本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種羊多抗血清特異性抗體的純化方法。
背景技術(shù)：
抗血清為含有某一類具有特異免疫功能的抗體分子的血清，一般為動(dòng)物被人工注射某類抗原后制備的動(dòng)物血清。一種抗原能否引起抗體生成反應(yīng)，一方面取決于抗原分子表面有無抗原決定簇（antigenicdeterminant），另一方面取決于機(jī)體的免疫狀態(tài)，當(dāng)具備以上兩個(gè)條件后，抗體生成將遵循抗體生成的一般規(guī)律——初次反應(yīng)和再次反應(yīng)?？乖姆N類繁多，包括天然的蛋白質(zhì)抗原和細(xì)胞性抗原、合成性抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫動(dòng)物具有不同的特殊性。一般完全抗原免疫動(dòng)物需加用佐劑，尤其在使用可溶性抗原時(shí)，以期得到高效價(jià)的抗血清；合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物質(zhì)需先通過人工的方法與蛋白質(zhì)載體連接后再與佐劑混合免疫動(dòng)物，方可獲得理想的免疫效果。使用佐劑后可增加抗原的免疫原性和延長抗原在機(jī)體內(nèi)存留的時(shí)間，從而改變了抗原原有的免疫原性。
動(dòng)物免疫系統(tǒng)是動(dòng)物在種系發(fā)生和個(gè)體發(fā)育過程中逐漸進(jìn)化和完善起來的，是機(jī)體執(zhí)行免疫功能的組織機(jī)構(gòu)，是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。動(dòng)物免疫系統(tǒng)是由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成的。
制備抗體的傳統(tǒng)方法是用純制的抗原多次接種于適當(dāng)?shù)某赡杲】祫?dòng)物，則激其產(chǎn)生免疫應(yīng)答，血清中含有大量特異性抗體，又稱抗血清或免疫血清。
目前，抗血清特異性抗體的純化方法主要采用離心分離法、鹽析法和層析法中任一種，每種方法都存在缺陷，比如離心分離法包括差速離心和梯度離心，二者操作過程比較復(fù)雜，差速離心是要在低速與高速交替進(jìn)行，離心的對(duì)象是大小差別較大的顆粒；梯度離心要先進(jìn)行前處理，然后等梯度形成后再離心，時(shí)間較長。鹽析法會(huì)受到蛋白質(zhì)濃度、ph值、離子強(qiáng)度、溫度的影響，因此效果不好。層析法根據(jù)其原理不同可分為離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析；這種方法是目前提取物純度較高的方法，但是操作復(fù)雜，適應(yīng)性差。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、能提高提取物純度的羊多抗血清特異性抗體的純化方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
一種羊多抗血清特異性抗體的純化方法，該方法包括以下步驟：
1）鹽析法：用辛酸、硫酸銨三步沉淀法，將羊多抗血清中的特異性抗體全部提?。?/p>
2）蛋白g柱純化：取鹽析后的羊多抗血清特異性抗體，用結(jié)合緩沖液稀釋，過濾，加入g柱中，收集流穿液，用結(jié)合緩沖液加入g柱中，待全部流出，加洗脫緩沖液，同時(shí)收集洗脫液；即得到純化后的羊多抗血清特異性抗體。
進(jìn)一步地，步驟1）鹽析法的具體步驟如下；
（11）羊多抗血清用4倍體積乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋，用0.1mnaoh調(diào)至ph4.5；
（12）室溫下滴加辛酸，攪拌30min，按每升溶液滴加25ml辛酸的比例滴加；
（13）冷凍高速離心機(jī)離心，收集上清夜，棄去沉淀；
（14）過濾上清液；
（15）按上清液體積的l/10加入10×pbs（磷酸鹽緩沖溶液，0.1m），用5mnaoh調(diào)至ph7.4；
（16）按每升溶液加277g硫酸銨，攪拌30min；
（17）冷凍高速離心機(jī)離心，棄去上清液，收集沉淀；
（18）沉淀用透析液溶解，透析脫鹽。
作為鹽析法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟（13）中的離心轉(zhuǎn)速為10000rpm，離心30min。
作為鹽析法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟（17）中的離心轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心15min。
進(jìn)一步地，步驟2）中，蛋白g柱純化法的步驟為：
（21）血清處理：取羊多抗血清，用結(jié)合buffer（緩沖液）1:1稀釋，充分混勻，濾膜過濾；
（22）柱子平衡：用結(jié)合buffer加入柱中，流至液面與膠面平；
（23）吸附：處理好的抗血清加入柱中，收集流穿液；
（24）洗雜：用結(jié)合buffer加入柱中，待全部流出；
（25）洗脫抗體：加洗脫buffer，同時(shí)用離心管收集洗脫液，前1.5ml丟棄，收集后續(xù)全部洗脫液。
作為蛋白g柱純化法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2）中，
結(jié)合緩沖液為：10mmpbs含nan30.01%，ph7.2—7.4。
洗脫緩沖液為：10mmnah2po4，150mmnacl含nan30.01%，用鹽酸調(diào)至ph2.8±0.04，其中所用鹽酸為5mhcl。
作為蛋白g柱純化法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2）中，過濾采用0.22nm的濾膜過濾。
有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明操作簡單，提取物純度能提高20%。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1：一種羊多抗血清特異性抗體的純化方法，該方法包括以下步驟：
第一步，鹽析法：用辛酸、硫酸銨三步沉淀法，將羊多抗血清中的特異性抗體全部提取；具體步驟如下；
（11）羊多抗血清用4倍體積乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋，用0.1mnaoh調(diào)至ph4.5；
（12）室溫下滴加辛酸，攪拌30min，按每升溶液滴加25ml辛酸的比例滴加；
（13）冷凍高速離心機(jī)離心，收集上清夜，棄去沉淀；離心轉(zhuǎn)速為10000rpm，離心30min;
（14）過濾上清液；
（15）按上清液體積的l/10加入10×pbs，用5mnaoh調(diào)至ph7.4；
（16）按每升溶液加277g硫酸銨，攪拌30min；
（17）冷凍高速離心機(jī)離心，棄去上清液，收集沉淀；離心轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心15min;
（18）沉淀用透析液溶解，透析脫鹽。透析液購買自天津市標(biāo)準(zhǔn)生物制劑有限公司。
第二步，蛋白g柱純化：
具體步驟如下：
（21）血清處理：取鹽析后的羊多抗血清，用結(jié)合buffer（緩沖液）1:1稀釋，充分混勻，采用0.22nm的濾膜過濾；結(jié)合緩沖液為：10mmpbs含nan30.01%(重量百分比)，ph7.2—7.4。
（22）柱子平衡：用結(jié)合buffer加入柱中，流至液面與膠面平；
（23）吸附：將步驟（21）處理好的抗血清加入柱中，收集流穿液；
（24）洗雜：用結(jié)合buffer加入柱中，待全部流出；
（25）洗脫抗體：加洗脫buffer，同時(shí)用離心管收集洗脫液，前1.5ml丟棄，收集后續(xù)全部洗脫液。即得到純化后的羊多抗血清特異性抗體。洗脫buffer為：10mmnah2po4，150mmnacl含nan30.01%(重量百分比)，用鹽酸調(diào)至ph2.8±0.04，其中所用鹽酸為5mhcl。
下面通過對(duì)純化后的crp羊多抗、apoa1羊多抗、apob羊多抗進(jìn)行檢測，檢測條件：od280，免疫雙向擴(kuò)散，生化儀，sds-page；結(jié)果如下：
（一）crp羊多抗優(yōu)勢(shì)：
1、將常規(guī)的低值檢測范圍從1mg/l提高至0.3mg/l，將高值范圍從150mg/l提高至500mg/l，為全量程crp檢測試劑提供了高質(zhì)的原料抗體；
2、特異性高，全量程定標(biāo)樣條法曲線平滑，達(dá)到定標(biāo)接受標(biāo)準(zhǔn)；
3、親和力高，將原料抗體稀釋10倍測定，測量25mg/l的被測物時(shí)，吸光度變化值（?a）0.02～0.20之間；
4、該法純化各批次羊多抗批間差小，提供的三批次純化羊多抗測定數(shù)據(jù)相對(duì)偏差≤10%；
（二）apob羊多抗優(yōu)勢(shì)：
1、純化羊多抗線性范圍為（0.3-2.0）g/l，在此線性范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)r≥0.990；
2、批間準(zhǔn)確度：相對(duì)偏差≤10%；
3、分析靈敏度：測量0.60g/l的被測物時(shí)，吸光度之差（?a）在0.10～0.40之間。
（三）apoa1羊多抗優(yōu)勢(shì)：
1、純化羊多抗線性范圍為（0.3-2.4）g/l，在此線性范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)r≥0.990；
2、批間準(zhǔn)確度：相對(duì)偏差≤10%；
3、分析靈敏度：測量1.20g/l的被測物時(shí)，吸光度之差（?a）在0.20～0.40之間。
本發(fā)明按照上述實(shí)施例進(jìn)行了說明，應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)施例不以任何形式限定本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。