本發(fā)明屬于微生物體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性檢測(cè)弓形蟲核酸的熒光pcr方法和試劑盒，能夠?qū)蜗x的dna進(jìn)行定性檢測(cè)，可以作為有效的檢測(cè)工具。

背景技術(shù)：

弓形蟲病是由剛地弓形蟲(toxoplasmagondii)引起的一種呈世界性分布且嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病。弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，能夠感染人類和絕大多數(shù)的哺乳動(dòng)物。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界約有三分之一成年人感染弓形蟲。絕大多數(shù)受弓形蟲感染的成人并不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的癥狀，但對(duì)于器官移植、惡性腫瘤、艾滋病等免疫缺陷者，以及孕婦等，弓形蟲感染會(huì)導(dǎo)致一系列嚴(yán)重情況。弓形蟲的一生同時(shí)需要終宿主和中間宿主來完成它的有性生殖和無性生殖。貓以及其他貓科動(dòng)物是弓形蟲的終宿主。弓形蟲的主要感染途徑為：一，口腔攝入感染；二，血液傳播感染；三，先天性傳播感染。先天性傳播主要是母嬰傳播。值得注意的是，孕婦在懷孕早期感染弓形蟲、會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎等情況，而在懷孕中后期感染弓形蟲，則會(huì)導(dǎo)致胎兒發(fā)育遲緩，失明，腦炎，神經(jīng)系統(tǒng)障礙等癥狀，是需重點(diǎn)解決的問題。

對(duì)于弓形蟲的檢測(cè)，臨床實(shí)驗(yàn)室多采用血清學(xué)試驗(yàn)，如elisa、ria和ifa等，檢測(cè)特異性抗體。血清弓形蟲-igm陽性證明近期感染己持續(xù)2～4個(gè)月。血清弓形蟲-igg陽性則提示既往感染。由于弓形蟲抗原來源困難，血清學(xué)試驗(yàn)尚難普及，而且某些人群感染病毒后抗體反應(yīng)很弱或不產(chǎn)生抗體，因此僅以抗體檢測(cè)結(jié)果不能準(zhǔn)確判定弓形蟲感染情況，需輔以抗原或核酸檢測(cè)結(jié)果作為診斷和治療的依據(jù)。目前比較成熟的核酸檢測(cè)方法是用熒光pcr方法，該方法克服了常規(guī)pcr法特異性差、易污染、結(jié)果分析操作步驟多等缺點(diǎn)，采用taqman方法或稱雙標(biāo)探針法(熒光淬滅探針或稱fq探針)，即在其5’端和3’端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。靶序列的特異性探針和特異性的pcr引物同時(shí)使用，設(shè)計(jì)的該探針在上下游pcr引物的范圍內(nèi)退火，由三個(gè)寡核苷酸共同結(jié)合于目的基因片段，使其特異性大大增強(qiáng)。在pcr的延伸階段，taqdna聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性將熒光報(bào)告基團(tuán)從探針上切割下來。隨著pcr循環(huán)數(shù)的增加，游離報(bào)告基團(tuán)的數(shù)量不斷的增加，實(shí)時(shí)檢測(cè)從游離熒光基團(tuán)上釋放的熒光信號(hào)，從而對(duì)靶序列進(jìn)行定性分析。該pcr反應(yīng)在封閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，分析結(jié)果也無需開封，因此，避免了pcr產(chǎn)物污染的發(fā)生。

目前，也有熒光pcr方法用于檢測(cè)弓形蟲的報(bào)道，但是開發(fā)更多有效、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)的熒光pcr方法用的引物和探針，并將此引物和探針用于檢測(cè)試劑盒也是本領(lǐng)域追求的目標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性檢測(cè)弓形蟲核酸的熒光pcr方法及試劑盒，該試劑盒具有靈敏、特異、反應(yīng)效率高的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)定性檢測(cè)弓形蟲核酸的目的。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種特異性檢測(cè)弓形蟲核酸的熒光pcr試劑盒，包括特異性引物對(duì)和探針，所述的特異性引物對(duì)為：

正向引物：5’-ccgggtgaaacaatagagagtactg-3’；

反向引物：5’-ggtctacgtcgatggcatga-3’；

所述的探針為：5’-aacgtcgccgctactgcccagtt-3’。

本發(fā)明中，所述的探針的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光素或熒光染料，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。

具體地，所述的報(bào)告熒光素或熒光染料為fam或其它任何可以作為探針標(biāo)記的熒光素或熒光染料；淬滅基團(tuán)為tamra或其它任何可以作為淬滅基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)。

優(yōu)選地，其它任何可以作為探針標(biāo)記的熒光素或熒光染料例如hex、tet、joe、yakimayellow、cy3、cy3.5、cy5、ned、vic、pet、rox、liz、red、texasred；其它任何可以作為淬滅基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)例如dabcyl、bhq1、bhq2。

優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括陽性質(zhì)控品，所述陽性質(zhì)控品含人工合成序列，所述的人工合成序列為人工合成含所述弓形蟲特異性引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的序列。該人工合成序列的內(nèi)容為：

caaactgcaacaactgctctagcgtgttcgtctccattccgtacagtcttcaaaaataca

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根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述的陽性質(zhì)控品是通過在puc57質(zhì)粒載體中插入所述人工合成含所述弓形蟲特異性引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的序列重組制得。

進(jìn)一步地，所述的puc57載體質(zhì)粒的濃度為1ng/μl。

優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括陰性質(zhì)控品，所述陰性質(zhì)控品含有人工合成的人類管家基因gapdh部分片段的特異性序列。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，用于擴(kuò)增所述的人工合成人類管家基因gapdh部分片段的引物對(duì)如下：

正向引物：5’-cgggaaggaaatgaatgg-3’；

反向引物：5’-caaagggcaggagtaaag-3’。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述的陰性質(zhì)控品為插入有所述人類管家基因gapdh的部分片段序列的ptg19-t載體質(zhì)粒。

進(jìn)一步地，所述的ptg19-t載體質(zhì)粒的濃度為1ng/μl。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述陰性質(zhì)控品所含的特異性序列為：

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本發(fā)明中，試劑盒還包括pcr反應(yīng)液，所述的pcr反應(yīng)液包括taq酶、dntp、緩沖液等成分。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種特異性檢測(cè)弓形蟲核酸的熒光pcr方法，所述的熒光pcr方法采用所述的熒光pcr試劑盒。

本發(fā)明根據(jù)弓形蟲b1基因的dna序列設(shè)計(jì)了特異性引物對(duì)和探針，探針采用熒光素標(biāo)記，用熒光pcr儀對(duì)于待測(cè)的樣本進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，分析是否有該病毒核酸片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而達(dá)到檢測(cè)該病毒的目的。

本發(fā)明中，所述的試劑盒的反應(yīng)體系為20μl-50μl，如果是20μl體系，則包括：pcr反應(yīng)液(2x)10μl，正向引物0.5μl(10μmol/ml)，反向引物0.5μl(10μmol/ml)，熒光探針0.5μl(10μmol/ml)，被檢測(cè)物細(xì)胞、組織、體液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4μl，滅菌超純水加至20μl；如果是50μl體系，則包括：pcr反應(yīng)液(2x)25μl，正向引物1.25μl(10μmol/ml)，反向引物1.25μl(10μmol/ml)，熒光探針1.25μl(10μmol/ml)，被檢測(cè)物細(xì)胞、組織、體液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4-10μl，滅菌超純水加至50μl。

采用所述的試劑盒進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增的反應(yīng)時(shí)間和溫度為：50℃，2min1個(gè)循環(huán)(如果pcr反應(yīng)液不含ung酶則省略)；95℃，2-10min(依據(jù)不同來源的pcr反應(yīng)液而定)1個(gè)循環(huán)；95℃，15s，60℃，1min，40個(gè)循環(huán)并收集熒光信號(hào)。

由于上述技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明試劑盒通過對(duì)大量臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，能夠有效檢測(cè)出弓形蟲，大量臨床樣本的檢測(cè)也對(duì)試劑盒的有效性、大規(guī)模使用性提供了保障。

本發(fā)明試劑盒，弓形蟲熒光pcr檢測(cè)的反應(yīng)效率高達(dá)88.5％，具有較高的反應(yīng)效率。

附圖說明

圖1為弓形蟲熒光pcr的反應(yīng)圖，圖中從左至右的曲線分別對(duì)應(yīng)陽性質(zhì)控品的濃度從高到低；

圖2為圖1中弓形蟲熒光pcr反應(yīng)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3為弓形蟲熒光pcr引物對(duì)的質(zhì)檢電泳圖，其中，1為弓形蟲熒光pcr反應(yīng)正向引物；2為弓形蟲熒光pcr反應(yīng)反向引物；m為電泳marker，長度由上到下依次為20，24，36(單位：堿基)；

圖4為弓形蟲熒光pcr探針的質(zhì)檢hplc圖；

圖5為puc57重組質(zhì)粒構(gòu)成示意圖；

圖6為ptg19-t質(zhì)粒載體構(gòu)成示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的試劑盒采用自主設(shè)計(jì)的熒光pcr反應(yīng)特異性引物對(duì)和熒光探針、人工合成的陽性質(zhì)控品、人工合成的陰性質(zhì)控品，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，反應(yīng)效率高的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)弓形蟲的定性檢測(cè)，能夠成為有效的輔助檢測(cè)工具。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，應(yīng)當(dāng)說明一點(diǎn)，實(shí)施例僅用于具體說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：試劑盒的制備

1、特異性引物對(duì)和探針的設(shè)計(jì)和合成

使用primerexpress3.0軟件，用弓形蟲b1基因的dna序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)和其特異性的探針，引物和探針均由上海捷瑞生物有限公司合成，在合成的探針上進(jìn)行了熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記。其中，引物為page純化，探針為hplc純化。

設(shè)計(jì)出的特異性引物對(duì)和探針如下：

正向引物：5’-ccgggtgaaacaatagagagtactg-3’(seqidno.1)；

反向引物：5’-ggtctacgtcgatggcatga-3’(seqidno.2)；

探針為：5’-aacgtcgccgctactgcccagtt-3’(seqidno.3)。

引物和探針合成后均制備成凍干粉狀，然后用1×tebuffer稀釋至100μm的濃度作為母液，-20℃保存。工作液為母液通過無菌水稀釋10倍制得，用于常規(guī)使用。

對(duì)特異性引物對(duì)和熒光探針進(jìn)行質(zhì)檢分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。

2、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的制備

陽性質(zhì)控品的制備：含本發(fā)明的特異性引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性序列片段由南京金斯瑞生物有限公司合成，然后用重組dna基因工程方法人工裝入puc57質(zhì)粒載體中，再通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒擴(kuò)增和質(zhì)粒提取等步驟獲得重組質(zhì)粒dna，此質(zhì)粒dna就是本發(fā)明試劑盒中所使用的陽性質(zhì)控品，該陽性質(zhì)控品所含的特異性序列如seqidno.4所示。

陰性質(zhì)控品的制備：是以人類管家基因gapdh基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)常規(guī)pcr引物，引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示，從人類組織細(xì)胞提取的基因組dna中進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，然后用重組dna基因工程的方法將擴(kuò)增產(chǎn)物人工裝配到ptg19-t質(zhì)粒載體中，再通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒擴(kuò)增和質(zhì)粒提取等步驟獲得重組質(zhì)粒dna，此質(zhì)粒dna就是本發(fā)明試劑盒中所使用的陰性質(zhì)控品，該陰性質(zhì)控品所含的特異性序列如seqidno.7所示。

3、pcr反應(yīng)液

pcr反應(yīng)液包括taq酶、dntp、緩沖液等成分，可以使用購自abi公司的熒光pcr反應(yīng)混合液，名稱是universalmastermixii,withung。

實(shí)施例2：樣本核酸的提取

使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒(dp304)，按照該試劑盒說明書的步驟，提取樣本核酸。提取完成后，產(chǎn)物放-20℃保存。

實(shí)施例3：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

選取陽性質(zhì)控品作為標(biāo)準(zhǔn)物，稀釋濃度至1μg/ml，然后繼續(xù)以10倍梯度稀釋五個(gè)濃度，一共是6個(gè)濃度梯度，即1μg/ml、10^-1μg/ml、10^-2μg/ml、10^-3μg/ml、10^-4μg/ml、10^-5μg/ml。然后將這六個(gè)濃度梯度的樣本作為待測(cè)樣本按照下述實(shí)施例4的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)，用與abi7500儀器配套的軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖1和圖2所示，且儀器的系統(tǒng)顯示，反應(yīng)效率達(dá)88.5％。

實(shí)施例4：熒光pcr擴(kuò)增以及結(jié)果分析

1)熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)采用的反應(yīng)體系如表1所示。在熒光pcr專用八聯(lián)管中配置好每個(gè)體系后，放入abi7500熒光pcr儀器中(或其它類型的開放式熒光定量pcr儀器)，準(zhǔn)備進(jìn)行反應(yīng)。每次實(shí)驗(yàn)都需要配置1個(gè)陽性質(zhì)控品的反應(yīng)管作為陽性對(duì)照和一個(gè)陰性質(zhì)控品的反應(yīng)管作為陰性對(duì)照。

表1

2)熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)采用的反應(yīng)條件表2所示。

表2

3)結(jié)果分析：

(1)、反應(yīng)結(jié)束后，首先，基線的選取設(shè)置為“自動(dòng)”。閾值(threshold)設(shè)定的原則是閾值線剛好超過陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，使其ct值＝40或“undetermined”。

(2)、設(shè)置好閾值后，觀察陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線是否為正常的s型對(duì)數(shù)增長曲線，且ct值≤37。滿足上述條件則說明本次實(shí)驗(yàn)反應(yīng)正常，否則，需要重做。

(3)、結(jié)果判定。ct值≤37，表示該樣本結(jié)果為陽性，ct值>37或“undetermined”，表示該樣本結(jié)果為陰性。

應(yīng)用實(shí)施例

使用本發(fā)明試劑盒對(duì)收集到的124例組織樣本進(jìn)行了檢測(cè)。124例樣本為臨床收集的胎兒組織，分兩組：正常引產(chǎn)組(對(duì)照組)42例，自發(fā)性流產(chǎn)組(患病組)82例。按照上述實(shí)施例2：樣本核酸的提取。隨后按照上述實(shí)施例4：熒光pcr擴(kuò)增以及結(jié)果分析，使用本發(fā)明試劑盒在abi7500熒光pcr儀進(jìn)行熒光pcr檢測(cè)，胎兒組織中弓形蟲熒光pcr檢測(cè)結(jié)果如下表3所示。

表3

從表3中的結(jié)果可以得出，本發(fā)明試劑盒能夠成功檢測(cè)出弓形蟲，并且從正常組和患病組的陽性率結(jié)果來看，本發(fā)明試劑盒可以很好地區(qū)分正常對(duì)照組和患病組,兩者陽性率的比率是1比8.20,也就是說患病組弓形蟲的感染率是正常對(duì)照組的8倍,結(jié)果顯示本發(fā)明試劑盒具有很好的靈敏度和特異性，能夠作為檢測(cè)弓形蟲的有效工具。大量臨床樣本的檢測(cè)對(duì)試劑盒的有效性、大規(guī)模使用性提供了保障。

本發(fā)明試劑盒，弓形蟲檢測(cè)的反應(yīng)效率高達(dá)88.5％，具有較高的反應(yīng)效率。

以上對(duì)本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，且本發(fā)明不限于上述的實(shí)施例，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>張家港藍(lán)蘇生物工程有限公司

<120>一種特異性檢測(cè)弓形蟲核酸的熒光pcr方法和試劑盒

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