一種小分子多肽lz1的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小分子多肽LZl在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
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[0002]惡性腫瘤目前已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病，在我國惡性腫瘤疾病發(fā)病率及死亡率均呈現(xiàn)逐年增多的趨勢(shì)，《2014中國腫瘤登記年報(bào)》顯示在2010年中國新增惡性腫瘤病例309萬，死亡病例196萬。惡性腫瘤疾病不僅嚴(yán)重威脅著人類的健康，同時(shí)對(duì)惡性腫瘤的治療需要投入大量的人力與資金，嚴(yán)重影響著經(jīng)濟(jì)建設(shè)與社會(huì)的發(fā)展。因此，尋找并開發(fā)安全有效的抗腫瘤藥物或方法是大家共同關(guān)心的問題，也是目前科學(xué)界最重要的研宄熱點(diǎn)。
[0003]惡性腫瘤的藥物治療是腫瘤綜合治療中的重要組成部分，其中，腫瘤細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物是臨床上使用最多也是目前抗腫瘤藥物開發(fā)的重要切入點(diǎn)。近幾年來科學(xué)家在抗腫瘤藥物開發(fā)方面取得了一系列重要的研宄成果，臨床上新型抗腫瘤藥物的應(yīng)用也有效的延長了癌癥病人的生存時(shí)間。但是關(guān)于抗腫瘤藥物使用過程中出現(xiàn)的一系列問題也逐漸引起了人們的重視，如:抗腫瘤藥物選擇性差，對(duì)正常細(xì)胞毒副作用大，抗腫瘤藥物使用過程中容易產(chǎn)生耐藥性。小分子天然多肽廣泛存在于自然界，由于其存在組成簡單，分子量小，合成方便的特點(diǎn)表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。但小分子多肽抗癌藥物在臨床使用過程中也存在部分問題，如:抗癌機(jī)制不明確，體內(nèi)代謝快，穩(wěn)定性差，存在免疫原性，對(duì)正常細(xì)胞存在細(xì)胞毒作用。針對(duì)天然多肽的這些缺點(diǎn)，能在保留天然多肽抗癌作用的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行改造，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，減弱天然多肽對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用，這是肽類藥物研宄的重要方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種小分子多肽LZl在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的LZl為人工設(shè)計(jì)合成的直鏈抗菌肽，包含15個(gè)氨基酸殘基，分子量為2228.77Da，等電點(diǎn)為12.05。LZl抗菌肽的全序列如下:纈氨酸-賴氨酸-精氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-纈氨酸-NH2。
[0006]本發(fā)明的有益效果在于:LZ1多肽為人工合成，具有分子量小，人工合成方便；多肽LZl選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞沒有作用，且該多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的機(jī)理是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；該多肽對(duì)體內(nèi)實(shí)體瘤的生長具有明顯的抑制作用，能夠在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【附圖說明】
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[0007]圖1為不同濃度的小分子多肽LZl對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7、乳腺癌細(xì)胞HCC1806、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和宮頸癌細(xì)胞Hela的作用不意圖。
[0008]圖2為不同濃度的小分子多肽LZl對(duì)人正常對(duì)照細(xì)胞胚腎細(xì)胞HEK-293的作用示意圖。
[0009]圖3為小分子多肽LZl對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7作用后通過流式細(xì)胞術(shù)手段檢測的該細(xì)胞的凋亡情況示意圖。
[0010]圖4為小分子多肽LZl對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1806誘導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)實(shí)體瘤生長的抑制作用，分別用生理鹽水和順鉑做對(duì)照。其中，圖4A為小分子多肽LZl及對(duì)照在給藥不同天數(shù)后裸鼠實(shí)體瘤的體積變化情況示意圖，圖4B為小分子多肽LZl及對(duì)照給藥28天后裸鼠實(shí)體瘤的大小對(duì)比圖，圖4C為小分子多肽LZl及對(duì)照給藥28天后裸鼠實(shí)體瘤的重量對(duì)比圖。** 表示 p〈0.0lo
[0011]圖5為小分子多肽LZl對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7誘導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)實(shí)體瘤生長的抑制作用，分別用生理鹽水和順鉑做對(duì)照。其中，圖5A為小分子多肽LZl及對(duì)照在給藥不同天數(shù)后裸鼠實(shí)體瘤的體積變化情況示意圖，圖5B為小分子多肽LZl及對(duì)照給藥28天后裸鼠實(shí)體瘤的大小對(duì)比圖，圖5C為小分子多肽LZl及對(duì)照給藥28天后裸鼠實(shí)體瘤的重量對(duì)比圖。** 表示 p〈0.0lo
【具體實(shí)施方式】
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[0012]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，實(shí)施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。
[0013]實(shí)施例1:小分子多肽LZl的制備
[0014]1、抗菌肽LZl的化學(xué)合成方法:根據(jù)我們?cè)O(shè)計(jì)的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433Α, Applied B1systems)合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。
[0015]I1、分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)。
[0016]II1、純化的金抗菌肽LZl用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0017]抗菌肽LZl —共包含15個(gè)氨基酸殘基，分子量為2228.77Da，等電點(diǎn)為12.05。LZl抗菌肽的全序列如下:纈氨酸-賴氨酸-精氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-纈氨酸-NH2 (C-端酰胺化)。
[0018]實(shí)施例2:小分子多肽LZl對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7、乳腺癌細(xì)胞HCC1806、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和宮頸癌細(xì)胞Hela的作用實(shí)驗(yàn)
[0019]分別收集處于對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞Huh-7、乳腺癌細(xì)胞HCC1806、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和宮頸癌細(xì)胞Hela制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2X 16個(gè)/ml，每種細(xì)胞按照200 μ I/孔的體積種入96孔板，細(xì)胞在37°C，5%的CO2的條件下過夜貼壁。第二天針對(duì)每種細(xì)胞分別加入終濃度為50?300 μ g/ml的小分子多肽LZ1，其中用同等體積的生理鹽水作為對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入20 μ 15mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入200 μ I的二甲基亞砜，將96孔板置搖床上低速搖動(dòng)1min充分溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶物。用酶標(biāo)儀檢測0D490nm處96孔板的吸光度值，注意設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，結(jié)果如圖1所示:小分子多肽LZl在50?300 μ g/ml濃度范圍內(nèi)以梯度依賴的形式對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7、乳腺癌細(xì)胞HCC1806、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和宮頸癌細(xì)胞Hela具有明顯的抑制生長的作用，其中該多肽對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7和乳腺癌細(xì)胞HCC1806的抑制作用最強(qiáng)。
[0020]實(shí)施例3:小分子多肽LZl對(duì)人正常細(xì)胞胚腎細(xì)胞HEK-293的作用實(shí)驗(yàn)
[0021]收集處于對(duì)數(shù)生長期的胚腎細(xì)胞HEK-293制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2X 16個(gè)/ml，按照200 μ I/孔的體積種入96孔板，細(xì)胞在37°C，5%的CO2的條件下過夜貼壁。第二天加入終濃度為50?300 μ g/ml的小分子多肽LZ1，其中用同等體積的生理鹽水作為對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入20 μ I 5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入200 μ I的二甲基亞砜，將96孔板置搖床上低速搖動(dòng)1min充分溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶物。用酶標(biāo)儀檢測0D490nm處96孔板的吸光度值，注意設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，結(jié)果如圖2所示:小分子多肽LZl在50?300 μ g/ml濃度范圍內(nèi)對(duì)胚腎細(xì)胞HEK-293沒有明顯的生長抑制作用。
[0022]實(shí)施例4:小分子多肽LZl對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7凋亡的影響
[0023]收集處于對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞Huh-7制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2 X 16個(gè)/ml，按照2ml/孔的體積種入6孔板，細(xì)胞在37°C，5%的CO2的條件下過夜貼壁。第二天加入終濃度為12.5?200 μ g/ml的小分子多肽LZl，其中用同等體積的生理鹽水作為對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，先將細(xì)胞用胰酶消化并制成細(xì)胞懸液，再用碘化丙啶(PI)/Annexin V凋亡檢測試劑盒染色后通過流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞Huh-7的凋亡情況。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞凋亡早期細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，Annexin V是一種與磷脂酰絲氨酸具有高親和力的蛋白，因此可通過檢測細(xì)胞外部暴露的磷脂酰絲氨酸來判定細(xì)胞早期的凋亡。PI是一種核酸染料，不能穿過正常的細(xì)胞膜，細(xì)胞早期凋亡過程中PI染色為陰性。結(jié)果如圖3所示:在12.5?200 μ g/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著多肽濃度的增加，肝癌細(xì)胞Huh-7PI染色陽性比例變化不大，但是Annexin V陽性染色比率逐漸增加，即小分子多肽LZl以梯度依賴的形式誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Huh-7凋亡。
[0024]實(shí)施例5:小分子多肽LZl對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1806誘導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)實(shí)體瘤生長的影響
[0025]取對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞HCC1806，在無菌條件下，按IX 17/只/0.1ml的量接種于BALB/cA裸鼠后肢右側(cè)腋窩皮下。待腫瘤塊生長8天后測量瘤徑，根據(jù)瘤體大小隨機(jī)分組，每組6只，分組日為O天，次日開始給藥。
[0026]腫瘤體積(tumorvolume, TV)，計(jì)算公式為:TV = l/2XaXb2
[0027]其中a、b分別表不長寬。
[0028]給藥分組如下:生理鹽水對(duì)照組:同等體積的生理鹽水；順鉑對(duì)照組:2mg/kg ;小分子多肽LZl給藥組:4mg/kg。
[0029]給藥方式如下:每兩天給藥一次，通過鼠尾靜脈注射的方式給藥，連續(xù)給藥28天。
[0030]給藥結(jié)束后處死小鼠，剝離出實(shí)體瘤，測量瘤體重量。
[0031]結(jié)果如圖4所示:小分子多肽LZl能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞HCC1806誘導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)實(shí)體瘤的生長，即小分子多肽LZl在體內(nèi)能發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。
[0032]實(shí)施例6:小分子多肽LZl對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7誘導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)實(shí)體瘤生長的影響
[0033]取對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞Huh-7，在無菌條件下，按IX 17/只/0.1ml的量接種于BALB/cA裸鼠后肢右側(cè)腋窩皮下。待腫瘤塊生長8天后測量瘤徑，根據(jù)瘤體大小隨機(jī)分組，每組6只，分組日為O天，次日開始給藥。
[0034]腫瘤體積(tumorvolume, TV)，計(jì)算公式為:TV = l/2XaXb2
[0035]其中a、b分別表示長寬。
[0036]給藥分組如下:生理鹽水對(duì)照組:靜脈注射同等體積的生理鹽水；順鉑對(duì)照組:2mg/kg ;小分子多肽LZl給藥組:4mg/kg。
[0037]給藥方式如下:每兩天給藥一次，通過鼠尾靜脈注射的方式給藥，連續(xù)給藥28天。
[0038]給藥結(jié)束后處死小鼠，剝離出實(shí)體瘤，測量瘤體重量。
[0039]結(jié)果如圖5所示:小分子多肽LZl能明顯抑制肝癌細(xì)胞Huh-7誘導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)實(shí)體瘤的生長，即小分子多肽LZl在體內(nèi)能發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.分子量為2228.77Da、等電點(diǎn)為12.05、包含15個(gè)氨基酸殘基的小分子多肽LZl在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小分子多肽LZ1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的LZ1為人工設(shè)計(jì)合成的活性多肽，包含15個(gè)氨基酸殘基，分子量為2228.77Da，等電點(diǎn)為12.05。本發(fā)明的LZ1在體外通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形式對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，且對(duì)正常細(xì)胞無毒性，在體內(nèi)同樣表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，能夠在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。該多肽序列短，人工合成方便，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K38-10, A61P35-00
【公開號(hào)】CN104623628
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510015916
【發(fā)明人】賴仞, 張治業(yè), 韓亞君
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年1月13日