技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗體藥物領(lǐng)域，具體涉及全人源抗VEGFR2單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血管新生是指已存的血管(毛細(xì)血管和小靜脈)通過(guò)出芽或分裂的方式產(chǎn)生新的血管，其在許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如胚胎發(fā)生、傷口愈合、炎癥反應(yīng)和月經(jīng)等。同時(shí)，血管新生在一些病理過(guò)程中同樣扮演重要角色，如失控的血管新生是腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移的主要原因。血管新生也和糖尿病視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及銀屑病等其他疾病密切相關(guān)。所以抑制血管新生成為治療這些疾病的可行方法。在血管新生過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)起著重要作用，能強(qiáng)烈地刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。VEGF結(jié)合的受體包括VEGFR1(也被稱(chēng)作Flt-1)和VEGFR2(也被稱(chēng)作Flk-1)。VEGFR1和VEGFR2屬于III型受體酪氨酸激酶家族，胞外區(qū)由7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成，含配體結(jié)合域和受體二聚化結(jié)構(gòu)域，中間包含一個(gè)細(xì)胞跨膜區(qū)，胞內(nèi)含有一個(gè)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。VEGFR2介導(dǎo)VEGF的多種效應(yīng)，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管增生和滲透，而VEGFR1似乎并沒(méi)有直接參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管增生。VEGF二聚體結(jié)合VEGFR2后誘發(fā)受體二聚化，胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基磷酸化，從而激活下游信號(hào)通路，包括激活磷脂酶C，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度等，引發(fā)包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞遷移、基因表達(dá)等，最終引起血管增生。因此，VEGF及VEGFR2是很好的治療靶點(diǎn)，抑制該信號(hào)通路理論上能夠抑制血管新生，從而治療血管新生相關(guān)的疾病。美國(guó)FDA于2004年批準(zhǔn)靶向VEGF的抗體貝伐單抗(Avastin)，該藥在臨床與化療藥物聯(lián)合治療結(jié)腸癌時(shí)可明顯延長(zhǎng)病人生命，但因同時(shí)抑制了VEGF的正常生理功能，病人使用后出現(xiàn)高血壓、出血、血栓形成等副反應(yīng)。鑒于VEGFR2在VEGF信號(hào)通路中的重要作用，抑制VEGFR2也是一種抑制血管新生的策略。相對(duì)于VEGF而言，靶向VEGFR2的藥物針對(duì)性更強(qiáng)，安全性更好。FDA于2014年批準(zhǔn)上市的Ramucirumab(IMC-1121B)就是靶向VEGFR2的抗體藥物。抗體是由抗原刺激機(jī)體后所形成的一類(lèi)具有與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白(immunoglobubin，Ig)。已知有IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等5類(lèi)免疫球蛋白，普遍存在于生物體內(nèi)的血液、體液、外分泌液及某些細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞)的細(xì)胞膜上。作為生物藥物的重要組成部分，抗體已經(jīng)成為類(lèi)別最大且發(fā)展最快的生物藥物。而單克隆抗體更是由于其針對(duì)靶點(diǎn)的高度特異性而在臨床上成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病。在抗體藥物發(fā)展初期，鼠源單克隆抗體為人類(lèi)疾病的研究起到了重大的推動(dòng)作用，但由于其是鼠源的，在病人中引發(fā)了嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，嚴(yán)重阻礙了抗體藥物的發(fā)展。隨著抗體人源化技術(shù)的發(fā)展，抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的瓶頸被打破。目前臨床上使用的治療性單克隆抗體包括人鼠嵌合抗體、人源化抗體及全人源抗體，其中全人源單克隆抗體由于高度的親和力及低免疫原性備受青睞。全人源的單克隆抗體可通過(guò)噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、抗體人源化小鼠技術(shù)等方法獲得。其中，抗體的噬菌體展示技術(shù)(PDT)是將抗體V區(qū)片段融合噬菌體表面蛋白(g3)后展示到噬菌體表面，然后針對(duì)不同抗原對(duì)噬菌體庫(kù)進(jìn)行篩選，最終得到特異的抗體。該技術(shù)模擬了機(jī)體的免疫篩選，從人工建立的噬菌體文庫(kù)中篩選得到抗體?？贵w噬菌體展示技術(shù)除了能篩選針對(duì)不同抗原的特異抗體外，還能對(duì)抗體進(jìn)一步突變高變區(qū)而提高其抗原親和力。盡管已經(jīng)通過(guò)上述技術(shù)獲得了一些在治療上有很大優(yōu)勢(shì)的人源化單克隆抗體，但是篩選出具有所需性質(zhì)和功能的人源化單克隆抗體絕非易事，現(xiàn)實(shí)中依然存在對(duì)這類(lèi)人源化單克隆抗體的迫切需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供全人源抗人VEGFR2單克隆抗體，編碼該單克隆抗體的多核苷酸的載體、宿主細(xì)胞及其用途。由本發(fā)明涉及的抗體基因可變區(qū)的序列，可構(gòu)建全長(zhǎng)抗體分子作為藥物用于臨床上由于新生血管生成所導(dǎo)致的適應(yīng)癥的使用。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選針對(duì)VEGFR2的人源化抗體，并利用基因工程方法得到完整抗體，從而提供用于治療血管新生相關(guān)疾病的藥物。具體的抗體的制造及相關(guān)檢測(cè)方法如下：通過(guò)提取不同人的外周血淋巴細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增，并酶切連接到噬菌體展示載體pCANTAB5E，克隆轉(zhuǎn)化到可用于噬菌體展示的TG1細(xì)胞，構(gòu)建出108的人重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組合的單鏈抗體庫(kù)；通過(guò)噬菌體展示技術(shù)將單鏈抗體展示在噬菌體表面，再以VEGFR2抗原進(jìn)行淘選、富集，篩選大量和VEGFR2抗原結(jié)合的單鏈抗體基因；然后將單個(gè)的單鏈抗體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并使用VEGFR2進(jìn)行ELISA篩選，篩選出和VEGFR2結(jié)合的全新人源抗體重鏈可變區(qū)；然后構(gòu)建轉(zhuǎn)換成全長(zhǎng)IgG抗體，使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)和少量親和純化(ProteinA)制備少量純化抗體，以細(xì)胞毒功能測(cè)試(ADCC、CDC和凋亡實(shí)驗(yàn))進(jìn)行篩選鑒定。在經(jīng)此篩選出來(lái)的一組有良好細(xì)胞毒功效的抗體分子，再對(duì)這些抗體可變區(qū)特別是CDRs區(qū)序列檢索，確定該組具備VEGFR2特異性的細(xì)胞毒功效的抗體為首次發(fā)現(xiàn)的新分子。本發(fā)明所述方法構(gòu)建了高容量高多樣性抗體庫(kù)，從大容量抗體庫(kù)中篩選出和VEGFR2結(jié)合且能阻斷其與配體VEGF結(jié)合的抗體，且篩選出的抗體具有細(xì)胞活性。本發(fā)明所述抗人VEGFR2單克隆抗體具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)：(Ⅰ)所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo:1-6任一項(xiàng)所示；或者經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，與(Ⅰ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；和/或(Ⅱ)所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，如SEQIDNo:7-12任一項(xiàng)所示；者經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，與(Ⅱ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述多個(gè)為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)或32個(gè)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述抗VEGFR2單克隆抗體具有：(ⅰ)氨基酸序列為SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQIDNO:7的輕鏈可變區(qū)；或(ii)氨基酸序列為SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQIDNO:8的輕鏈可變區(qū)；或(ⅲ)氨基酸序列為SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQIDNO:9的輕鏈可變區(qū)；或(ⅳ)氨基酸序列為SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQIDNO:10的輕鏈可變區(qū)；或(Ⅴ)氨基酸序列為SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQIDNO:11的輕鏈可變區(qū)；或(VI)氨基酸序列為SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQIDNO:12的輕鏈可變區(qū)。進(jìn)一步的，優(yōu)選的，所述抗VEGFR2單克隆抗體具有如下任一組重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)：1)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示；2)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示；3)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示；4)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示；5)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示；6)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示。本發(fā)明所述的單克隆抗體不僅包括可變區(qū)，還包括恒定區(qū)。優(yōu)選的，所述的恒定區(qū)為人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一種。更優(yōu)選的，所述恒定區(qū)為人IgG1。本發(fā)明所述的單克隆抗體是全人源的。本發(fā)明還提供了編碼所述抗CD47單克隆抗體的核苷酸。本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，包含編碼所述單克隆抗體的核苷酸。本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞經(jīng)由本發(fā)明所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染而來(lái)，為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種結(jié)合物，包含與化學(xué)標(biāo)記或生物標(biāo)記共價(jià)連接的所述抗人VEGFR2單克隆抗體。其中，所述化學(xué)標(biāo)記包括但不限于同位素、免疫毒素、化學(xué)藥物。優(yōu)選的，所述免疫毒素為黃曲霉毒素、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴蓮根毒素、PAP、造草素、白樹(shù)毒素或絲瓜毒素。所述生物標(biāo)記包括但不限于生物素、親和素或酶標(biāo)記。優(yōu)選的，所述酶標(biāo)記為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。本發(fā)明還提供了一種偶聯(lián)物，其由所述抗人VEGFR2單克隆抗體和/或所述結(jié)合物與固體介質(zhì)或半固體介質(zhì)偶聯(lián)形成。優(yōu)選的，所述固體介質(zhì)或非固體介質(zhì)選自膠體金、聚苯乙烯平板或珠粒。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括所述抗人VEGFR2單克隆抗體和/或所述結(jié)合物和/或所述偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括所述抗人VEGFR2單克隆抗體和/或所述結(jié)合物和/或所述偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了所述抗人VEGFR2單克隆抗體和/或所述結(jié)合物和/或所述偶聯(lián)物和/或所述藥物組合物在制備治療疾病的藥物中的應(yīng)用。其中，所述疾病為血管新生相關(guān)的疾病，包括但不局限于非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌、HER2陰性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性胃腺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌。本發(fā)明公開(kāi)了利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選并利用基因工程方法制備的全人源抗人VEGFR2單克隆抗體，并公開(kāi)了包含編碼該單克隆抗體的多核苷酸的載體、宿主細(xì)胞及用途。本發(fā)明所述單克隆抗體通過(guò)結(jié)合VEGFR2，阻斷VEGF與VEGR2結(jié)合，不再誘發(fā)受體二聚化，以及后續(xù)的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基磷酸化和激活下游信號(hào)通路，包括激活磷脂酶C，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度等，引發(fā)包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞遷移、基因表達(dá)等，最終阻斷由于VEGF結(jié)合VEGFR2并誘導(dǎo)其二聚化而引起血管增生。本發(fā)明所述單克隆抗體可用于治療由腫瘤新生血管引起的疾病，所述疾病包括但不局限于下列腫瘤：非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌、HER2陰性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性胃腺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1為PCAb抗體SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖，其中，泳道M：蛋白質(zhì)標(biāo)記PageRulerPrestainedProteinladder(廠家：Thermo，貨號(hào)：26616)；泳道1為還原PCAb；泳道2為非還原PCAb；圖2為噬菌粒載體pCANTAB5E-SF載體圖譜；圖3為人PBMC總RNA電泳檢測(cè)圖，其中，泳道M：DNA標(biāo)記DL2000；泳道1：總RNA；圖4為人VH、VLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖，其中，泳道M：DNA標(biāo)記DL2000；泳道1～4：人VHPCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道5～8：人VLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖5為6個(gè)優(yōu)選抗體300ml瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)純化產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)圖，其中，泳道M：蛋白質(zhì)標(biāo)記PageRulerPrestainedProteinladder(廠家：Thermo，貨號(hào)：26616)；泳道1～6依次為還原043HAb-1～043HAb-6；泳道7～12依次為非還原043HAb-1～043HAb-6；圖6為優(yōu)選抗體抗原表位競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果；圖7為優(yōu)選抗體細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果，其中，7-A為優(yōu)選抗體043HAb-1細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果；7-B為優(yōu)選抗體043HAb-2細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果；7-C為優(yōu)選抗體043HAb-3細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果；7-D為優(yōu)選抗體043HAb-4細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果；7-E為優(yōu)選抗體043HAb-5細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果；7-F為優(yōu)選抗體043HAb-6細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了全人源抗VEGFR2單克隆抗體及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所使用的原料及試劑如無(wú)特別說(shuō)明，均可輕易從市場(chǎng)獲取。實(shí)施例1：陽(yáng)性抗體(PCAb)基因合成、表達(dá)載體構(gòu)建及抗體的制備1、參考專(zhuān)利CN1345334A，選擇其生物學(xué)活性好的一個(gè)抗體作為陽(yáng)性抗體(PCAb)，PCAb氨基酸序列如下：PCAbH，如SEQIDNO:13所示：QVKLQQSGAELVGSGASVKLSCTTSGFNIKDFYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDSDYAPKFQGKATMTADSSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNAYYGDYEGYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPCAbL，如SEQIDNO:14所示：DIELTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC2、將上述抗體序列所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行密碼子人工優(yōu)化，并委托金斯瑞生物科技有限公司合成優(yōu)化后的DNA，克隆到pUC57-Simple(金斯瑞生物科技有限公司提供)載體中，獲得pUC57-Simple-PCAbH和pUC57-Simple-PCAbL質(zhì)粒。3、將質(zhì)粒pUC57simple-PCAbH、pUC57simple-PCAbL進(jìn)行XbaI和BamHI酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收得到基因片段PCAbH、PCAbL，分別與pGS003載體進(jìn)行連接，重組構(gòu)建獲得pGS003-PCAbH和pGS003-PCAbL表達(dá)載體。4、將上面構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGS003-PCAbH和pGS003-PCAbL轉(zhuǎn)染FreeStyleTM293-F細(xì)胞7天后，將培養(yǎng)液進(jìn)行高速離心、微孔濾膜抽真空過(guò)濾，根據(jù)廠家提供的操作方法采用ProteinA柱(蛋白純化液相色譜系統(tǒng)/AKTAPurifier10，GE)進(jìn)行純化，得到純化后的抗體PCAb，見(jiàn)圖1泳道2。取純化后抗體，采用還原條件的SDS-PAGE分析純化產(chǎn)物，鑒定了抗體的性質(zhì)和純度，還原條件下重鏈為50KD，輕鏈為25KD，結(jié)果如圖1泳道1所示。實(shí)施例2：天然人源單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建1、噬菌粒載體的構(gòu)建選擇pCANTAB5E作為噬菌體展示載體，根據(jù)克隆及噬菌體展示需要進(jìn)行載體改造，改造結(jié)果如圖2。將SfiI-NcoI-XhoI+Linker+NheI-NotI序列(SEDIDNO:15)進(jìn)行基因合成，然后用SfiI和NotI進(jìn)行酶切，并與pCANTAB5E載體進(jìn)行連接反應(yīng)重組構(gòu)建獲得改造后載體pCANTAB5E-SF。2、PBMC分離及mRNA抽提無(wú)菌抽取健康志愿者新鮮外周血，使用淋巴細(xì)胞分離液(GE)分離出其中的淋巴細(xì)胞，用Invitrogen公司的reagent(15596-026)提取100×106個(gè)細(xì)胞的總RNA，結(jié)果如圖3所示。3、抗體庫(kù)引物設(shè)計(jì)、合成及RT-PCR根據(jù)Kabat、V-base2及IMGT網(wǎng)站公布的抗體基因序列信息，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增人抗體重鏈和輕鏈的引物以及正確的酶切位點(diǎn)，金斯瑞生物科技有限公司合成引物，PAGE純化，引物序列見(jiàn)表1和表2：表1、擴(kuò)增人重鏈可變區(qū)的引物注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T表2、擴(kuò)增人輕鏈可變區(qū)的引物引物名稱(chēng)序列(5’→3’)h-k_F1ggtggcggtggtagtgctagcGAWAYWGTGATGACMCAGYMTCh-k_F2ggtggcggtggtagtgctagcGAAGTTATGTTGATGCAGTCTCTh-k_F3ggtggcggtggtagtgctagcGAWGTTGTGMTGACAYRGTCh-k_F4ggtggcggtggtagtgctagcRHCATCYRGATGACCCAGTCTSCAh-k_F5ggtggcggtggtagtgctagcRACATCCAGATGAATTCAGTCTCCh-k_F6ggtggcggtggtagtgctagcGAMATTSTGYTGACHCAGWCTCCAh-k_F7ggtggcggtggtagtgctagcGABAYTGTGATSRCCCAGACTCCAh-k_F8ggtggcggtggtagtgctagcRMCATCCAGDTGAYBCAGYCTCCh-k_F9ggtggcggtggtagtgctagcGATGCTGYGAWGACCCAACCTCCAh-k_R1ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTGATHTCCASYTTGGTCCCHh-k_R2ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTh-λ_F1ggtggcggtggtagtgctagcCAGYCTGYKCTGACYCAGVh-λ_F2ggtggcggtggtagtgctagcCAGGCAGGGCWGACTCAGCMMCh-λ_F3ggtggcggtggtagtgctagcCAGCYTGTGCTGACTCARTCRYCCh-λ_F4ggtggcggtggtagtgctagcCACGTTATACTGACTCAACCGCCCh-λ_F5ggtggcggtggtagtgctagcCRGCCYGTGCTGACTCARCYGCCh-λ_F6ggtggcggtggtagtgctagcCTGSCTGTGCTRACTCAGGCCCCh-λ_F7ggtggcggtggtagtgctagcCAGBCTGTGCTGACTCAGCCRh-λ_F8ggtggcggtggtagtgctagcCAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCCh-λ_R1ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCKAGGACGGTSACCTTGGTSCCASTh-λ_R2ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTAGGACGGTCAGCTCSGTCCCCTCh-λ_R3ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCKAGGRCGGTCAGCTKGGTSCCTCCh-λ_R4ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTAAAATGATCAGCTGGGTTCCTCC注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T采用Takara公司的PrimeScriptTMII第一鏈cDNA合成試劑盒(6210A)中的OligodT引物，以從PBMC中抽提的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，使用上述表1和表2的引物通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到抗體基因的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL，PCR擴(kuò)增的條件為95℃5min，按下列參數(shù)循環(huán)25次：95℃變性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸3min。擴(kuò)增完成后電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖4。4、人源VH和VL單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建先將VL通過(guò)NheI和NotI克隆到pCANTAB5E-SF載體上，然后將VH通過(guò)NcoI和XhoI克隆到上一步的載體上。具體操作如下：將pCANTAB5E-SF載體及擴(kuò)增純化好的人輕鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物用NheI和NotI進(jìn)行酶切。將酶切好的4.4μg載體與1μg片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)純化后電轉(zhuǎn)到10支200μlTG1電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞(2.5kV，2cm規(guī)格電擊杯)中，加入SOC后37℃培養(yǎng)1h，取少量復(fù)蘇菌梯度稀釋涂平板計(jì)算庫(kù)容，剩余菌液涂布到10個(gè)Φ15cm平板上，過(guò)夜培養(yǎng)；第二天計(jì)算庫(kù)容量為2.2×108單個(gè)克隆，用50ml2YT刮洗Φ15cm平板獲取輕鏈抗體庫(kù)，取部分菌液制備小提質(zhì)粒，剩余文庫(kù)菌液加入終濃度30％(V/V)的甘油保存于-80℃。將上述輕鏈抗體庫(kù)質(zhì)粒及擴(kuò)增純化好的人重鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物用NcoI和XhoI進(jìn)行酶切。將酶切好的5.8μg載體與1.2μg片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)純化后電轉(zhuǎn)到20支200μlTG1電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞(2.5kV，2cm規(guī)格電擊杯)中，加入SOC后37℃培養(yǎng)1h，取部分復(fù)蘇菌梯度稀釋涂平板計(jì)算庫(kù)容，剩余菌液涂布到20個(gè)Φ15cm平板上，過(guò)夜培養(yǎng)；第二天計(jì)算庫(kù)容量為5.6×108單個(gè)克隆，用50ml2YT刮洗Φ15cm平板獲取人源VH和VL單鏈抗體庫(kù)，取部分菌液制備小提質(zhì)粒，剩余文庫(kù)菌液加入終濃度30％(V/V)的甘油保存于-80℃。實(shí)施例3：人源抗體庫(kù)的噬菌體展示及篩選1、抗體庫(kù)的噬菌體展示和淘選取100倍庫(kù)容量的上述人源VH和VL單鏈抗體庫(kù)菌液接種880ml2YT-AG培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖)，37℃、200rpm培養(yǎng)至OD600＝0.5～0.6，加入細(xì)胞密度100倍的輔助噬菌體，侵染1.5h，離心收集菌體，用400ml2YT-AK培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素和75μg/ml卡那霉素)重懸細(xì)胞，30℃、200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。將上一步培養(yǎng)物10000g、4℃離心20min，收集上清加入1/4體積的PEG/NaCl，混勻，冰上靜置1h；12000g4℃離心25min，棄上清，離心管倒扣在平板紙上，使液體除盡；用2ml預(yù)冷1×PBS重懸噬菌體沉淀，12000g4℃離心10min；轉(zhuǎn)移上清到新的15ml離心管中，加入終濃度為3％BSA，即獲得第一輪起始噬菌體。以VEGFR2-His(SinoBiological)為抗原包被免疫管，采用2％的M-PBS封閉；然后加入1013的第一輪起始噬菌體進(jìn)行抗體抗原結(jié)合，用PBST洗去未結(jié)合的噬菌體，用1mlGlycine-HCl(pH2.2)洗脫噬菌體，將洗脫下來(lái)的噬菌體重新感染TG1，進(jìn)行洗脫產(chǎn)物的擴(kuò)增，PEG/NaCl沉淀純化噬菌體用于下一輪篩選。共進(jìn)行4輪噬菌體庫(kù)的富集篩選，抗原量依次降低，洗滌強(qiáng)度依次增強(qiáng)，每輪洗脫產(chǎn)物均進(jìn)行滴度測(cè)定。2、單克隆的誘導(dǎo)表達(dá)及ELISA篩選將第1～4輪淘選后的菌液有限稀釋涂布平板，培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆于分裝有0.5ml/孔2YT-AG培養(yǎng)基的96孔深孔板培養(yǎng)過(guò)夜；然后將過(guò)夜培養(yǎng)物按照1:10轉(zhuǎn)接至含有0.5ml/孔2YT-AG培養(yǎng)基的96孔深孔板中，培養(yǎng)至OD600＝0.5～0.6，3000g離心收集菌體，用2YT-AI培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG)重懸菌體，30℃誘導(dǎo)過(guò)夜，第二天離心轉(zhuǎn)移上清至潔凈的96孔深孔板，加入終濃度為3％BSA，獲得單克隆噬菌體樣品。以VEGFR2-His為抗原包被96孔酶標(biāo)板，封閉后向每孔中加入50μl單克隆噬菌體樣品，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μlPBST，振蕩5～10S，棄溶液，重復(fù)3～5次；之后向每孔中加入抗M13-HRP抗體PBS稀釋液50μl，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μlPBST，振蕩5～10S，棄溶液，重復(fù)5次；向每孔中加入50μlTMB顯色液，顯色3～10min(具體顯色時(shí)間視顯色速度而定)，之后向每孔中加入50μl1MH2SO4終止顯色；使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。依據(jù)單克隆噬菌體ELISA數(shù)據(jù)選定360個(gè)ELISA測(cè)定陽(yáng)性樣品，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA篩選，將陽(yáng)性對(duì)照抗體稀釋至200μg/ml，取50μl稀釋液與50μl單克隆噬菌體樣品混合后，進(jìn)行上面步驟的ELISA，結(jié)果顯示其中有30個(gè)單克隆與陽(yáng)性對(duì)照抗體存在表位競(jìng)爭(zhēng)，選定這些克隆進(jìn)行測(cè)序；取上述在96孔板深孔板2YT-AG培養(yǎng)基中的過(guò)夜培養(yǎng)菌液，進(jìn)行測(cè)序分析，最終獲得獨(dú)特的單克隆抗體的可變區(qū)序列如SEQIDNO:1～12所示。實(shí)施例4：全長(zhǎng)抗體制備1、全長(zhǎng)抗體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的構(gòu)建分別選擇pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL作為構(gòu)建抗人VEGFR2全長(zhǎng)抗體的重鏈和輕鏈的表達(dá)載體。根據(jù)VH、VL的基因序列及載體中的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，使用體外重組的方法(蘇州泓迅，iMulli多片段重組克隆試劑盒)將6個(gè)VH和6個(gè)VL抗體基因分別克隆到pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL，如表3。測(cè)序鑒定抗體基因正確插入后，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，挑取單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。使用ZymoResearch的去內(nèi)毒素大提試劑盒抽提質(zhì)粒，最后將質(zhì)粒溶于1ml超純水，用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度和OD260/280。OD260/280在1.8～1.9為純度較高的質(zhì)粒DNA。表3、重鏈和輕鏈瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體列表重鏈表達(dá)載體名稱(chēng)重鏈可變區(qū)序列輕鏈表達(dá)載體名稱(chēng)輕鏈可變區(qū)序列H1SEQIDNO:1L1SEQIDNO:7H2SEQIDNO:2L2SEQIDNO:8H3SEQIDNO:3L3SEQIDNO:9H4SEQIDNO:4L4SEQIDNO:10H5SEQIDNO:5L5SEQIDNO:11H6SEQIDNO:6L6SEQIDNO:122、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293E中的轉(zhuǎn)染、表達(dá)和檢測(cè)將上述6個(gè)重鏈表達(dá)載體和6個(gè)輕鏈表達(dá)載體兩兩組合(共36種組合)后進(jìn)行2ml293E體系的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)評(píng)估，檢測(cè)表達(dá)量及抗體與VEGFR2結(jié)合的ELISA檢測(cè)值，結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)表達(dá)量及抗體與VEGFR2結(jié)合的ELISA檢測(cè)值，選擇相對(duì)低的EC50值、相對(duì)高的ELISARmax值，優(yōu)選H1L3、H2L3、H3L6、H5L3、H5L5、H6L6這6個(gè)全長(zhǎng)抗體，命名為043HAb-1、043HAb-2、043HAb-3、043HAb-4、043HAb-5、043HAb-6。表4、6×6組合全長(zhǎng)抗體小體系瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)的表達(dá)量、EC50值及ELISARmax值使用293E在Freestyle培養(yǎng)基中進(jìn)行6個(gè)優(yōu)選抗體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，在1L細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種0.5×106細(xì)胞/ml的293E細(xì)胞300ml，37℃5％CO2溫箱中120rpm搖床培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)先取300μl的293fectin加入到5.7ml的OPtiMEM中，充分混勻后，室溫孵育2分鐘；同時(shí)將重鏈和輕鏈表達(dá)質(zhì)粒各300μg使用OPtiMEM稀釋至6ml。將上述稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒充分混合，室溫孵育15分鐘，然后將混合物全部加入細(xì)胞中，混勻，37℃5％CO2溫箱中120rpm搖床培養(yǎng)7天。3、抗體的純化及檢測(cè)2000g、20min離心細(xì)胞培養(yǎng)液，收集上清，用Octet檢測(cè)上清中抗體表達(dá)量，見(jiàn)表5。表5、6個(gè)優(yōu)選抗體300ml瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)的表達(dá)量檢測(cè)將上清用0.22微米的濾膜過(guò)濾，然后過(guò)MabSelectSuRe親和層析柱(GE)，20mM枸櫞酸-枸櫞酸納，pH3.0洗脫，用1MTrisbase調(diào)節(jié)pH至中性，加入10xPBS調(diào)節(jié)成等滲溶液。4～20％梯度膠(金斯瑞生物科技有限公司)進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)圖5泳道7～12。取純化后抗體，采用還原條件的SDS-PAGE分析純化產(chǎn)物，鑒定了抗體的性質(zhì)和純度，還原條件下重鏈為50KD，輕鏈為25KD，結(jié)果如圖1泳道1～6所示。實(shí)施例5：優(yōu)選抗體抗原表位競(jìng)爭(zhēng)ELISA1、包被：人VEGFR2-His用PBS稀釋成1μg/ml，加至96孔酶標(biāo)板中，每孔50μl，4℃下孵育過(guò)夜。2、封閉：洗板三次后用3％BSA封閉，每孔250μl，37℃條件下孵育2小時(shí)。3、加候選抗體：洗板前分別使用0.5μg/ml生物素(Biotin)標(biāo)記的陽(yáng)性抗體與起始濃度為0.15mg/ml2倍稀釋12個(gè)梯度樣品混合(陽(yáng)性抗體起始濃度為0.3mg/ml)，洗板3次后，加入候選抗體樣品或陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照。每孔50μl，25℃條件下1小時(shí)。4、加二抗：洗板3次后，加入HRP標(biāo)記鏈霉親和素(1:10000)，每孔50μl，25℃條件下反應(yīng)1小時(shí)。5、顯色：洗板4次后，加TMB顯色液，每孔50μl，室溫下避光顯色10分鐘。6、終止：直接加入50μl每孔的終止液終止反應(yīng)。7、檢測(cè)：終止反應(yīng)后立即把酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm處測(cè)其OD值，保存原始數(shù)據(jù)整理如圖6。043HAb-1～43HAb-6優(yōu)選抗體均與陽(yáng)性抗體有抗原表位競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象。實(shí)施例6：優(yōu)選抗體親和力測(cè)定使用BiacoreT200儀器檢測(cè)抗人VEGFR2全長(zhǎng)抗體的親和力。具體方法如下：使用GEHealthcare公司的人抗體捕獲試劑盒將人的抗體偶聯(lián)在CM5生物傳感芯片(GE)上，芯片上的抗人Fc抗體捕獲優(yōu)選抗體或陽(yáng)性抗體，不同濃度的人VEGFR2以30μl/min流速流過(guò)芯片上的候選抗體，人VEGFR2與候選抗體進(jìn)行結(jié)合，結(jié)合時(shí)間為120s，解離時(shí)間為300s。用BIAevalution軟件(GE)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合，獲得親和力常數(shù)結(jié)果如下表6，結(jié)果表明6個(gè)優(yōu)選抗體均與人VEGFR2有良好的結(jié)合活性。表6、候選抗體與人VEGFR2的親和力測(cè)定結(jié)果抗體名稱(chēng)Ka(1/Ms)Kd(1/s)KD(M)043HAb-11.19E+056.72E-055.67E-10043HAb-22.33E+054.92E-052.11E-10043HAb-31.75E+058.71E-054.98E-10043HAb-41.53E+056.48E-054.25E-10043HAb-51.75E+058.69E-054.97E-10043HAb-62.71E+057.51E-052.77E-10陽(yáng)性抗體1.03E+054.68E-054.57E-10注：E+05：×105；E-05：×10-5；E-10：×10-10實(shí)施例7：優(yōu)選抗體細(xì)胞活性檢測(cè)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)表達(dá)VEGFR2，優(yōu)選抗體或陽(yáng)性抗體通過(guò)與VEGFR2特異性結(jié)合，阻斷VEGFR2與VEGF的相互作用，從而抑制HUVEC的增殖。故可通過(guò)考察藥物抑制HUVEC細(xì)胞的增殖來(lái)檢測(cè)其細(xì)胞活性，具體步驟如下。1、對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備：取對(duì)照品(陽(yáng)性抗體)及供試品(優(yōu)選抗體)，根據(jù)蛋白標(biāo)示量，用EBMTM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基將對(duì)照品及供試品預(yù)稀釋至800μg/ml，每次最大稀釋倍數(shù)不超過(guò)25倍。以800μg/ml為最大濃度，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中將對(duì)照品及供試品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)呵?個(gè)濃度進(jìn)行4倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)濃度進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)濃度至少做2個(gè)復(fù)孔，終濃度分別為200000、50000、12500、3125、781.25、195.31、48.83、12.20、1.22、0.12ng/ml。2、細(xì)胞鋪板：取5代以?xún)?nèi)(包含5代)細(xì)胞活率大于或等于90％的HUVEC細(xì)胞，用EBM分析培養(yǎng)基配成每1ml含2.5×104～3.5×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，以100μl/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板-1，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約3.5h。3、對(duì)照品溶液及供試品溶液的加樣：取細(xì)胞貼壁后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板-1，以50μl/孔將“對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備”步驟中96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的稀釋液依次加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板-1，其余各孔則以50μl/孔加入EBMTM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基。完成加樣操作后，將細(xì)胞培養(yǎng)板-1置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約1.5h。4、VEGF的加樣：將VEGF工作液以50μl/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板-1第B～G行所對(duì)應(yīng)的孔中，其余各孔則以50μl/孔加入EBMTM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基。完成加樣操作后，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板-1置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)92～94h。5、顯色及讀板操作：每孔加入20μlCCK-8顯色液，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板-1放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)約3.5h。取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板-1，置于酶標(biāo)儀中，設(shè)置讀板前振動(dòng)30S，以450nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，以620nm為參比波長(zhǎng)，測(cè)定吸光度。以對(duì)照品或供試品濃度為橫坐標(biāo)，以平均吸光度為縱坐標(biāo)，采用計(jì)算機(jī)程序或四參數(shù)回歸計(jì)算法進(jìn)行處理，計(jì)算對(duì)照品和供試品的半效抑制濃度(IC50)，具體計(jì)算公式如下：具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7和圖7，在本實(shí)驗(yàn)條件下，043HAb-1、043HAb-2、043HAb-3、043HAb-4、043HAb-5、043HAb-6對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖的50％抑制濃度，即IC50值分別為5.57、5.42、4.86、4.13、2.72、0.965μg/ml，而在相同實(shí)驗(yàn)條件下，陽(yáng)性抗體的IC50值分別為2.92、2.75、2.47、2.06、3.07、2.76μg/ml，顯示043HAb-6具有高于陽(yáng)性抗體的體外抗血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。表7、優(yōu)選抗體細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果對(duì)照品IC50(nM？)樣品IC50活性陽(yáng)性抗體2.92043HAb-15.5752.4％陽(yáng)性抗體2.75043HAb-25.4250.7％陽(yáng)性抗體2.47043HAb-34.8650.8％陽(yáng)性抗體2.06043HAb-44.1349.9％陽(yáng)性抗體3.07043HAb-52.72112.9％陽(yáng)性抗體2.76043HAb-60.965286.0％以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司<120>抗VEGFR2單克隆抗體及其應(yīng)用<130>MP1706486<160>15<170>PatentInversion3.3<210>1<211>117<212>PRT<213>人工序列<400>1GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysThrSerGlySerAsnIleGluAspPhe202530TyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleAspProGluAspGlyAspSerAspTyrAlaProMetPhe505560GlnGlyArgValThrMetThrAlaAspThrSerIleAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerGlyLeuArgPheAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AsnAlaTyrTyrGlyGluTyrGluGlyTyrTrpGlyGlnGlyThrAla100105110ValThrValSerSer115<210>2<211>117<212>PRT<213>人工序列<400>2GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysThrSerGlySerAsnIleGluAspPhe202530TyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleAspProGluAspGlyAspSerAspTyrAlaProMetPhe505560GlnGlyArgValThrMetThrAlaAspThrSerIleAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerGlyLeuArgPheAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AsnAlaTyrTyrGlyGluTyrGluGlyTyrTrpGlyGlnGlyThrAla100105110ValThrValSerSer115<210>3<211>117<212>PRT<213>人工序列<400>3GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysThrSerGlySerAsnIleLysAspIle202530TyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleAspProGlyAspGlyAspSerAspTyrAlaProMetPhe505560GlnAspArgValThrMetThrAlaAspAlaSerIleAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerGlyLeuArgPheAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095IleAlaTyrTyrGlyGluTyrGluGlyTyrTrpGlyGlnGlyThrThr100105110ValThrValSerSer115<210>4<211>117<212>PRT<213>人工序列<400>4GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysThrSerGlyPheAsnIleGluAspIle202530TyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleAspProGluAspGlyAspSerAspTyrAlaProLysPhe505560GlnAspArgValThrMetThrAlaAspThrSerIleAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerGlyLeuArgPheAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AsnAlaTyrTyrGlyGluTyrGluGlyTyrTrpGlyGlnGlyThrThr100105110ValThrValSerSer115<210>5<211>117<212>PRT<213>人工序列<400>5GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysThrSerGlySerAsnIleGluAspPhe202530TyrIleHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleAspProGlyAspGlyAspSerAspTyrAlaProMetPhe505560GlnAspArgValThrMetThrAlaAspThrSerIleAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerGlyLeuArgPheAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095IleAlaTyrTyrGlyGluTyrGluGlyTyrTrpGlyGlnGlyThrThr100105110ValThrValSerSer115<210>6<211>117<212>PRT<213>人工序列<400>6GlnValLysLeuLeuGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysThrSerGlyProAsnIleGluAspIle202530TyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleAspProGlyTyrGlyAspSerAspTyrAlaProLysPhe505560GlnAspArgValThrMetThrAlaAspThrSerIleAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerGlyLeuArgPheAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095IleAlaTyrTyrGlyGluTyrAspGlyTyrTrpGlyGlnGlyThrThr100105110ValThrValSerSer115<210>7<211>106<212>PRT<213>人工序列<400>7AspIleGluLeuThrGlnSerProSerSerValSerAlaSerValGly151015AspHisValThrIleThrCysSerAlaSerSerSerValSerAsnVal202530HisTrpPheGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuTrpIlePhe354045SerThrArgAsnLeuValSerGlyValProSerArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerSerLeuGlnSerGlu65707580AspSerAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgSerIleHisProTyrThr859095PheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>8<211>106<212>PRT<213>人工序列<400>8AspIleGluLeuThrGlnSerProSerSerValSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysSerAlaSerSerGlyValSerAsnThr202530HisTrpPheGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuTrpIleTyr354045SerThrArgAsnLeuAlaAsnGlyValProSerArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerSerLeuGlnProGlu65707580AspSerAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgSerIleTyrProTyrThr859095PheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>9<211>106<212>PRT<213>人工序列<400>9AspIleGluLeuThrGlnSerProSerSerValSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysSerAlaSerSerGlyValSerAsnThr202530HisTrpPheGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuTrpIleTyr354045SerThrArgAsnLeuValAsnGlyValProSerArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerSerLeuGlnProGlu65707580AspSerAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgSerSerHisProTyrThr859095PheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>10<211>106<212>PRT<213>人工序列<400>10AspIleGluLeuThrGlnSerProSerSerValSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysIleAlaSerSerGlyValSerAsnThr202530HisTrpPheGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuTrpIleTyr354045SerThrArgAsnLeuAlaAsnGlyValProSerArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerSerLeuGluProGlu65707580AspSerAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgSerSerTyrProTyrThr859095PheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>11<211>106<212>PRT<213>人工序列<400>11AspIleGluLeuThrGlnSerProSerSerValSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysIleAlaSerSerGlyValSerAsnThr202530HisTrpPheGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuTrpIleTyr354045SerThrSerSerLeuAlaAsnGlyValProSerArgPheSerGlySer505560GlySerGlySerAspTyrSerLeuThrIleSerSerLeuGlnProGlu65707580AspSerAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgSerSerTyrProTyrThr859095PheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>12<211>106<212>PRT<213>人工序列<400>12AspIleGluLeuThrGlnSerProSerSerValSerAlaSerValGly151015ValArgValThrIleThrCysSerAlaSerSerGlyValSerTyrThr202530HisArgPheGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuTrpIleTyr354045SerThrArgAsnLeuValAsnGlyValProSerArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrAspHisSerLeuThrIleSerSerLeuGlnProAsp65707580AspSerAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgSerIleHisProTyrThr859095PheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>13<211>447<212>PRT<213>人工序列<400>13GlnValLysLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuValGlySerGlyAla151015SerValLysLeuSerCysThrThrSerGlyPheAsnIleLysAspPhe202530TyrMetHisTrpValLysGlnArgProGluGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleAspProGluAsnGlyAspSerAspTyrAlaProLysPhe505560GlnGlyLysAlaThrMetThrAlaAspSerSerSerAsnThrAlaTyr65707580LeuGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AsnAlaTyrTyrGlyAspTyrGluGlyTyrTrpGlyGlnGlyThrThr100105110ValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeu115120125AlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCys130135140LeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSer145150155160GlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSer165170175SerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSer180185190LeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLysProSerAsn195200205ThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAspLysThrHis210215220ThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerVal225230235240PheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThr245250255ProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGlu260265270ValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLys275280285ThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSer290295300ValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys305310315320CysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIle325330335SerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuPro340345350ProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeu355360365ValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsn370375380GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSer385390395400AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArg405410415TrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu420425430HisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys435440445<210>14<211>213<212>PRT<213>人工序列<400>14AspIleGluLeuThrGlnSerProAlaIleMetSerAlaSerProGly151015GluLysValThrIleThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMet202530HisTrpPheGlnGlnLysProGlyThrSerProLysLeuTrpIleTyr354045SerThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrIleSerArgMetGluAlaGlu65707580AspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgSerSerTyrProPheThr859095PheGlySerGlyThrLysLeuGluIleLysArgThrValAlaAlaPro100105110SerValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThr115120125AlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLys130135140ValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGlu145150155160SerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSer165170175ThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAla180185190CysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPhe195200205AsnArgGlyGluCys210<210>15<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>15ggcccagccggccatggcctaaggatcctaaaccgtctcgagcggtggtggcggtagtgg60cggtggtggtagcggtggcggtggtagtgctagcgacatcctgcagtgaaaggcggccgc120當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3