本發(fā)明涉及一種提取羅漢果甜苷的方法，具體涉及一種同時(shí)提取羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v的方法。

背景技術(shù)：

羅漢果是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物，羅漢果甜苷是其主要的功能成分，是一類高甜度、低卡路里的理想天然甜味劑，因其具有多種生物活性而備受人們的關(guān)注。羅漢果甜苷分為多種，研究表明羅漢果甜苷是一種三萜烯葡萄糖苷，其配糖苷元是三萜烯醇，有兩條由四個(gè)以下葡萄糖單位組成的葡萄糖苷側(cè)鏈，以β-糖苷鍵與苷元相連，側(cè)鏈葡糖糖之間的連接鍵為β-1,6和β-1,2糖苷鍵。其中，羅漢果甜苷v的含量最高，其次是11-o基苷v和苷ⅵ，三種甜苷的分子式如下：

羅漢果甜苷v

羅漢果11-o基苷v羅漢果甜苷ⅵ

羅漢果甜苷的提取在國(guó)內(nèi)已有多年的產(chǎn)業(yè)化經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于羅漢果甜苷v的分離和提純的研究比較廣泛。

cn101029071a公開(kāi)了一種從羅漢果中制備高純度羅漢果苷v的方法，是以羅漢果鮮果為原料，通過(guò)乙醇回流提取，乙酸乙酯和正丁醇萃取，聚酰胺和硅膠層析，得到羅漢果苷v。但是，該方法過(guò)于復(fù)雜，生產(chǎn)成本極高，且只能獲得羅漢果苷v一種成分。

cn106074669a公開(kāi)了一種羅漢果多酚的提取方法，是以羅漢果果皮為原料，通過(guò)干燥，粉碎，乙醇超聲提取，聚酰胺吸附，洗脫，濃縮等步驟得到羅漢果多酚提取物。但是，該方法未涉及羅漢果甜苷的分離方法。

cn1375499a公開(kāi)了一種從羅漢果中提取分離多種成份的方法，是以羅漢果為原料，通過(guò)堿水提取，脂肪醇沉淀，離子交換樹(shù)脂、大孔樹(shù)脂、聚酰胺樹(shù)脂等處理，得到羅漢果甜苷、羅漢果多糖和羅漢果黃酮。但是，該方法獲得的羅漢果甜苷為多種甜苷的混合物，并未得到各甜苷的高純產(chǎn)品。

cn101851265a公開(kāi)了一種從干羅漢果中提取多種活性成分的方法，是先將干羅漢果去核，再通過(guò)加水閃提，離心，多次聚酰胺層析，d213脫色，醇沉，酶解等步驟，分別得到甜苷、多酚、多糖、低聚糖和氨基酸等成分。但是，該方法獲得的羅漢果甜苷同樣是多種甜苷的混合物，并未得到各甜苷的高純產(chǎn)品。

由上可知，現(xiàn)有關(guān)于羅漢果11-o基苷v和苷ⅵ分離和提純的報(bào)道很少。實(shí)際生產(chǎn)中得到的羅漢果提取物通常是羅漢果總苷的混合物，因此，迫切需要找到一種方法，實(shí)現(xiàn)單一成分的分離，并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種所得產(chǎn)品純度、收率高，成本低，工藝條件溫和，安全環(huán)保，適于工業(yè)化生產(chǎn)的同時(shí)提取羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：一種同時(shí)提取羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v的方法，包括以下步驟：

（1）正丁醇萃?。簩⒘_漢果甜苷v精制母液用水溶解，加入正丁醇進(jìn)行萃取，分離水層，得正丁醇層；

（2）濃縮析晶：將步驟（1）所得正丁醇層減壓濃縮，冷卻，攪拌析晶，過(guò)濾，得晶體和正丁醇析晶母液，將晶體干燥，得羅漢果甜苷ⅵ；

（3）聚酰胺層析：將步驟（2）所得正丁醇析晶母液減壓濃縮至無(wú)醇，將所得濃縮物用水溶解，通過(guò)聚酰胺層析柱，收集上柱流出液，減壓濃縮，干燥，得羅漢果甜苷v；

（4）梯度洗脫：先后用低度醇溶液和高度醇溶液對(duì)步驟（3）過(guò)柱后的聚酰胺層析柱進(jìn)行洗脫，收集高度醇洗脫液，濃縮，冷卻，析晶，過(guò)濾，干燥，得羅漢果11-o基苷v。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述羅漢果甜苷v精制母液中，羅漢果甜苷ⅵ的質(zhì)量含量為10～30%，羅漢果甜苷v的質(zhì)量含量為10～15%，11-o基苷v的質(zhì)量含量為5～20%。本發(fā)明所述羅漢果甜苷v精制母液來(lái)源于以羅漢果提取物為原料，用有機(jī)溶劑結(jié)晶制備高純度羅漢果甜苷v時(shí)所產(chǎn)生的母液。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述羅漢果甜苷v精制母液、水和正丁醇的質(zhì)量比為1:5～10:4～30（更優(yōu)選1:5～10:5～15）。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，加入的水可溶解水溶性的雜質(zhì)、色素以及無(wú)機(jī)鹽等，通過(guò)保留在水層中以除去，而加入的正丁醇對(duì)總苷的溶解度適中，且可與水分層，實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)與總苷的分離，這是其它溶劑無(wú)法替代的。若正丁醇的用量過(guò)少，則總苷的萃取不徹底；若正丁醇的用量過(guò)多，將加大濃縮的任務(wù)量，并增加物料損耗。

優(yōu)選地，步驟（2）、（3）中，所述減壓濃縮的溫度為70～90℃，減壓濃縮的真空度為-0.06～-0.09mpa，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為20～35%（更優(yōu)選25～30%）。若濃縮后的濃縮液濃度過(guò)低，則達(dá)不到羅漢果苷ⅵ結(jié)晶的濃度，羅漢果苷ⅵ無(wú)法充分析出；若濃縮后的濃縮液濃度過(guò)高，則雜質(zhì)也將析出，降低產(chǎn)品的純度。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述攪拌析晶的溫度為15～30℃，轉(zhuǎn)速為60～120r/min，時(shí)間為12～36h。在所述析晶條件下，使得析出的晶體為高純的羅漢果甜苷ⅵ，而不會(huì)析出其它的甜苷或雜質(zhì)。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述水的用量為濃縮物質(zhì)量的18～50倍（更優(yōu)選20～30倍）。用水溶解的目的是使?jié)饪s物以水溶液的狀態(tài)通過(guò)聚酰胺層析柱層析，更有利于吸附。聚酰胺的吸附是“氫鍵原理”，只有與聚酰胺樹(shù)脂形成氫鍵的物質(zhì)才可吸附于其上，且樹(shù)脂吸附有一個(gè)最佳的濃度，高于或低于此濃度都將導(dǎo)致吸附率下降，所以，若水的用量過(guò)少，水溶液中的總物質(zhì)的濃度過(guò)高，則聚酰胺無(wú)法吸附11-o基苷v及黃酮、多酚等雜質(zhì)，導(dǎo)致羅漢果甜苷v與11-o基苷v和雜質(zhì)無(wú)法分離；若水的用量過(guò)多，則將延長(zhǎng)上柱的時(shí)間，造成人力、物力的浪費(fèi)。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述聚酰胺的目數(shù)為50～200目，用量為濃縮物質(zhì)量的4～20倍（更優(yōu)選5～10倍），聚酰胺層析柱的高徑比為1～20:1（更優(yōu)選5～15:1）。使用聚酰胺的目的是吸附11-o基苷v，從而使11-o基苷v和羅漢果甜苷v分離。若聚酰胺的用量過(guò)少，或?qū)游鲋母邚奖冗^(guò)小，都將導(dǎo)致11-o基苷v無(wú)法充分的被吸附；若聚酰胺的用量過(guò)多，或?qū)游鲋母邚奖冗^(guò)大，都將增加洗脫的難度和時(shí)間。

優(yōu)選地，步驟（3）中，上柱的流速為0.5～2.0bv/h。本發(fā)明方法所述1bv=1個(gè)柱床體積。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述低度醇溶液和高度醇溶液中的醇均為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇等中的一種或幾種；所述低度醇溶液的體積濃度為10～40%（更優(yōu)選15～30%），所述高度醇溶液的體積濃度為50～85%（更優(yōu)選70～80%）。利用低度醇和高度醇的極性不同，進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫先用低度醇洗脫除去黃酮、多酚等雜質(zhì)，再用高度醇將目標(biāo)產(chǎn)品11-o基苷v洗脫并收集。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述低度醇溶液的用量為2～5bv，高度醇溶液的用量為2～5bv；所述洗脫的流速均為0.5～2.0bv/h。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述濃縮的溫度為60～80℃，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為25～45%。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述析晶的溫度為15～30℃，時(shí)間為12～36h。

本發(fā)明方法的原理為：羅漢果甜苷v精制母液的成分除了含有少量羅漢果甜苷v之外，主要的成分是11-o基苷v和羅漢果甜苷ⅵ。在同時(shí)提取羅漢果甜苷ⅵ、羅漢果苷v和11-o基苷v時(shí)，由于羅漢果甜苷ⅵ在母液中所占比例高，且其極性比其它兩種甜苷都小，可在正丁醇中結(jié)晶析出，所以首先提取出羅漢果甜苷ⅵ；11-o基苷v因其特有的結(jié)構(gòu)可與聚酰胺形成氫鍵，因此可以吸附于聚酰胺層析柱，而羅漢果甜苷v不能與聚酰胺形成氫鍵，所以聚酰胺對(duì)羅漢果甜苷v不吸附，因而得以分離。

本發(fā)明方法的有益效果如下：

（1）本發(fā)明方法所得羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均為白色粉末，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，羅漢果甜苷ⅵ的純度≥97%，收率≥83%，羅漢果甜苷v的純度≥89%，收率≥89%，11-o基苷v的純度≥96%，收率≥85%；實(shí)現(xiàn)了同時(shí)從羅漢果甜苷v精制母液中提取羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v，提高了羅漢果資源的利用率，增加了產(chǎn)品的附加值；

（2）本發(fā)明方法采用的分離和提純方式條件溫和，安全環(huán)保，對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求，適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例所使用的羅漢果甜苷v精制母液來(lái)源于湖南華誠(chéng)生物資源股份有限公司以羅漢果提取物為原料，用有機(jī)溶劑結(jié)晶制備高純度羅漢果甜苷v時(shí)所產(chǎn)生的母液，經(jīng)高效液相色譜外標(biāo)法檢測(cè)，其中，羅漢果甜苷ⅵ的質(zhì)量含量為20.1%，羅漢果甜苷v的質(zhì)量含量為10.9%，羅漢果11-o基苷v的質(zhì)量含量為15.5%；本發(fā)明實(shí)施例所使用的聚酰胺樹(shù)脂（目數(shù)為50～100目）購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；本發(fā)明實(shí)施例所使用的原料和化學(xué)試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均通過(guò)常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

（1）正丁醇萃?。簩?00g羅漢果甜苷v精制母液用500g水溶解，加入500g正丁醇進(jìn)行萃取，分離水層，得正丁醇層；

（2）濃縮析晶：將步驟（1）所得正丁醇層在80℃、真空度為-0.07mpa下，減壓濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為25%，冷卻，在15℃，轉(zhuǎn)速120r/min下，攪拌析晶12h，過(guò)濾，得晶體和正丁醇析晶母液，將晶體干燥，得18.2g羅漢果甜苷ⅵ；

（3）聚酰胺層析：將步驟（2）所得正丁醇析晶母液在80℃、真空度為-0.07mpa下，減壓濃縮至無(wú)醇，將所得70g濃縮物用1750g水溶解，以1bv/h的流速通過(guò)聚酰胺層析柱（其中，聚酰胺的用量為420g，層析柱的高徑比為10:1），收集上柱流出液，在80℃、真空度為-0.07mpa下，減壓濃縮，干燥，得10.8g羅漢果甜苷v；

（4）梯度洗脫：先用2bv體積濃度為20%的乙醇溶液，以0.5bv/h的流速對(duì)步驟（3）過(guò)柱后的聚酰胺層析柱進(jìn)行洗脫，再用4bv體積濃度為80%的乙醇溶液，以0.5bv/h的流速進(jìn)行洗脫，收集體積濃度為80%的乙醇溶液的洗脫液，在65℃下，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為30%，冷卻，在25℃下，析晶24h，過(guò)濾，干燥，得13.8g羅漢果11-o基苷v。

本實(shí)施例所得羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均為白色粉末，經(jīng)高效液相色譜外標(biāo)法檢測(cè)，所得羅漢果甜苷ⅵ的純度為97.5%，收率為88.28%；羅漢果甜苷v的純度為91.9%，收率為91.06%；羅漢果11-o基苷v的純度為98.2%，收率為87.43%。

實(shí)施例2

（1）正丁醇萃取：將200g羅漢果甜苷v精制母液用1600g水溶解，加入2400g正丁醇進(jìn)行萃取，分離水層，得正丁醇層；

（2）濃縮析晶：將步驟（1）所得正丁醇層在85℃、真空度為-0.08mpa下，減壓濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為30%，冷卻，在30℃，轉(zhuǎn)速80r/min下，攪拌析晶36h，過(guò)濾，得晶體和正丁醇析晶母液，將晶體干燥，得34.3g羅漢果甜苷ⅵ；

（3）聚酰胺層析：將步驟（2）所得正丁醇析晶母液在85℃、真空度為-0.08mpa下，減壓濃縮至無(wú)醇，將所得135g濃縮物用2700g水溶解，以0.5bv/h的流速通過(guò)聚酰胺層析柱（其中，聚酰胺的用量為1350g，層析柱的高徑比為8:1），收集上柱流出液，在85℃、真空度為-0.08mpa下，減壓濃縮，干燥，得20.8g羅漢果甜苷v；

（4）梯度洗脫：先用3bv體積濃度為15%的甲醇溶液，以1bv/h的流速對(duì)步驟（3）過(guò)柱后的聚酰胺層析柱進(jìn)行洗脫，再用5bv體積濃度為75%的甲醇溶液，以1bv/h的流速進(jìn)行洗脫，收集體積濃度為75%的甲醇溶液的洗脫液，在60℃下，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為35%，冷卻，在15℃下，析晶18h，過(guò)濾，干燥，得27.3g羅漢果11-o基苷v。

本實(shí)施例所得羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均為白色粉末，經(jīng)高效液相色譜外標(biāo)法檢測(cè)，所得羅漢果甜苷ⅵ的純度為98%，收率為83.62%；羅漢果甜苷v的純度為93.5%，收率為89.21%；羅漢果11-o基苷v的純度為96.9%，收率為85.33%。

實(shí)施例3

（1）正丁醇萃?。簩?50g羅漢果甜苷v精制母液用900g水溶解，加入900g正丁醇進(jìn)行萃取，分離水層，得正丁醇層；

（2）濃縮析晶：將步驟（1）所得正丁醇層在75℃、真空度為-0.06mpa下，減壓濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為30%，冷卻，在25℃，轉(zhuǎn)速60r/min下，攪拌析晶24h，過(guò)濾，得晶體和正丁醇析晶母液，將晶體干燥，得25.8g羅漢果甜苷ⅵ；

（3）聚酰胺層析：將步驟（2）所得正丁醇析晶母液在75℃、真空度為-0.06mpa下，減壓濃縮至無(wú)醇，將所得100g濃縮物用2000g水溶解，以1.5bv/h的流速通過(guò)聚酰胺層析柱（其中，聚酰胺的用量為500g，層析柱的高徑比為15:1），收集上柱流出液，在75℃、真空度為-0.06mpa下，減壓濃縮，干燥，得16.9g羅漢果甜苷v；

（4）梯度洗脫：先用3bv體積濃度為30%的異丙醇溶液，以1.5bv/h的流速對(duì)步驟（3）過(guò)柱后的聚酰胺層析柱進(jìn)行洗脫；再加入5bv體積濃度為70%的異丙醇溶液，以1.5bv/h的流速進(jìn)行洗脫，收集體積濃度為70%的異丙醇溶液的洗脫液，在75℃下，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為40%，冷卻，在30℃下，析晶36h，過(guò)濾，干燥，得20.2g羅漢果11-o基苷v。

本實(shí)施例所得羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均為白色粉末，經(jīng)高效液相色譜外標(biāo)法檢測(cè)，所得羅漢果甜苷ⅵ的純度為97.1wt%，收率為83.09%；羅漢果甜苷v的純度為89.6%，收率為92.61%；羅漢果11-o基苷v的純度為97.9wt%，收率為85.06%。