化處理得到含有十二烷烴的溶液，將該溶液繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液的制備。

根據(jù)本實(shí)施例的分離純化方法，牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵的活性成分麥角甾醇、安卓奎諾爾antroquinonol、不飽和脂肪酸的提取率達(dá)到93％，回收的十二烷烴溶液為無(wú)色無(wú)味液體，能夠繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液的制備。

實(shí)施例4

牛樟芝谷物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取分離

在本實(shí)施例中，牛樟芝谷物為牛樟芝青稞。

步驟一，取50g牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物粉末，加入十四烷烴500ml，50℃攪拌萃取1h，萃取結(jié)束后抽濾，獲得牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液，5000rpm離心去除固形雜質(zhì)以及殘余水分。

步驟二，將牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液與乙醇按體積比1:1的比例進(jìn)行混合，并攪拌萃取，攪拌速率為300rpm，萃取時(shí)間為30min，得到混合液。

步驟三，將混合液置于-6℃環(huán)境中，攪拌40min，攪拌速率為90rpm。

步驟四，在0℃環(huán)境下，將混合溶液中的冰晶迅速壓榨去除，得到剩余溶液。

步驟五，將剩余溶液重復(fù)步驟二以及步驟三直至無(wú)冰晶生成為止，得到最終溶液。

步驟六，將最終溶液進(jìn)行低溫真空濃縮，去除丙酮，所得膏狀物即為活性成分。

步驟七，將冰晶融化處理得到含有十四烷烴的溶液，將該溶液繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液的制備。

根據(jù)本實(shí)施例的分離純化方法，牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵的活性成分麥角甾醇、安卓奎諾爾antroquinonol、不飽和脂肪酸的提取率達(dá)到95％，回收的十四烷烴溶液為無(wú)色無(wú)味液體，能夠繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的萃取液的制備。

實(shí)施例5

牛樟芝十二烷烴原位萃取發(fā)酵產(chǎn)物的萃取分離

步驟一，將牛樟芝十二烷烴原位萃取發(fā)酵液中的萃取液取出，即為牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液，量取100ml，5000rpm離心去除固形雜質(zhì)以及殘余水分。

步驟二，將牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液與丙酮按體積比1:1的比例進(jìn)行混合，并攪拌萃取，攪拌速率為300rpm，萃取時(shí)間為30min，得到混合液。

步驟三，將混合液置于-6℃環(huán)境中，攪拌40min，攪拌速率為90rpm。

步驟四，在0℃環(huán)境下，將混合溶液中的冰晶迅速壓榨去除，得到剩余溶液。

步驟五，將剩余溶液重復(fù)步驟二以及步驟三直至無(wú)冰晶生成為止，得到最終溶液。

步驟六，將最終溶液進(jìn)行低溫真空濃縮，去除丙酮，所得膏狀物即為活性成分。

步驟七，將冰晶融化處理得到含有十二烷烴的溶液，將該溶液繼續(xù)利用來(lái)進(jìn)行牛樟芝十二烷烴原位萃取發(fā)酵液的萃取液的制備。

根據(jù)本實(shí)施例的分離純化方法，牛樟芝十二烷烴原位萃取發(fā)酵的活性成分麥角甾醇、安卓奎諾爾antroquinonol、不飽和脂肪酸的提取率達(dá)到97％，回收的十二烷烴為無(wú)色無(wú)味液體，能夠繼續(xù)用于牛樟芝十二烷烴原位萃取發(fā)酵液的萃取液的制備。

實(shí)施例的作用與效果

本發(fā)明所涉及的從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物萃取液中提取活性成分的方法，利用冷凍濃縮的原理，將牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分從牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物的長(zhǎng)鏈高級(jí)烷烴萃取液中提取出來(lái)，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：分離提取的方法簡(jiǎn)單，活性成分提取率高達(dá)90％以上，克服了高溫提取破壞活性成分的活性的缺點(diǎn)，特別適用于熱敏性活性成分的提取分離，產(chǎn)品質(zhì)量容易控制，避免了高溫操作，安全可靠，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

更進(jìn)一步地，可以同時(shí)回收高級(jí)烷烴萃取劑，回收的高級(jí)烷烴萃取劑無(wú)色無(wú)味說(shuō)明其中的發(fā)酵產(chǎn)物含量極低，可以重復(fù)使用，從而降低生產(chǎn)成本，使發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

上述實(shí)施方式為本發(fā)明的優(yōu)選案例，并不用來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。