基于核酸適配體特異性檢測四環(huán)素的生物傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種食品安全領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種基于核酸適配體特異性檢 測四環(huán)素的生物傳感器及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素被廣泛用于人類醫(yī)療以及動(dòng)物養(yǎng)殖中，用于防病治病、提高飼料利用率和 促進(jìn)動(dòng)物生長。四環(huán)素是一種常見的抗生素，具有良好的廣譜抗菌性，被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng) 殖。我國是世界上四環(huán)素類抗生素生產(chǎn)、銷售大國，抗生素的使用不合理及濫用導(dǎo)致其在動(dòng) 物性食品和環(huán)境中的藥物殘留。目前，常見致病菌對四環(huán)素類耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，對生態(tài)系統(tǒng)和 人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，研究快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、可靠的四環(huán)素快速檢測技術(shù)具有重要 的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 傳統(tǒng)的四環(huán)素測定方法主要有微生物法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法和液相色譜法。 盡管這些方法靈敏度高，但傳統(tǒng)的四環(huán)素檢測方法存在的顯著弊端是檢測耗時(shí)長、常需要 繁雜的前處理過程、較為昂貴的儀器設(shè)備以及專業(yè)的技術(shù)操作人員。因此，急需建立一種快 速、準(zhǔn)確且特異性高的四環(huán)素殘留檢測方法。
[0004] 經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利文獻(xiàn)號CN104931553A，公開（公告）日 2015. 09. 23,公開了一種基于絲網(wǎng)印刷電極的四環(huán)素適配體傳感器制備及檢測方法，將離 子液和四氧化三鐵逐層修飾到絲網(wǎng)印刷電極表面常溫下靜置至干燥，然后四環(huán)素適配體固 定到經(jīng)上述納米材料修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面。但該技術(shù)電極的修飾過程需要三個(gè)步驟， 操作步驟越繁瑣，影響因素越多，并且耗時(shí)也更長。再者，該技術(shù)實(shí)施過程中使用離子液體， 用于制備離子液體的吡啶類原料是揮發(fā)性有機(jī)物，且離子液體的再生過程是采用具有揮發(fā) 性的傳統(tǒng)有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取的過程。已有研究表明，離子液體具有潛在的毒性，對生物體以 及生態(tài)環(huán)境存在潛在危害。
[0005] 陳丹、姚冬生、謝春芳、劉大嶺在《中國生物工程雜志》上公開了一種"四環(huán)素核 酸適配體電化學(xué)生物傳感器的研制"，其利用等溫滴定量熱法篩選到的四環(huán)素核酸適配體 做識別分子制作生物傳感器，用電化學(xué)方法研究了該生物傳感器檢測四環(huán)素的電化學(xué)行 為。結(jié)果：等溫滴定量熱法篩選出一條對四環(huán)素有高親和力的適配體，解離平衡常數(shù)Kd= 51. 8ymol/L。差分脈沖伏安分析，在5. 0~5.OXIO3yg/L濃度范圍內(nèi)，峰電流值的變化 AIp與四環(huán)素濃度的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2= 0. 9876,檢測限為I. 0yg/ L，反應(yīng)時(shí)間為15min。該檢測限明顯低于目前國家限定的四環(huán)素殘留量（6.OXIO2yg/L)， 也低于目前其他報(bào)道的四環(huán)素適配體傳感器的檢測限。但該技術(shù)采用的普通固體電極，每 次使用前均需要打磨、活化、清洗等前處理步驟，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且預(yù)處理后電極的均一性難以 保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于核酸適配體特異性檢測四環(huán) 素的生物傳感器及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明涉及一種基于核酸適配體特異性檢測四環(huán)素的生物傳感器，該生物傳感器 的絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上依次修飾有四氧化三鐵/還原氧化石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合物 層和四環(huán)素核酸適配體層。
[0009] 本發(fā)明涉及上述生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：
[0010] 1)將四氧化三鐵/還原氧化石墨烯超聲分散在海藻酸鈉水溶液中，得到均一的四 氧化三鐵/還原氧化石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合物；
[0011] 所述的四氧化三鐵/還原氧化石墨烯，即具有空心半球結(jié)構(gòu)的四氧化三鐵納米顆 粒均勻生長在還原氧化石墨烯片表面形成的一種納米復(fù)合物，具體通過以下方式得到：
[0012] I. 1)將氧化石墨烯、表面活性劑P123和/或F127,超聲分散到溶劑中；
[0013] 1. 2)將可溶性鐵鹽和可溶性有機(jī)鹽加入到上述溶液中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蟮玫剑?br>[0014] 所述的溶劑為乙二醇、乙醇和水中的至少一種；
[0015] 所述的可溶性鐵鹽為氯化鐵、硝酸鐵、硫酸鐵中的一種或幾種混合。
[0016] 所述的可溶性有機(jī)鹽為乙酸鈉和/或乙酸鉀。
[0017] 2)將四氧化三鐵/還原氧化石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合物修飾到絲網(wǎng)印刷電極的工作 電極表面，室溫下干燥成膜；
[0018] 所述絲網(wǎng)印刷電極的工作電極的材質(zhì)為碳；
[0019] 3)將四環(huán)素核酸適配體涂布在修飾有四氧化三鐵/還原氧化石墨烯-海藻酸鈉復(fù) 合物的工作電極表面，室溫下干燥成膜后清洗即得。
[0020] 所述的四環(huán)素核酸適配體，即76 -mer的核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示，具體 為：
[0021] 5r-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCG AGCTCCACGTG- 3，。
[0022] 本發(fā)明涉及上述生物傳感器的四環(huán)素檢測方法，包括以下步驟：
[0023] 1)將所得生物傳感器在不同濃度待檢測四環(huán)素溶液中孵育50min，清洗；
[0024] 2)以四環(huán)素核酸適配體修飾電極作為工作電極，碳電極為對電極，Ag/AgCl電極 為參比電極，組成三電極體系；
[0025] 3)將三電極體系置于含有I.Ommol/L硫堇的0?lmol/L、pH6. 0醋酸鹽緩沖液中， 采用差分脈沖伏安法檢測生物傳感器在四環(huán)素溶液中孵育前后電化學(xué)信號的變化，即實(shí)現(xiàn) 四環(huán)素的檢測。
[0026] 所述的差分脈沖伏安法中，電位設(shè)置為_ 0. 5V到-0.IV，脈沖寬度為0. 05V，掃描 速率為0. 5s。 技術(shù)效果
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過在絲網(wǎng)印刷電極上首先修飾四氧化三鐵/還原氧化 石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合物，四氧化三鐵/還原氧化石墨烯具有良好的導(dǎo)電性、催化活性和較 大的比表面積，能促進(jìn)電極表面電子轉(zhuǎn)移，且海藻酸鈉具有較好的生物相容性與成膜性，能 很好地吸附固定生物活性物質(zhì)并保持其活性。在檢測過程中，修飾到電極上的四環(huán)素核酸 適配體在電極表面會(huì)發(fā)生自折疊。當(dāng)檢測體系中存在四環(huán)素時(shí)，修飾的四環(huán)素核酸適配體 與四環(huán)素特異性結(jié)合，四環(huán)素插入到核酸適配體自折疊的高級結(jié)構(gòu)區(qū)域，核酸適配體在電 極界面的狀態(tài)發(fā)生改變，空間位阻減少，降低氧化還原探針與電極界面的電阻，促進(jìn)電子傳 遞，隨著四環(huán)素濃度的增加，界面電子傳遞也加快，從而實(shí)現(xiàn)對四環(huán)素的定量檢測。
[0028] 本發(fā)明利用修飾的四環(huán)素核酸適配體與四環(huán)素特異性結(jié)合，導(dǎo)致電極表面電化學(xué) 信號的變化，從而實(shí)現(xiàn)對四環(huán)素的檢測。將前述的四環(huán)素核酸適配體修飾電極作為工作電 極，碳電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，組成三電極體系，在含有硫堇的醋酸鹽緩沖 液中，采用差分脈沖伏安法檢測目標(biāo)物質(zhì)孵育前后電化學(xué)信號的變化，即可定量檢測待測 目標(biāo)物。
[0029] 本發(fā)明采用的四氧化三鐵/還原氧化石墨烯具有較好的信號放大作用，制備的核 酸適配體生物傳感器靈敏度高、檢測速度快、特異性高，并且操作簡便、成本低廉，可以彌補(bǔ) 現(xiàn)有四環(huán)素檢測方法的缺陷與不足。
[0030] 本發(fā)明的有益效果進(jìn)一步包括：
[0031] 1)本發(fā)明采用的四氧化三鐵/還原氧化石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合物不僅生物相容性 好，而且具有較好的信號放大作用，極大地提高檢測四環(huán)素的性能；
[0032] 2)本發(fā)明使用絲網(wǎng)印刷電極，其電極簡便、小型化、易攜帶，且使用前無需任何預(yù) 處理；
[0033] 3)本發(fā)明制備方法簡單、性能穩(wěn)定、成本低、試劑用量少，適用于食品安全中四