本發(fā)明涉及一種基于納米金粒子和核酸結(jié)構(gòu)的相互作用的新型納米探針，以及在此基礎(chǔ)上建立的腫瘤標志物的快速熒光檢測方法。

背景技術(shù)：

dna在自然界中主要以雙螺旋形式存在，然而，隨著體外快速篩選技術(shù)的建立，人們可以獲得數(shù)量眾多的新的核酸結(jié)構(gòu)如核酸適體、dna酶、rna酶。核酸適體是一類對于配體具有高親和力的dna或rna，而dna酶/rna酶則是如蛋白酶一類具有酶催化活性的結(jié)構(gòu)。這些體外篩選技術(shù)作為分子工具在生物技術(shù)領(lǐng)域中變得越來越重要。例如，他們在生物傳感器的設(shè)計中起著重要作用，而且應(yīng)用于生物學、環(huán)境、安全等領(lǐng)域的檢測，包括蛋白質(zhì)(凝血酶、生長因子、hiv相關(guān)多肽等)、有機小分子(camp、atp、cocaine等)和金屬離子(k⁺、hg²⁺、pb²⁺等)、其他新的令人興奮的應(yīng)用包括基于核酸適體的蛋白質(zhì)芯片，并在蛋白質(zhì)組學中用于高通量成像、以及基于dna酶和rna酶的分子尺度的邏輯門dna分子計算機。

我們尤其對發(fā)展基于核酸結(jié)構(gòu)的分子傳感器保有濃厚的興趣，因為核酸結(jié)構(gòu)具有幾種優(yōu)勢，首先，任何靶物質(zhì)在理論上都可以通過selex技術(shù)尋找到特異性的核酸結(jié)構(gòu)，因此以核酸結(jié)構(gòu)為識別元件的生物傳感方法可以作為一個生物檢測的平臺，實現(xiàn)對眾多靶物質(zhì)的檢測。其次，核酸結(jié)構(gòu)通常都具有非常高的親和力，而高親和力使得我們可以很方便地檢測到極微量的靶分子，并將反應(yīng)信號直接傳輸?shù)綑z測元件進行讀取，同時又不受其他非靶物質(zhì)的干擾，實現(xiàn)對靶分子的特異性檢測。另外，dna(包括部分rna)在化學性質(zhì)上非常穩(wěn)定，適于固定在固相表面，這使得發(fā)展耐用和可重復使用的固相傳感器成為可能。

核酸結(jié)構(gòu)在遇到相應(yīng)的配體進行結(jié)合時通常會伴有明顯的結(jié)構(gòu)變化。這種結(jié)構(gòu)的差異形成了基于核酸結(jié)構(gòu)傳感器的理論基礎(chǔ)。一個典型的基于核酸結(jié)構(gòu)的傳感器包括一個雙標記的寡核苷酸序列(電子傳遞或能量傳遞的受體和供體)，因此，配體結(jié)合導致的結(jié)構(gòu)變化直接可以影響到受體和配體之間的距離，從而可以高靈敏度的檢測到電信號或光信號的產(chǎn)生。

本方法在上述基礎(chǔ)上，提出利用納米金顆粒對熒光的猝滅來檢測核酸結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。納米金顆粒在生物學中的應(yīng)用非常廣泛，最早可以追溯到二十世紀七十年代免疫金在生物成像中的應(yīng)用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，納米金是一種非常高效的熒光猝滅體系。1996年，mirkin和alivisatos所在工作組分別報道了納米金-dna復合物的重要應(yīng)用，并將其發(fā)展為基于納米結(jié)構(gòu)的新型檢測平臺。rothberg等人報道了一種更為簡便的、利用未經(jīng)過修飾的金膠來檢測靶dna的比色法，其基本原理是納米金顆?？梢院蛦捂渄na，通過靜電作用發(fā)生瞬時的吸附結(jié)合，從而可以在高離子強度條件下有效地穩(wěn)定納米金，而且吸附在納米金顆粒表面的dna由于拉近了熒光素與納米金的距離，使得熒光素被有效猝滅，而雙鏈dna則不具有這種作用。在此基礎(chǔ)上，我們將這種新的理論應(yīng)用在pcr領(lǐng)域，發(fā)展了一種高選擇性的基于納米金增強的nanoparticlepcr方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出進一步將納米金用于核酸結(jié)構(gòu)的熒光探針的方法。首先將與靶作用的特異性dna(aptamer等)與其互補的熒光標記cdna雜交形成dsdna作為雙鏈探針，當加入靶分子后，特異性dna與靶進行高效結(jié)合，導致dsdna解離，熒光標記cdna釋放到溶液中呈單鏈狀態(tài)，當其吸附到納米金表面時，納米金可以非常高效地猝滅cdna的熒光。而雙鏈探針本身以及其它剛性dna結(jié)構(gòu)由于不能吸附到納米金表面，從而熒光沒有明顯降低。利用這種方法，可以建立一種生物檢測的通用模式實現(xiàn)對靶分子的快速、靈敏檢測。、

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種檢測腫瘤標志物的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將腫瘤標志物的特異性核酸適體與其互補序列cdna反應(yīng)，制成雙鏈探針，所述互補序列的5’端標記有熒光基團；所述熒光基團優(yōu)選fam

(2)向雙鏈探針中加入待測腫瘤標志物靶分子，充分反應(yīng)，作為實驗組；

向雙鏈探針中加水，作為空白組；向雙鏈探針中加入與步驟(1)的核酸適體不匹配的腫瘤標志物作為對照組；記錄三組的熒光光譜強度

取實驗組、空白組、對照組加入納米金，記錄三組加入納米金后的熒光光譜強度；

(3)實驗組中，待測腫瘤標志物靶分子與核酸適體特異性結(jié)合，釋放出互補序列，互補序列標記有熒光基團，以單鏈狀態(tài)存在，吸附到納米金表面，納米金猝滅互補序列的熒光；實驗組加入納米金后的熒光強度顯著下降；且熒光強度的下降值與待測腫瘤標志物靶分子的濃度呈比例關(guān)系；

空白組和對照組中，水或不匹配的腫瘤標志物無法與核酸適體特異性結(jié)合，雙鏈探針無法吸附到納米金表面，雙鏈探針上的熒光無法被納米金猝滅；空白組和對照組加入納米金的熒光強度無顯著變化；

所述步驟(1)中，所述腫瘤標志物包括前列腺特異性抗原(psa)、癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白(afp)或上皮細胞粘附分子(epcam)

所述步驟(1)中，前列腺特異性抗原(psa)、癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白(afp)或上皮細胞粘附分子(epcam)各自的核酸適體和其互補序列cdna的序列如下表1所示。

表1序列表

互補序列的5’端標記有熒光基團；所述熒光基團優(yōu)選fam

所述步驟(1)中，將腫瘤標志物的特異性核酸適體與其互補序列cdna反應(yīng)，制成雙鏈探針，優(yōu)選按以下步驟操作：取2μl濃度為100μm的特異性核酸適體溶液與2μl濃度為100μm的互補序列cdna溶液，加入18μl的緩沖溶液后進行充分雜交形成雙鏈探針。一般在室溫下反應(yīng)，反應(yīng)時間通常為10～30分鐘；所述緩沖溶液為25mmtris，ph8.2，0.3mnacl。

所述步驟(2)中，向雙鏈探針中加入待測腫瘤標志物靶分子，充分反應(yīng)，優(yōu)選按以下步驟操作：向雙鏈探針溶液中加入2μl濃度為0.01-1mm的待測腫瘤標志物靶分子溶液，室溫下充分反應(yīng)。反應(yīng)時間通常為30～60分鐘。

進一步，所述步驟(2)中，取實驗組、空白組、對照組加入納米金，優(yōu)選按以下方法操作：分別取2μl的實驗組、空白組、對照組溶液，加入10-100μl的納米金溶液，用緩沖溶液補足總體積0.2ml后，記錄三組的熒光光譜。所述納米金溶液的濃度優(yōu)選1～5nm更優(yōu)選3.5nm。

本發(fā)明的基本原理是：利用納米金對不同結(jié)構(gòu)dna的吸附作用不同，以及納米金高效猝滅熒光的性質(zhì)來實現(xiàn)對靶物質(zhì)的檢測。首先設(shè)計任意靶的特異性dna-熒光標記cdna雙鏈作為捕獲探針，加入靶后釋放出的熒光標記cdna以單鏈形式存在，靶與特異性dna形成二級結(jié)構(gòu)。由于單鏈dna可以通過表面氨基吸附到納米金顆粒表面，因此cdna的熒光被納米金猝滅。而雙鏈dna和其它剛性的二級結(jié)構(gòu)均不能吸附到納米金表面，因此雙鏈的熒光沒有明顯降低。這種雙鏈探針，改變了目前所使用的單鏈探針依賴于探針本身結(jié)構(gòu)變化提供信號的檢測模式，建立了一種通用的工作模式，即通過釋放出的cdna單鏈與納米金的相互作用來進行檢測，從而擴大了其應(yīng)用范圍。利用這種方法可以很方便地實現(xiàn)對靶分子的快速、靈敏、選擇性檢測。

本發(fā)明利用上述原理能夠?qū)崿F(xiàn)對前列腺特異性抗原(psa)、癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白(afp)、上皮細胞粘附分子(epcam)等的快速檢測。

附圖說明

圖1本發(fā)明檢測反應(yīng)原理圖。

圖2實施例1的實驗組、空白組、對照組1、對照組2加入納米金后的的熒光光譜圖。

具體實施方式

熒光光譜在hitachif4500fluorescenespectrophotometer上進行，激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長490-900nm，用200μl石英比色皿，取200μl樣品進行測量。

本發(fā)明中所用納米金顆粒為實驗室自制，參考文獻“grabar,k.c.；freeman,r.g.；hommer,m.b.；natan,m.j.anal.chem.1995,67,735-743.”進行。具體步驟如下，將100ml0.01％的氯金酸溶液加熱到沸騰后，在劇烈攪拌下快速加入3.5ml的檸檬酸三鈉溶液(10mg/ml)并繼續(xù)加熱15-30min，溶液變成酒紅色。停止加熱繼續(xù)攪拌30min后，靜置過夜。然后用0.22μm濾膜進行過濾，并放置在冰箱4℃保存。根據(jù)本方法得到粒徑為13nm左右，濃度為3.5nm的納米金溶液。

本發(fā)明實施例中所用的各種dna序列購自上海生物工程技術(shù)有限公司，如表1所示。

表1序列表

互補序列cdna的5’端標記有熒光基團fam

實施例1納米金-dna相互作用原理對前列腺特異性抗原(psa)的檢測

步驟：分別取2μl濃度為100μm的psa-aptamer溶液與2μl濃度為100μm的cdna溶液，加入18μl的緩沖溶液(25mmtris，ph8.2，0.3mnacl)后進行充分雜交形成雙鏈探針(室溫下反應(yīng)30分鐘)。然后向雜交液中加入2μl濃度為1mm的psa水溶液，室溫下進行充分反應(yīng)。同時以不加psa，加入2μl水的一組作為空白、以及加入2μl1mm的afp(n1)、cea(n2)的兩組分別作為對照組1和對照組2。然后分別取2μl的上述反應(yīng)溶液加入100μl3.5nm的納米金溶液，用緩沖溶液(25mmtris，ph8.2，0.3mnacl)補足總體積0.2ml后，記錄實驗組和對照組的熒光光譜。

結(jié)果：如圖1所示，在含有psa的一組溶液中，psa與雙鏈探針中的psa-aptamer結(jié)合，釋放出fam-cdna單鏈，吸附到納米金表面從而熒光被猝滅70％以上。而沒有加psa的一組，以及n1、n2組，雙鏈探針的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，因此加入納米金后熒光降低幅度較小(小于30％，可能是由于雜交效率而導致溶液中部分fam-cdna以單鏈形式存在)。利用此法最低可以檢測到fmol數(shù)量級的psa。

實施例2納米金-dna相互作用原理對癌胚抗原(cea)的檢測

步驟：分別取2μl濃度為100μm的cea-aptamer溶液與2μl濃度為100μm的cdna溶液，加入18μl的緩沖溶液(25mmtris，ph8.2，0.3mnacl)后進行充分雜交形成雙鏈探針(室溫下反應(yīng)30分鐘)。然后向雜交液中加入2μl濃度為0.1mm的cea水溶液，室溫下進行充分反應(yīng)。同時以不加cea，加入2μl水的一組作為空白、以及加入2μl1mm的psa、afp的兩組作為對照。然后分別取2μl的上述反應(yīng)溶液加入10μl3.5nm的納米金溶液，用緩沖溶液補足總體積0.2ml后，記錄實驗組和對照組的熒光光譜。

結(jié)果：在含有cea的一組溶液中，cea與雙鏈探針中的cea-aptamer結(jié)合，釋放出fam-cdna單鏈，吸附到納米金表面從而熒光被猝滅70％以上。而沒有加cea的一組，以及psa、afp組，雙鏈探針的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，因此加入納米金后熒光降低幅度較小(小于30％，可能是由于雜交效率而導致溶液中部分fam-cdna以單鏈形式存在)。利用此法最低可以檢測到fmol數(shù)量級的cea。

實施例3納米金-dna相互作用原理對甲胎蛋白(afp)的檢測

步驟：分別取2μl濃度為100μm的afp-aptamer溶液與2μl濃度為100μm的cdna溶液，加入18μl的緩沖溶液(20mmtris-乙酸，ph7.4，140mmnacl，1mmcacl2，1mmmgcl2)后進行充分雜交形成雙鏈探針(室溫下反應(yīng)30分鐘)。然后向雜交液中加入2μl濃度為0.05mm的afp的水溶液，室溫下進行充分反應(yīng)。同時以不加afp，加入2μl水的一組作為空白實驗。以及加入2μl1mm的bsa的一組作為對照。然后分別取2μl的上述反應(yīng)溶液加入50μl3.5nm的納米金溶液，用緩沖溶液補足總體積0.2ml后，記錄實驗組和對照組的熒光光譜。

結(jié)果：在含有afp的一組溶液中，afp與雙鏈探針中的afp-aptamer結(jié)合，釋放出fam-cdna單鏈，吸附到納米金表面從而熒光被猝滅70％以上。而沒有加afp的一組，以及bsa組，雙鏈探針的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，因此加入納米金后熒光降低幅度較小(小于30％，可能是由于雜交效率而導致溶液中部分fam-cdna以單鏈形式存在)。利用此法最低可以檢測到fmol數(shù)量級的afp。

實施例4納米金-dna相互作用原理對上皮細胞粘附分子(epcam)的檢測

步驟：分別取2μl濃度為100μm的epcam-aptamer溶液與2μl濃度為100μm的cdna溶液，加入18μl的緩沖溶液(10mmpb，ph7.0，0.2mnacl)后進行充分雜交形成雙鏈探針(室溫下反應(yīng)30分鐘)。然后向雜交液中加入2μl濃度為1mm的epcam的水溶液，室溫下進行充分反應(yīng)。同時以不加epcam，加入2μl水的一組作為空白實驗。以及加入2μl1mm的bsa的一組作為對照。然后分別取2μl的上述反應(yīng)溶液加入100μl3.5nm的納米金溶液，用緩沖溶液補足總體積0.2ml后，記錄實驗組和對照組的熒光光譜。

結(jié)果：在含有epcam的一組溶液中，epcam與雙鏈探針中的epcam-aptamer結(jié)合，釋放出fam-cdna單鏈，吸附到納米金表面從而熒光被猝滅70％以上。而沒有加epcam的一組，以及bsa組，雙鏈探針的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，因此加入納米金后熒光降低幅度較小(小于30％，可能是由于雜交效率而導致溶液中部分fam-cdna以單鏈形式存在)。利用此法最低可以檢測到fmol數(shù)量級的epcam。

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<110>紹興康知生物科技有限公司

<120>一種檢測腫瘤標志物的方法

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