本發(fā)明屬于適體領(lǐng)域，具體涉及特異結(jié)合膜聯(lián)蛋白a2的核酸適體，還涉及該核酸適體的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

膜聯(lián)蛋白a2(annexina2，anxa2)是由339個(gè)氨基酸組成的分子量為36kda的蛋白質(zhì),是一種ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，在細(xì)胞中可以單體(p36)、異源二聚體(p36/p11)和異源四聚體(p362/p112)三種形式存在。它在結(jié)構(gòu)上高度保守并且在幾乎所有真核生物中表達(dá)，主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿中，一小部分存在于細(xì)胞核中。anxa2主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中，在腦癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌以及血液腫瘤中表達(dá)上調(diào)。anxa2在腫瘤中的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。anxa2在高侵襲、高轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤中高表達(dá)，提示anxa2有望成為判斷腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力及腫瘤病人預(yù)后的標(biāo)志物，可作為腫瘤治療潛在的靶分子，該核酸適體可用于腫瘤早期檢測(cè)及治療。

目前，anxa2的檢測(cè)方法主要有免疫組化法，酶聯(lián)免疫法等免疫學(xué)檢測(cè)法。依賴抗體的免疫學(xué)檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，無需大型昂貴儀器設(shè)備，適用于大量樣品的檢測(cè)，但是這種方法檢測(cè)的假陽性率比較高，定量也不夠準(zhǔn)確。并且檢測(cè)所用抗體等試劑穩(wěn)定性差，儲(chǔ)存條件較dna核酸適體嚴(yán)格。核酸適體能與各種有機(jī)物或無機(jī)物靶標(biāo)分子高特異性、高親和力結(jié)合，同時(shí)具有分子量小，免疫原性低，穩(wěn)定性好，制備和標(biāo)記方便等優(yōu)點(diǎn)。核酸適體作為抗體分子的替代分子，在疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用。但迄今尚無針對(duì)anxa2的dna核酸適體報(bào)道或公開，因此有必要開發(fā)一種可特異結(jié)合anxa2的核酸適體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明目的在于提供特異結(jié)合并作用anxa2的核酸適體。

本發(fā)明人采用消減篩選的策略，利用gst-anxa2融合蛋白作為篩選靶標(biāo)，可獲得與融合蛋白結(jié)合的dna序列，通過將gst蛋白作為負(fù)性篩選，將與gst蛋白結(jié)合的dna序列去除，從而得到能與anxa2蛋白特異結(jié)合的核酸適體，通過篩選獲得了一條特異結(jié)合anxa2的核酸適體（命名為wh3）。所述核酸適體的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本發(fā)明提供所述特異結(jié)合anxa2的核酸適體wh3在制備檢測(cè)anxa2試劑中的應(yīng)用。具體地，通過將anxa2蛋白與酶標(biāo)板結(jié)合，然后利用生物素標(biāo)記的wh3核酸適體孵育結(jié)合；pbs洗板后，加入過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素孵育，加入過氧化物酶的底物顯色，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)并計(jì)算anxa2的濃度。

本發(fā)明提供特異結(jié)合anxa2的核酸適體wh3在純化和濃縮anxa2中的應(yīng)用。具體地，anxa2蛋白與生物素標(biāo)記的wh3核酸適體結(jié)合，然后加入鏈霉親和素磁珠孵育，通過磁粉可將anxa2純化和濃縮。

本發(fā)明提供特異結(jié)合anxa2的核酸適體在制備靶向anxa2藥物中的應(yīng)用。具體而言，細(xì)胞膜表面的anxa2蛋白能與多種蛋白結(jié)合發(fā)揮其生理作用，，wh3能與anxa2蛋白結(jié)合，可能阻斷anxa2蛋白與其它蛋白的相互作用，其功能表現(xiàn)為wh3阻斷anxa2蛋白促進(jìn)mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞的生長(zhǎng)，wh3能抑制mm1.s和rpmi-8226細(xì)胞對(duì)anxa2蛋白的粘附作用。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明公開了特異結(jié)合anxa2的核酸適體，該核酸適體能夠與anxa2特異性結(jié)合，為anxa2純化和濃縮，靶向anxa2的藥物以及定量或定性檢測(cè)anxa2提供了靶分子，同時(shí)為檢測(cè)血清中anxa2的水平，反映機(jī)體腫瘤負(fù)荷狀態(tài)提供了工具，也為臨床選擇最佳的治療方案提供了策略，為觀察治療效果和判斷預(yù)后提供幫助。

附圖說明

圖1.wh3核酸適體的空間結(jié)構(gòu)；

圖2.elisa檢測(cè)wh3與anxa2蛋白結(jié)合；

圖3.aptamer-pulldown檢測(cè)wh3與anxa2蛋白結(jié)合；

圖4.wh3抑制anxa2刺激mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞的生長(zhǎng)；

圖5.wh3抑制hs-5細(xì)胞刺激mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞的生長(zhǎng)；

圖6.wh3抑制mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞與anxa2蛋白的粘附。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

合成長(zhǎng)度為80nt的核苷酸文庫序列（上海生工生物工程（上海）股份有限公司），具體序列如下：5'-accgaccgtgctggactca(n)42actatgagcgagcctggcg-3'，兩端為固定序列，本文庫中間42n代表42個(gè)隨機(jī)堿基，保證其庫容量大約為10¹⁴，足夠大庫容量可形成不同的三維空間結(jié)構(gòu)，從而保證具有與靶標(biāo)結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)的序列存在，并在后面的篩選過程中篩選出來，庫序列為p80ss庫。然后將隨機(jī)寡聚ssdna文庫用如下引物進(jìn)行擴(kuò)增：

p80-sf：5'-fam-accgaccgtgctggactca-3'（seqidno.1）

p80-ap:5'-biotin-cgccaggctcgctcatagt-3'（seqidno.2）

隨機(jī)ssdna文庫（首輪篩選量為5000pmol，相當(dāng)于4個(gè)od隨機(jī)庫）用1ml1×選擇緩沖液溶解于ep管中（1%bsa包被，4℃封閉過夜），95℃變性10min，變性后立即置于0℃放置10min。將包被了gst蛋白的磁珠混勻，取100μl置于bsa包被的ep管中，用150μl結(jié)合緩沖液洗滌3次。將ssdna文庫（5nmol）與包被了gst蛋白的磁珠混勻，室溫孵育1h，去除與gst蛋白磁珠結(jié)合的ssdna序列。取上清ssdna文庫與包被了anxa2磁珠混勻孵育1h，同時(shí)加入酵母trna競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。將ep管置磁力架上2-3min，棄上清，用1×洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的ssdna序列,每次3min，重復(fù)3次。置磁力架2-3min，棄上清。ep管中加入200μl去離子水，95℃加熱5min，置磁力架2min，取上清為pcr的模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

配置pcr體系：模板2μl，引物p80-sf（10μm）1μl，引物p80-ap（10μm）1μl，dntp（各2.5mm）4μl，10×buffer5μl，taqdna聚合酶0.25μl，ddh2o36.75μl(總體積為50μl)。按如下條件，在pcr儀上擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共25個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增后將pcr產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。用200μl1×磁珠結(jié)合洗滌緩沖液重懸鏈霉親和素瓊脂糖珠，使鏈霉親和素瓊脂糖珠的終濃度為5μg/μl,加入1mlpcr產(chǎn)物，室溫?fù)u床孵育結(jié)合1h，然后1000rpm，離心2min，棄上清。用1×磁珠結(jié)合洗滌緩沖液洗滌鏈霉親和素瓊脂糖珠，每次5min，重復(fù)3次。去上清，加入400μl的200mmnaoh與鏈霉親和素瓊脂糖珠孵育5min，使dsdna解鏈，然后1000rpm，離心2min，含生物素的一條ssdna仍留在鏈霉親和素瓊脂糖珠上，而另一條不帶生物素的ssdna存在于上清中。分離上清中ssdna即為下一輪篩選的富集庫。重復(fù)進(jìn)行9個(gè)循環(huán)篩選。

克隆測(cè)序及序列分析

將第9輪篩選得到的核酸適體富集庫用無修飾的引物擴(kuò)增，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序成功后獲得了兩條與anxa2結(jié)合的核酸適體，其中一條序列如seqidno.3所示，命名為wh3（另一條命名為wh6，另案予以申請(qǐng)）。具體序列如下：

anxa2核酸適體(wh3)為：5'-accgaccgtgctggactcaggccgattgactttccaacaaacttaggcccactagacagaaactatgagcgagcctggcg-3'(seqidno.3)

然后通過mfold軟件對(duì)wh3核酸適體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)構(gòu)如圖1.所示。

實(shí)施例2

1×10⁷個(gè)anbl-6細(xì)胞用westernblot及ip細(xì)胞裂解液(碧云天，p0013)冰上裂解30min，提取細(xì)胞總蛋白,取20μl蛋白液作為input。平均分到三個(gè)ep管中，分別加入50pmol的5’端生物素修飾的wh3核酸適體和dna-lib,并設(shè)鏈霉親和素瓊脂糖珠的陰性對(duì)照組,4℃搖床孵育1h。然后加入20μl的鏈霉親和素瓊脂糖珠，4℃搖床孵育1h。1000rpm，離心2min，棄上清，加入1ml的dpbs洗5min，1000rpm，離心2min，棄上清。重復(fù)用dpbs洗三次，加入40μl的westernblot上樣緩沖液到ep管中，95℃加熱5min。1000rpm，離心2min，取上清,sds-page電泳，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉后用小鼠單克隆anxa2抗體4℃孵育過夜，tpbs洗三次，加入hrp標(biāo)記的兔抗鼠的igg，通過ecl反應(yīng)液顯影，檢測(cè)wh3核酸適體和dna-lib與anxa2的結(jié)合情況。

結(jié)果顯示（參見圖2），dnal-lib和鏈霉親和素瓊脂糖珠不與anxa2蛋白結(jié)合，wh3核酸適體能與anxa2蛋白結(jié)合。

實(shí)施例3

anxa2重組蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋到1μg/ml,取200μl加入到酶標(biāo)板的孔中。4℃孵育過夜，用dpbs洗四次，每次3min。用1%的bsa37℃封閉2h，dpbs洗三次，每次3min。將5’端生物素修飾的wh3核酸適體和dna-lib95℃變性10min，置于冰上10min；然后分別取20nm加入包被了anxa2蛋白的酶標(biāo)板孔中，室溫孵育2h。dpbs洗三次，每次3min。在酶標(biāo)板孔中，加入200μl的辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素（碧云天，p0013，a0303），室溫孵育1h。dpbs洗三次，每次3min。在酶標(biāo)板孔中，加入100μl顯色液（el-abts顯色試劑盒，c510031，上海生工），顯色15min。酶標(biāo)儀405nm/650nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。

結(jié)果顯示（參見圖3）：通過wh3核酸適體與anxa2結(jié)合的親和力分析，結(jié)果表明wh3核酸適體能與anxa2特異結(jié)合。

實(shí)施例4

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞2×10⁵個(gè)/ml鋪至24孔板中。生長(zhǎng)過夜后，第二天加入1μg/ml的anxa2蛋白；同時(shí)分別加入4μm的dna-lib和wh3核酸適體。繼續(xù)培養(yǎng)72h，細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察anxa2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激作用和wh3核酸適體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的阻斷情況。

結(jié)果顯示（參見圖4）：anxa2蛋白能明顯促進(jìn)mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞的生長(zhǎng)，dna-lib對(duì)anxa2蛋白促進(jìn)mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞的生長(zhǎng)無影響，而wh3核酸適體阻斷anxa2蛋白促進(jìn)mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞的生長(zhǎng)。

實(shí)施例5

將hs-5細(xì)胞1×10⁵個(gè)/ml鋪至24孔板中。生長(zhǎng)過夜后，第二天加入加入1×10⁶個(gè)mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞；并分別加入4μm的dna-lib和wh3核酸適體，繼續(xù)培養(yǎng)72h。然后將上層培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，吸到96孔板中，用cck-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。

結(jié)果顯示（參見圖5）：anxa2核酸適體能阻斷hs-5細(xì)胞促進(jìn)mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例6

anxa2重組蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋到1μg/ml，取200μl加入到96孔板中。4℃孵育過夜，用dpbs洗四次，每次3min。用1%bsa37℃封閉2h，dpbs洗三次，每次3min。將mm.1s細(xì)胞和rpmi-8226細(xì)胞用dii（碧云天，c1036）染色20min。取100μl加入已經(jīng)孵育anxa2蛋白的96孔板的孔中，同時(shí)分別加入4μm的dna-lib和wh3核酸適體，與細(xì)胞共同孵育2h。用dpbs洗3次，每次2min。通過全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光（激發(fā)光549nm，發(fā)射光635nm）。

附圖6結(jié)果顯示，wh3核酸適體抑制mm.1s和rpmi-8226細(xì)胞對(duì)anxa2蛋白的粘附作用。

<110>中南大學(xué)，湖南大學(xué)

<120>一種特異結(jié)合膜聯(lián)蛋白a2的核酸適體wh3及用途

<160>3

<210>1

<211>19

<212>dna

<400>1

accgaccgtgctggactca19

<210>2

<211>19

<212>dna

<400>2

cgccaggctcgctcatagt19

<210>3

<211>80

<212>dna

<400>3

accgaccgtgctggactcaggccgattgactttccaacaaacttaggcccactagacagaaactatgagcgagcctggcg80