本發(fā)明涉及生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體地說,涉及eml4-alk融合基因突變的檢測(cè)。
背景技術(shù):
肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其5年生存率僅為16.8%。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)癌癥globocan數(shù)據(jù)庫,2012年我國新發(fā)肺癌患者達(dá)65.28萬,居所有惡性腫瘤之首,約占全球1/3。
基于組織病理學(xué)結(jié)果,肺癌可以劃分為小細(xì)胞肺癌(sclc)和非小細(xì)胞肺癌(nsclc),其中80%為nsclc。多數(shù)(>70%)肺癌患者在確診時(shí)已處晚期,全身化療是主要治療選擇。近年來,隨著分子醫(yī)學(xué)的進(jìn)展和靶向藥物的不斷涌現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌的治療已進(jìn)入到個(gè)體化分子靶向"精準(zhǔn)"治療的時(shí)代。間變性淋巴瘤激酶(alk)融合基因型肺癌已成為繼表皮生長因子(egfr)突變型肺癌之后的又一個(gè)肺癌分子亞型,具有明確的分子靶點(diǎn)、靶點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)及上市的靶向藥物。
肺癌中alk變異主要為alk基因與其他基因發(fā)生斷裂重排。其中,棘皮動(dòng)物微管結(jié)合樣蛋白4(eml4)-alk融合基因變異是其主要類型。國內(nèi)外大量的研究數(shù)據(jù)顯示,發(fā)生alk重排的非小細(xì)胞肺癌患者占3%~7%。eml4和alk兩個(gè)基因分別位于人類2號(hào)染色體的p21和p23帶,相隔約12mb。eml4與微管形成密切相關(guān),alk在腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要的調(diào)節(jié)作用。這兩個(gè)基因片段的倒位融合[inv(2)(p21p23)]可以讓組織表達(dá)新的eml4-alk融合蛋白,形成非配體依賴性二聚體引起組成性的alk激活。alk信號(hào)可通過激活ras-mek-erk,jak3-stat3和pi3k-akt信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞增殖和生成。
克唑替尼是一種atp競(jìng)爭性酪氨酸激酶抑制劑,既可特異性靶向抑制alk,也可抑制c-met和ros1等信號(hào)通路??诉蛱婺岱謩e于2011年和2013年被美國食品與藥品管理局(fda)和中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局(cfda)批準(zhǔn)上市,用于治療eml4-alk表達(dá)的局部晚期或轉(zhuǎn)移性nsclc患者。臨床試驗(yàn)顯示對(duì)于alk陽性的晚期非小細(xì)胞肺癌患者,克唑替尼的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療,一線單藥治療患者的中位無進(jìn)展生存期(pfs)為10.9個(gè)月,有效率高達(dá)74%,二線單藥治療患者的中位pfs為7.7個(gè)月,有效率達(dá)到65.3%。2012年,據(jù)美國國家綜合癌癥網(wǎng)(nccn)nsclc臨床指南推薦,晚期nsclc患者開始治療前應(yīng)進(jìn)行eml4-alk檢測(cè),并建議陽性患者首先接受克唑替尼治療。
大約40%的alk陽性nsclc患者對(duì)克唑替尼原發(fā)耐藥。新一代alk抑制劑色瑞替尼的i期臨床研究結(jié)果顯示其對(duì)克唑替尼耐藥及存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移病灶的患者具有較好的療效?;谝陨狭钊斯奈璧脑囼?yàn)數(shù)據(jù),2014年4月,fda批準(zhǔn)色瑞替尼用于治療alk陽性、經(jīng)克唑替尼治療疾病進(jìn)展或不能耐受的轉(zhuǎn)移性nsclc患者。alectinib是一種強(qiáng)效選擇性alk抑制劑,其ⅱ期臨床研究結(jié)果顯示,46例alk陽性未經(jīng)克唑替尼治療患者的orr為93.5%。2014年7月aectinib在日本獲批使用。
目前針對(duì)alk融合基因檢測(cè)的常用方法有熒光原位雜交(fish)、免疫組織化學(xué)法(ihc)和熒光pcr方法。fish價(jià)格昂貴,操作規(guī)范要求較高,且不能區(qū)分alk融合類型(fusionvariants);ihc簡便易行,但陽性標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,也不能區(qū)分alk融合類型。
cn102719525a公開了用于檢測(cè)eml4-alk融合基因突變的引物、探針及檢測(cè)試劑盒,利用熒光pcr技術(shù)可以一次同時(shí)檢測(cè)eml4與alk基因的9種融合突變。隨著時(shí)間推移,新的eml4與alk基因的融合突變類型逐漸被發(fā)現(xiàn),cn102719525a檢測(cè)的9種eml4-alk融合突變已經(jīng)不能滿足臨床需求。且其公開的方法中熒光pcr檢測(cè)需要90分鐘,逆轉(zhuǎn)錄pcr另需要65分鐘,整個(gè)步驟所需時(shí)間較長。同時(shí)為保證臨床試驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,最好在產(chǎn)品中加入防污染體系,同時(shí)引入空白對(duì)照,對(duì)檢測(cè)試劑及環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè),防止假陽性結(jié)果的產(chǎn)生,這一方面cn102719525a中未有提及。
因此需要有新的eml4-alk檢測(cè)方法來滿足以下要求:1)能涵蓋更多eml4-alk融合突變類型;2)能節(jié)約檢測(cè)時(shí)間;3)體系設(shè)計(jì)中增加防污染體系及空白對(duì)照,防止假陽性結(jié)果的產(chǎn)生,保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題,本發(fā)明的目的是提供eml4-alk融合基因突變的檢測(cè)引物、探針及檢測(cè)試劑盒。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
第一方面,本發(fā)明提供了用于檢測(cè)eml4-alk基因融合突變的引物組合,包括seqidno:1-seqidno:14所示的序列。該引物組合可以特異性識(shí)別13種eml4-alk融合突變類型。
不僅如此,本發(fā)明還提供了與所述引物組合配合使用的特異性探針,其序列如seqidno:15所示,其5’端修飾有fam或vic,3’端修飾有nfq-mgb。
第二方面,本發(fā)明提供了用于檢測(cè)eml4-alk基因融合突變的試劑盒,其含有前述的引物組合與特異性探針。
為了提高所述試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確度,所述試劑盒還含有質(zhì)控系統(tǒng),陽性對(duì)照液和空白對(duì)照液。
所述質(zhì)控系統(tǒng)包含質(zhì)控引物和質(zhì)控探針,質(zhì)控引物的序列如seqidno:16和seqidno:17所示,所述質(zhì)控探針的序列如seqidno:18所示,所述質(zhì)控探針的5’端修飾有fam或vic,3’端修飾有nfq-mgb。
所述陽性對(duì)照液為含有4種質(zhì)粒dna的混合液,所述4種質(zhì)粒dna分別含有eml4-alk-m1、eml4-alk-m5、eml4-alk-m7和b2m序列,所述空白對(duì)照為tris-hcl緩沖液。
進(jìn)一步地,所述試劑盒還包括本領(lǐng)域其他熒光pcr試劑盒的必要成分,如pcr緩沖液,hotstarttaq酶和ung酶。
所述試劑盒的使用方法包括以下步驟:
(1)提取檢測(cè)樣本中的rna,檢測(cè)樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織或胸腔液;
(2)將提取的rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna,以cdna為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng);
(3)根據(jù)熒光pcr擴(kuò)增儀顯示的ct值判斷檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)反應(yīng)體系的fam和vic/hex熒光強(qiáng)度,以fam達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)ct值作為陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn),ct值大于等于38:陰性;ct值小于38:陽性。
其中,pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系如下:
rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna的方法涉及反轉(zhuǎn)錄體系以及如下操作步驟:
反轉(zhuǎn)錄體系包括如下成分:
逆轉(zhuǎn)錄混合液(含逆轉(zhuǎn)錄酶)2μl
rna3μl
加dnase/rnase-freeddh2o10μl。
操作步驟為:
a)將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液混勻,置于冰上,取2μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液加入無菌無酶的離心管中,混勻。
b)加入待測(cè)樣品rna3μl,rna總量在0.1~5μg范圍內(nèi),補(bǔ)水至10μl。
c)37℃保溫15分鐘。
d)85℃保溫5秒后冰上冷卻,得到cdna模板。
本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品,涉及到的操作如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。
本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明采用arms引物特異性識(shí)別13種eml4-alk融合突變類型,基于taqman探針法收集熒光信號(hào),特異性得到很好保障。本發(fā)明的試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)建立了實(shí)時(shí)熒光pcr體系,可同時(shí)檢測(cè)eml4-alk基因13種融合突變,與cn102719525a發(fā)明中3個(gè)反應(yīng)體系檢測(cè)9種突變類型相比,本發(fā)明需要在一個(gè)反應(yīng)體系中涵蓋更多檢測(cè)位點(diǎn),對(duì)引物和探針的設(shè)計(jì)要求更高;(2)靈敏度高,5拷貝的突變可以檢出;(3)僅使用14條引物、1條探針便實(shí)現(xiàn)13個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè),而cn102719525a中使用14條引物、5條探針實(shí)現(xiàn)9個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè),相比較而言,本發(fā)明的原材料組分更少,生產(chǎn)成本更低;(4)檢測(cè)速度快,本發(fā)明中逆轉(zhuǎn)錄pcr僅需15分鐘,熒光pcr僅需60分鐘,整個(gè)逆轉(zhuǎn)錄pcr及熒光pcr檢測(cè)過程只需要80分鐘即可完成;(5)樣本檢測(cè)范圍廣,樣本可以為新鮮病理組織,石蠟包埋組織或胸腔液;(6)本發(fā)明體系中引入ung酶-dutp防污染體系及空白對(duì)照系統(tǒng),能更好的防止假陽性結(jié)果的產(chǎn)生,確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
附圖說明
圖1為本發(fā)明非融合突變樣本檢測(cè)示意圖。
圖2為本發(fā)明融合突變樣本檢測(cè)示意圖。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的,并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下,可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1
本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的,一種用于eml4-alk融合基因檢測(cè)的試劑盒,該試劑盒包括pcr緩沖液,13組特異性引物,1條特異性探針和質(zhì)控系統(tǒng),hotstarttaq酶,ung酶。
所述pcr緩沖液中含有1.0~5.0mm的mgcl2,1.0~5.0mm的dntps,即datp、dutp、dgtp和dctp各1.0~5.0mm。
所述13組特異性引物序列的正向引物為seqidno:1-13,反向引物序列為seqidno:14。其中seqidno:1-13為arms引物,可以特異性識(shí)別13種對(duì)應(yīng)的eml4-alk融合突變類型,其中seqidno:14是普通pcr引物。13條arms引物分別在3’模板堿基與待擴(kuò)增類型的堿基配對(duì),同時(shí)在其3’末端倒數(shù)第2-3位增加一個(gè)或者兩個(gè)堿基錯(cuò)配,以增強(qiáng)特異性。
各引物序列列舉如下:
eml4-alk-m1-f:cctgggaaaggacctaaagagt(seqidno:1);
eml4-alk-m2-f:aactcgggagactatgaaatattgtactag(seqidno:2);
eml4-alk-m3-f:cataaagatgtcatcatcaaccaagtct(seqidno:3);
eml4-alk-m4-f:tcgcgaaaaaaacagccaagtat(seqidno:4);
eml4-alk-m5-f:gaaagagaaatagagatatgctggatgtg(seqidno:5);
eml4-alk-m6-f:cgaggaacatttaatgatgggtg(seqidno:6);
eml4-alk-m7-f:cagtgaaaaaatcagtctcaagtaaagag(seqidno:7);
eml4-alk-m8-f:tgaccacccacctgcagtct(seqidno:8);
eml4-alk-m9-f:ctctgtgatgcgctactcaatagtct(seqidno:9);
eml4-alk-m10-f:tgaccacccacctgcagag(seqidno:10);
eml4-alk-m11-f:atgatctgaatcctgaaagagaaatagatc(seqidno:11);
eml4-alk-m12-f:gaacgcactcaggcagtcc(seqidno:12);
eml4-alk-m13-f:cattaaaaaatgtggaatgctgcta(seqidno:13);
eml4-alk-m-r:ctccatctgcatggcttgc(seqidno:14)。
所述特異性探針5’端修飾有fam或vic,3’端修飾有非熒光淬滅基團(tuán)nfq(non-fluorescentquencher),該基團(tuán)本身不產(chǎn)生熒光,因此可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度,同時(shí)該特異性探針上還連接有mgb修飾基團(tuán),可以將該探針的tm值提高10℃左右,因此同樣的tm值,mgb探針可以比普通taqman探針設(shè)計(jì)的更短,特異性更強(qiáng)。
優(yōu)選地,所述1條特異性探針序列為seqidno:15,可特異性識(shí)別alk基因20號(hào)外顯子上的一段序列。
探針序列列舉如下:
eml4-alk-m-p:cgccggaagcaccag(seqidno:15)。
本發(fā)明實(shí)施例中,使用質(zhì)控系統(tǒng)監(jiān)測(cè)樣本質(zhì)量。rna容易降解,對(duì)樣本制備與保存、rna提取及逆轉(zhuǎn)錄過程要求較高。采用表達(dá)量穩(wěn)定的基因構(gòu)建質(zhì)控系統(tǒng),可以有效監(jiān)測(cè)樣本質(zhì)量,避免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因此本發(fā)明實(shí)施例中采用質(zhì)控系統(tǒng)來消除上述隱患,保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。該質(zhì)控系統(tǒng)包含質(zhì)控引物和質(zhì)控探針,本發(fā)明實(shí)施例中可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它質(zhì)控系統(tǒng)。優(yōu)選地,所述質(zhì)控系統(tǒng)包含質(zhì)控引物和質(zhì)控探針。質(zhì)控引物序列為seqidno:16和seqidno:17,所述質(zhì)控探針序列為seqidno:18,所述質(zhì)控探針5’端修飾有fam或vic,3’端修飾有nfq-mgb。
優(yōu)選地,本發(fā)明實(shí)施例中的質(zhì)控系統(tǒng)針對(duì)人b2m基因設(shè)計(jì)。其中包含的質(zhì)控引物序列如下所示:
b2m-f:atgagtatgcctgccgtgtg(seqidno:16);
b2m-r:gcttacatgtctcgatcccact(seqidno:17)。
本發(fā)明實(shí)施例中的質(zhì)控探針5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),如fam、vic等,3′端標(biāo)記有不發(fā)光熒光淬滅基團(tuán),如nfq-mgb等。當(dāng)探針完整的時(shí)候,報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收,儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著pcr的進(jìn)行,taq酶在dna鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針,其5′→3′外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷,報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán),產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度就代表了模板dna的拷貝數(shù)。
優(yōu)選地,所述質(zhì)控探針為:
b2m-p:ccatgtgactttgtcacagc(seqidno:18)。
優(yōu)選地,本發(fā)明實(shí)施例中的酶溶液中含有taq酶,其為pcr反應(yīng)所必需的且該酶溶液還含有ung酶,其中ung(uracil-n-glycosylase)酶為尿嘧啶-n-糖基化酶,其特點(diǎn)是最佳活性溫度為50℃,95℃滅活,其作用原理是選擇性水解斷裂含有du的雙鏈或單鏈dna中的尿嘧啶糖苷鍵,形成的有缺失堿基的dna鏈。在pcr反應(yīng)中,使用ung酶可預(yù)防非特異性pcr擴(kuò)增和污染。
優(yōu)選地,本發(fā)明實(shí)施例中的檢測(cè)試劑盒還包括陽性對(duì)照液和空白對(duì)照液,設(shè)置陽性對(duì)照和空白對(duì)照可監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)定量pcr反應(yīng)的正常進(jìn)行,所述陽性對(duì)照液含有4種質(zhì)粒dna混合液,所述4種質(zhì)粒dna分別含有eml4-alk-m1、eml4-alk-m5、eml4-alk-m7和b2m序列,該質(zhì)粒可為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的質(zhì)粒,這4種質(zhì)粒濃度相同,均為2000copies/μl;所述空白對(duì)照液為tris-hcl(10mm)緩沖液。
本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種eml4-alk融合基因的檢測(cè)方法,該檢測(cè)方法包括以下步驟:
(1)設(shè)計(jì)并篩選特異性擴(kuò)增與檢測(cè)eml4-alk融合基因的引物組合和探針組合;制備本發(fā)明的eml4-alk融合基因檢測(cè)試劑盒。
(2)獲得待測(cè)樣品總rna;
(3)將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna;
(3)以cdna為模板進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增:每個(gè)樣本分四個(gè)反應(yīng)管檢測(cè)13種eml4-alk融合突變類型,將上述獲得的cdna先后取相同的量加入所述四個(gè)反應(yīng)管中并同時(shí)進(jìn)行pcr反應(yīng)。
優(yōu)選地,以25μl反應(yīng)體系為例,向反應(yīng)管中加入待檢測(cè)樣品后得到的混合物中各組分終濃度及含量如下:
上述體系僅為例證性,在實(shí)際應(yīng)用中可以按照比例擴(kuò)大或縮小該混合物體積及其中各組分含量。
具體地,在上述25μl反應(yīng)體系中,所述各對(duì)引物包括上述步驟(1)中的13對(duì)特異性引物,1對(duì)質(zhì)控引物及質(zhì)控引物,所述各條探針包括上述步驟(1)中的特異性探針,所述樣品為cdna。
具體地,在步驟(3)中的熒光定量pcr反應(yīng)條件為:
37℃處理10分鐘,95℃預(yù)變性5分鐘,
40個(gè)循環(huán):95℃15秒,60℃35秒并收集熒光信號(hào)。
在上述pcr反應(yīng)后,所得結(jié)果按以下步驟進(jìn)行結(jié)果判定:
根據(jù)弱陽性對(duì)照和空白對(duì)照,對(duì)試劑盒有效性判定:
根據(jù)質(zhì)控體系結(jié)果,進(jìn)行樣本有效性的判定,質(zhì)控pcr反應(yīng)液:fam通道ct值≤30,樣本rna質(zhì)量較好,加量適中。
對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定,確定樣本是否存在融合。
樣本檢測(cè)ct值≥38或無ct值,則該樣本為非融合突變或?yàn)楸驹噭┖袡z測(cè)范圍外融合突變;
樣本檢測(cè)ct值<38,則樣本為該反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的融合突變。
本發(fā)明的檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果真實(shí)可信的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)該檢測(cè)方法操作簡單快速,能在80分鐘內(nèi)完成檢測(cè),并且結(jié)果判讀簡單客觀,便于分析。
以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例1
制備本發(fā)明的eml4-alk融合基因檢測(cè)試劑盒,包括以下步驟:
1、引物及探針合成:
設(shè)計(jì)并合成13組特異性引物,其中正向引物為seqidno:1-13,公用反向引物為seqidno:14,特異性探針為seqidno:15,探針5’端標(biāo)記fam熒光基團(tuán),3’端標(biāo)記nfq-mgb不發(fā)光淬滅基團(tuán)。將引物、探針分別制備成100μm的母液儲(chǔ)存。
2、制備質(zhì)控系統(tǒng):
設(shè)計(jì)并合成針對(duì)人b2m基因的1對(duì)質(zhì)控引物,該引物對(duì)序列為seqidno:16和seqidno:17;設(shè)計(jì)并合成質(zhì)控探針,該探針為seqidno:18。將該質(zhì)控引物和探針分別配制成100μm的母液儲(chǔ)存。
3、制備其他試劑:
制備pcr緩沖液,其中含有1.0mm的mgcl2,datp、dutp、dgtp和dctp各1.0mm;制備酶混合液,其中含有taq酶0.5×103u/ml,ung酶0.1×103u/ml。
4、制備陽性對(duì)照液和空白對(duì)照液,該陽性對(duì)照液中含有4種質(zhì)粒dna混合液,所述4種質(zhì)粒dna分別含有eml4-alk-m1、eml4-alk-m5、eml4-alk-m7和b2m序列,該質(zhì)粒的選擇及設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知,均為2000copies/μl;該空白對(duì)照液為tris-hcl(10mm)緩沖液。
5、pcr反應(yīng)液配制:
按照下表進(jìn)行四個(gè)不同體系pcr反應(yīng)液配制
表1:pcr反應(yīng)液配制
6、組裝試劑盒:
試劑盒中包含4管pcr反應(yīng)液,根據(jù)pcr反應(yīng)體系各成分使用量,計(jì)算20人份規(guī)格各成分使用量,配制試劑盒各管中成分并組裝。
實(shí)施例2
用實(shí)施例1制備的eml4-alk融合基因檢測(cè)試劑盒對(duì)待側(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。
本實(shí)施例中收集300例肺癌患者的ffpe樣本,從其中提取rna,逆轉(zhuǎn)錄成cdna后,用實(shí)施例1中得到的eml4-alk融合基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)待檢樣品的eml4-alk融合突變情況。
1、ffpe樣本rna提取
(a)取上述各肺癌樣本,分別加入1ml二甲苯,混勻,室溫下13000rpm離心2分鐘,棄上清液,加入1ml無水乙醇到沉淀中,震蕩混勻(去除二甲苯),室溫下13000rpm離心2分鐘棄上清液,打開離心管蓋,37℃放置10分鐘,使殘留的乙醇蒸發(fā)干凈;
(b)在離心管中加240μlbufferpkd及10μl蛋白酶k,震蕩混勻,56℃孵育15分鐘,80℃孵育15分鐘,冰上孵育3分鐘,然后13,000rpm離心15分鐘,將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管。往上清中加入25μldnaseboosterbuffer和10μldnasei原液,室溫孵育15分鐘,后加入500μlbufferrbc,混勻;
(c)往上清液加入1200μl無水乙醇,混勻,取700μl樣品包括前面生成的沉淀轉(zhuǎn)移到帶有2ml收集管的rnaminelute離心柱里,大于10,000rpm離心15s,棄廢液,重復(fù)上一步直到樣品轉(zhuǎn)移到rnaminelute離心柱里。
(d)打開蓋子加入500μlbufferrpe,蓋緊蓋子,大于10000rpm離心2分鐘,重復(fù)本步驟一次后,將柱子轉(zhuǎn)移到收集管中,向吸附膜中間部位滴加14-30μlrnase-freewater,離心1分鐘后收集rna。
2、rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna:
用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)rna提取質(zhì)量及濃度,確定其濃度od260/od280為1.8-2.0。取0.1~5μg的rna作為其cdna合成的模板,采用武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司的試劑盒合成cdna,cdna合成體系如下:
逆轉(zhuǎn)錄混合液(含逆轉(zhuǎn)錄酶)2μl
rna3μl
加dnase/rnase-freeddh2o10μl。
(a)將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液混勻,置于冰上,取2μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液加入無菌無酶的離心管中,混勻。
(b)加入待測(cè)樣品rna3μl,rna總量在0.1~5μg范圍內(nèi),補(bǔ)水至10μl。
(c)37℃保溫15分鐘。
(d)85℃保溫5秒后冰上冷卻,得到cdna模板。
3、樣本的熒光定量pcr檢測(cè)
取2μl步驟2中得到的cdna,加入四個(gè)反應(yīng)體系中,使反應(yīng)體系總體積均為25μl,并放入熒光定量pcr儀,按如下所示設(shè)置pcr反應(yīng)程序后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng):
95℃5分鐘;
95℃15s,60℃35s,40個(gè)循環(huán);每個(gè)循環(huán)后收集fam和vic/hex的熒光信號(hào)。
4、樣本的檢測(cè)結(jié)果分析:
檢測(cè)fam熒光信號(hào)ct值,根據(jù)熒光pcr擴(kuò)增儀顯示的ct值判斷結(jié)果:檢測(cè)反應(yīng)體系的fam熒光強(qiáng)度,以fam達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)ct值作為陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn),ct值大于等于38:陰性;ct值小于38:陽性。
檢測(cè)結(jié)果表明所檢測(cè)300例肺癌樣本中有23例發(fā)生有eml4-alk融合突變,突變率為7.6%,同時(shí)對(duì)上述所有樣本進(jìn)行ihc對(duì)比檢測(cè),ihc結(jié)果表明突變有23例,兩種檢測(cè)方法的符合率為100%,進(jìn)一步證明了本發(fā)明體系檢測(cè)的準(zhǔn)確性,結(jié)果見表4。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改
進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
表2eml4-alk基因13種融合突變
表3試劑盒的組成
表4臨床樣本檢測(cè)結(jié)果對(duì)比
雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述,但在本發(fā)明基礎(chǔ)上,可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn),這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
序列表
<110>武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司
<120>eml4-alk融合基因突變的檢測(cè)引物、探針及檢測(cè)試劑盒
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