本發(fā)明涉及羅漢果栽培技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種提高羅漢果苷Ⅲ含量的方法。

背景技術(shù)：

羅漢果(Siraitia grosvenorii)為中國特有的珍貴藥用和甜料植物。其果實(shí)性涼、味甘，具有清熱潤肺，利咽開音，滑腸通便和抗癌等功效，活性成分甜苷V為世界上最強(qiáng)的非糖甜味物質(zhì)之一，是蔗糖甜度的300-400倍，廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品中，是糖尿病人、肥胖者和高血壓患者的理想糖替代品。研究發(fā)現(xiàn)，甜苷V是由苷Ⅲ等低苷轉(zhuǎn)化而來，特別是在果實(shí)發(fā)育后期，苷Ⅲ等低苷被完全消耗殆盡轉(zhuǎn)化成甜苷V，然而，苷Ⅲ只存在占果重不足15％的果肉內(nèi)，且含量極低，嚴(yán)重制約了羅漢果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

茉莉酸甲酯作為植物信號(hào)誘導(dǎo)子能夠安全有效地激發(fā)植物次生代謝物的產(chǎn)生和積累。因此，優(yōu)選合適的茉莉酸甲酯施用時(shí)間和濃度，可以最大限度地提高藥用植物活性成分的含量?，F(xiàn)有技術(shù)中未見有茉莉酸甲酯提高羅漢果苷Ⅲ含量的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種提高羅漢果苷Ⅲ含量的方法，具有見效快、成本低、操作簡單、方便實(shí)施、產(chǎn)品無毒無殘留等特征，以滿足羅漢果苷Ⅲ的大規(guī)模生產(chǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種提高羅漢果苷Ⅲ含量的方法，將羅漢果組培苗接種于含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行組織培養(yǎng)28～35天；其中，茉莉酸甲酯的濃度為50-400μmol/L。

優(yōu)選的是，所述固體培養(yǎng)基中還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其配方為：MS、1.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IBA、3.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭。

優(yōu)選的是，羅漢果組培苗組織培養(yǎng)的條件為：相對(duì)濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux、光照時(shí)間8h/d、溫度23±2℃。

優(yōu)選的是，固體培養(yǎng)基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液中，配制成50mmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到凝固前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯濃度為50-400μmol/L，滅菌并冷卻至24-26℃。

優(yōu)選的是，所述固體培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度為200-245μmol/L。

優(yōu)選的是，將經(jīng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后40-50天，每天早、中、晚在羅漢果表面噴灑茉莉酸甲酯溶液至表面滴水，連續(xù)噴灑10天，所述茉莉酸甲酯溶液中含有濃度為50-400μmol/L的茉莉酸甲酯。

優(yōu)選的是，所述茉莉酸甲酯溶液中含有濃度為200-245μmol/L的茉莉酸甲酯；

所述茉莉酸甲酯溶液的制備方法為：將茉莉酸甲酯用2％的乙醇水溶液溶解后加水定容至茉莉酸甲酯的濃度為200-245μmol/L。

優(yōu)選的是，組織培養(yǎng)之后，將羅漢果組培苗距離根部1cm以上部位劃傷1-2個(gè)0.8mm深的傷口，并將含有0.03mg/L蜂毒和0.2mg/L硝酸鈣的誘導(dǎo)劑滴涂于傷口處，每株羅漢果組培苗滴涂0.05mL，然后將蘆薈膠涂覆于傷口處形成厚度為1-1.5mm厚度的膜，再將羅漢果組培苗置于波長為280-315nm的中波紫外線下輻射處理0.5h后用于移栽。

優(yōu)選的是，

羅漢果組培苗移栽至田間的具體步驟為：

在田間挖深度為8～14cm的種植坑，并在種植坑的底部鋪設(shè)聚乙烯醇薄膜，之后在種植坑內(nèi)插入育苗杯，再在育苗杯內(nèi)倒入殺菌后的育苗基質(zhì)至與種植坑外的土層高度相同，將羅漢果組培苗種植于育苗基質(zhì)中，并使羅漢果組培苗的葉片位于育苗杯外后，在育苗基質(zhì)上依次鋪設(shè)1～2cm厚的保水劑層和1～3cm厚的填料層，所述填料層包括質(zhì)量比為1:5:8～10遠(yuǎn)紅外陶瓷粉、紅糖和草炭，再在填料層的表面鋪設(shè)一層紗布，使羅漢果組培苗穿過紗布，之后在紗布上鋪設(shè)粗石塊，移栽10～20d后，取出粗石塊和紗布，抽出育苗杯，將填料層填入抽出育苗杯后形成的環(huán)溝中，若填料層將環(huán)溝填滿后還有多余，則將多余的填料層埋入育苗基質(zhì)中或進(jìn)行回收，若填料層未能將環(huán)溝填滿，則用育苗基質(zhì)填充環(huán)溝至與種植坑外的土層高度相同；其中，

所述育苗杯包括：

杯體，其為圓筒體形，所述杯體的側(cè)壁上沿其圓周方向間隔設(shè)置有多個(gè)出水孔，所述出水孔位于紗布的上方，粗石塊與所述出水孔不接觸；

積液板，其為直徑上大下小的圓臺(tái)形，所述積液板的內(nèi)部中空，且頂部和底部均敞開，所述積液板的頂部的直徑與所述杯體的內(nèi)徑相等，所述積液板的頂部與所述杯體的內(nèi)側(cè)壁固定連接，所述積液板與所述杯體一體成型，且位于所述出水孔的上方。

優(yōu)選的是，

每次早、中噴灑茉莉酸甲酯溶液后，對(duì)羅漢果植株進(jìn)行全遮光30min。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

本發(fā)明通過在羅漢果組培苗和種植羅漢果時(shí)施加茉莉酸甲酯，以誘導(dǎo)羅漢果苷Ⅲ代謝關(guān)鍵酶(如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞色素P450酶等)基因的高表達(dá)，從而在短期內(nèi)快速提高羅漢果苷Ⅲ的含量。

本發(fā)明通過在羅漢果組培苗移栽后，于授粉后5-10天采用含有茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)液噴灑羅漢果表面，在短期內(nèi)進(jìn)一步刺激并誘導(dǎo)羅漢果中羅漢果苷ⅡE代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而促進(jìn)促進(jìn)羅漢果苷ⅡE的生物合成。

本發(fā)明操作簡便，成本低，對(duì)環(huán)境友好，適于規(guī)模化生產(chǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和推廣價(jià)值。

本發(fā)明在羅漢果組培苗移栽時(shí)采用了育苗杯，將幼苗種植于育苗杯的中部，并使葉片位于育苗杯外，能在移栽初期防止土傳病害的發(fā)生，為幼苗提供豐富的營養(yǎng)和適宜的生長環(huán)境，能提高幼苗的成活率，進(jìn)而能提高羅漢果的產(chǎn)量和羅漢果苷Ⅳ的提取量，也能對(duì)羅漢果幼苗的生長起導(dǎo)向作用，防止其長歪。在澆水過多或雨量較大時(shí)，育苗杯內(nèi)過多的水經(jīng)填料層和紗布過濾后從出水孔出來，能防止育苗杯內(nèi)積水，這樣也不會(huì)有雜質(zhì)堵塞出水孔。當(dāng)土壤干旱時(shí)，可以只往育苗杯內(nèi)澆水，無需對(duì)育苗杯外的土壤施水，節(jié)約了水資源。因積液板為漏斗形，這樣方便澆水，使?jié)驳乃寄芰髦廖挥谥胁康挠酌缟?。育苗杯可反?fù)使用，節(jié)約了成本。

本發(fā)明在誘導(dǎo)處理培養(yǎng)之后移栽之前，將羅漢果組培苗根部劃傷后滴涂含有蜂毒和納米氧化鋅的誘導(dǎo)劑，并用蘆薈膠涂覆后置于中波紫外線下輻射處理，目的是劃傷有助于加速蜂毒進(jìn)入羅漢果組培苗，促使蜂毒進(jìn)行化學(xué)刺激，誘導(dǎo)羅漢果苷Ⅲ的生物合成功能基因表達(dá)，打破羅漢果苷Ⅲ合成過程中的限速步驟，在短時(shí)間內(nèi)加速羅漢果苷Ⅲ的合成與積累，硝酸鈣溶液可以促進(jìn)蜂毒快速分散于羅漢果內(nèi)部，同時(shí)還起抑菌作用，蘆薈膠起固封蜂毒促使其進(jìn)入羅漢果組培苗根部，并起保濕抑菌促進(jìn)羅漢果組織細(xì)胞再生，提高損傷處細(xì)胞活力，提高存活率的作用，另中波紫外線穿透性強(qiáng)，能刺激劃傷后的羅漢果組培苗為加強(qiáng)自身防御而加快該階段的生物合成，從而進(jìn)一步促進(jìn)漢果苷Ⅲ的生物合成功能基因表達(dá)；

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的育苗杯的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

需要說明的是，下述實(shí)施方案中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得；在本發(fā)明的描述中，術(shù)語“橫向”、“縱向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”、“內(nèi)”、“外”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡化描述，并不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

一種提高羅漢果苷Ⅲ含量的方法，將羅漢果組培苗接種于含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行組織培養(yǎng)28天，對(duì)羅漢果組培苗施加茉莉酸甲酯，誘導(dǎo)羅漢果苷Ⅳ代謝關(guān)鍵酶(如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞色素P450酶等)基因的高表達(dá)，從而在短期內(nèi)快速提高羅漢果苷Ⅲ的含量，其中，茉莉酸甲酯的濃度為400μmol/L。之后采用常規(guī)的羅漢果栽培方法進(jìn)行栽培至結(jié)羅漢果。在本實(shí)施例中，固體培養(yǎng)基中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為：MS、1.5mg/L6-BA、0.3mg/L IBA、3.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭，在固體培養(yǎng)基凝固前加入了茉莉酸甲酯，使其濃度為400μmol/L。

實(shí)施例2

一種提高羅漢果苷Ⅲ含量的方法，

步驟一組織培養(yǎng)，將羅漢果組培苗接種于含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行組織培養(yǎng)35天，培養(yǎng)條件為相對(duì)濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux、光照時(shí)間8h/d、溫度23±2℃，其中，所述固體培養(yǎng)基包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MS、1.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IBA、3.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖、1.0g/L活性炭)和220μmol/L的茉莉酸甲酯；固體培養(yǎng)基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液中，配制成50mmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到凝固前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯濃度為220μmol/L，滅菌并冷卻至26℃，能防止茉莉酸甲酯的乙醇母液攜帶細(xì)菌，影響組培苗的生長。

步驟一移栽培養(yǎng)，將經(jīng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的羅漢果組培苗移栽，待授粉后40天，每天早、中、晚在羅漢果表面噴灑茉莉酸甲酯溶液至表面滴水，連續(xù)噴灑10天，所述茉莉酸甲酯溶液中含有濃度為220μmol/L的茉莉酸甲酯。所述茉莉酸甲酯溶液的制備方法為：將茉莉酸甲酯用2％的乙醇水溶液溶解后加水定容至茉莉酸甲酯的濃度為220μmol/L。

實(shí)施例3

在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，組織培養(yǎng)之后移栽之前，將羅漢果組培苗距離根部1cm以上部位劃傷1-2個(gè)0.8mm深的傷口，并將含有0.03mg/L蜂毒和0.2mg/L硝酸鈣的誘導(dǎo)劑(溶劑為水)滴涂于傷口處，每株羅漢果組培苗滴涂0.05mL，然后將蘆薈膠涂覆于傷口處形成厚度為1-1.5mm厚度的膜，再將羅漢果組培苗置于波長為280-315nm的中波紫外線下輻射處理0.5h后用于移栽。

實(shí)施例4

在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，羅漢果組培苗移栽至田間的具體步驟為：

如圖1所示，在田間挖深度為12cm的種植坑，并在種植坑的底部鋪設(shè)聚乙烯醇薄膜，防止殺菌后的育苗基質(zhì)與種植坑底部的土壤接觸，防止土傳病害的發(fā)生，聚乙烯醇薄膜可降解，不會(huì)污染環(huán)境，也不會(huì)阻礙幼苗的根部向下生長，之后在種植坑內(nèi)插入育苗杯，再在育苗杯內(nèi)倒入殺菌后的育苗基質(zhì)150至與種植坑外的土層高度相同，為幼苗提供無菌的生長環(huán)境，育苗基質(zhì)為栽培羅漢果時(shí)用到的任何一種基質(zhì)，只是對(duì)其進(jìn)行了殺菌，將羅漢果組培苗種植于育苗基質(zhì)中，并使羅漢果組培苗的葉片位于育苗杯外后，在育苗基質(zhì)上從下到上依次鋪設(shè)1.5cm厚的保水劑層130和2cm厚的填料層140，所述填料層包括質(zhì)量比為1:5:8～10遠(yuǎn)紅外陶瓷粉、紅糖和草炭，再在填料層的表面鋪設(shè)一層紗布，使羅漢果組培苗穿過紗布，之后在紗布上鋪設(shè)粗石塊，移栽10～20d后，取出粗石塊和紗布，抽出育苗杯，將填料層填入抽出育苗杯后形成的環(huán)溝中，若填料層將環(huán)溝填滿后還有多余，則將多余的填料層埋入育苗基質(zhì)中或進(jìn)行回收，若填料層未能將環(huán)溝填滿，則用育苗基質(zhì)填充環(huán)溝至與種植坑外的土層高度相同。即若環(huán)溝較淺，則用填料層即可填滿，則無需再填充育苗基質(zhì)，若填料層填滿環(huán)溝后還有剩余，則將剩余部分埋入育苗基質(zhì)中或回收后再利用，若環(huán)溝較深，則先將填料層填充至環(huán)溝中，再用育苗基質(zhì)填充環(huán)溝至與種植坑外的土層高度相同；填料層具有提高羅漢果組培苗移栽后存活率的作用，和本實(shí)施例的移栽方法結(jié)合能大大提高羅漢果組培苗的存活率。其中，

所述育苗杯100包括：

杯體101，其為圓筒體形，所述杯體的側(cè)壁上沿其圓周方向間隔設(shè)置有多個(gè)出水孔102，所述出水孔位于紗布120的上方，粗石塊與所述出水孔不接觸；

積液板103，其為直徑上大下小的圓臺(tái)形，所述積液板的內(nèi)部中空，且頂部和底部均敞開，所述積液板的頂部的直徑與所述杯體的內(nèi)徑相等，所述積液板的頂部與所述杯體的內(nèi)側(cè)壁固定連接，所述積液板與所述杯體一體成型，且位于所述出水孔的上方。

本方案提供的提高羅漢果苷Ⅲ含量的方法中，在羅漢果組培苗移栽時(shí)采用了育苗杯，將幼苗種植于育苗杯的中部，并使葉片位于育苗杯外，能在移栽初期防止土傳病害的發(fā)生，為幼苗提供豐富的營養(yǎng)和適宜的生長環(huán)境，能提高幼苗的存活率，進(jìn)而能提高羅漢果的產(chǎn)量和羅漢果苷Ⅲ的提取量，也能對(duì)羅漢果幼苗的生長起導(dǎo)向作用，防止其長歪。在澆水過多或雨量較大時(shí)，育苗杯內(nèi)過多的水經(jīng)填料層和紗布過濾后從出水孔出來，能防止育苗杯內(nèi)積水，這樣也不會(huì)有雜質(zhì)堵塞出水孔。當(dāng)土壤干旱時(shí)，可以只往育苗杯內(nèi)澆水，無需對(duì)育苗杯外的土壤施水，節(jié)約了水資源。因積液板為漏斗形，這樣方便澆水，使?jié)驳乃寄芰髦廖挥谥胁康挠酌缟?。育苗杯可反?fù)使用，節(jié)約了成本。

實(shí)施例5

在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上每次早、中噴灑茉莉酸甲酯溶液后，對(duì)羅漢果植株進(jìn)行全遮光30min，30min過后羅漢果植株按正常光照處理，不再進(jìn)行全遮光。

對(duì)照組1：采用普通的栽培方法種植羅漢果，整個(gè)栽培期間不施加茉莉酸甲酯。

每一個(gè)實(shí)施方案得到的30棵羅漢果果樹上任選其中10棵中得到的羅漢果果實(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)，采用HPLC法進(jìn)行羅漢果苷Ⅲ含量檢測(cè)。

采用實(shí)施例1～5的方法培育羅漢果，對(duì)照組1采用普通的栽培方法種植羅漢果，并檢測(cè)通過實(shí)施例1-5和對(duì)照組1種植得到的羅漢果中的羅漢果苷Ⅲ含量，結(jié)果見表1。

表1

存活率實(shí)驗(yàn)：用實(shí)施例2和實(shí)施例4的方法分別培養(yǎng)50株羅漢果組培苗，之后移栽，在一個(gè)月后檢查存活率，其中采用實(shí)施例2培育的50株羅漢果組培苗的存活率為78％，采用實(shí)施例4培育的50株羅漢果組培苗的存活率為98％，說明使用實(shí)施例4的移栽方法能顯著提高羅漢果組培苗的成活率從而間接提高羅漢果苷Ⅲ的提取量。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。