本發(fā)明涉及一種豆豉纖溶酶，本發(fā)明還涉及一種豆豉纖溶酶的培制方法。

背景技術(shù)：

心血管疾病是一種常見(jiàn)的易致死疾病，約占全球死亡率29％，而血栓的形成是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因之一，血栓的形成是一個(gè)很復(fù)雜的生理過(guò)程。血栓的主要成分是纖維蛋白，纖維蛋白在血管中的過(guò)度積累，就容易形成血栓。纖溶酶可以降解纖維蛋白，常見(jiàn)的纖溶酶藥劑有尿激酶型(u-pa)、組織型(t-pa)、細(xì)菌型和鏈激酶型，雖然纖溶酶對(duì)治療血栓具有顯著療效，但是，其本身也具有一定的缺陷，比如市場(chǎng)供不應(yīng)求、價(jià)格太貴、降解纖維蛋白的專一性較差、造成體內(nèi)出血、過(guò)敏等問(wèn)題，因此尋找新的可替代資源成為研究熱門。

近年來(lái)，各種從發(fā)酵食品中細(xì)菌產(chǎn)生的纖溶酶先后被報(bào)道，這些發(fā)酵食品包括日本納豆，韓國(guó)的可食用的蜜香菇，印尼的天貝和中國(guó)的豆豉等，這些細(xì)菌型纖溶酶具有很高的纖溶酶活力，而且大多數(shù)都比較安全，副作用小，價(jià)格低廉，具有廣闊的市場(chǎng)前景和醫(yī)學(xué)價(jià)值。本申請(qǐng)人與2014年成功地從傳統(tǒng)曲霉型豆豉發(fā)酵過(guò)程中篩選到一株具有優(yōu)良溶栓性能的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株jxnuwx-1，已于2014年12月10日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：cctccm2014638，并于2015年5月15日向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交了申請(qǐng)?zhí)枮?01510250195.x的發(fā)明專利申請(qǐng)，該發(fā)明專利申請(qǐng)已經(jīng)公布。本

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
屬于對(duì)該項(xiàng)目的繼續(xù)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種豆豉纖溶酶，該纖溶酶分子在適宜人體ph下溶栓性質(zhì)穩(wěn)定，不僅可以降解纖維蛋白和纖維蛋白原，而且可以作為纖溶酶原激活因子，能夠降解凝血酶，而且對(duì)人體血液中的蛋白影響較小，制備成本也很低廉。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種該纖溶酶的培制方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的豆豉纖溶酶以一株來(lái)源于豆豉、保藏號(hào)為cctccm2014638、分類學(xué)命名為解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)的菌株jxnuwx-1為培養(yǎng)菌種，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、分離和提純制成豆豉纖溶酶產(chǎn)品。

本發(fā)明的豆豉纖溶酶具有以下酶學(xué)性質(zhì)：該豆豉纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量為29kda，最適溫度和最適ph分別為41℃和7.6，該豆豉纖溶酶會(huì)被pmsf、sbti、edta、fe³⁺、fe²⁺所抑制，該豆豉纖溶酶能夠快速降解纖維蛋白(原)的aα亞基，緊接著是bβ和cγ亞基，該豆豉纖溶酶既可以直接降解纖維蛋白(原)又可以作為纖溶酶原激活因子，同時(shí)該豆豉纖溶酶還能降解凝血酶。

上述豆豉纖溶酶的培制方法包括以下步驟：

(1)培養(yǎng)方法：

斜面培養(yǎng)→種子培養(yǎng)→液體發(fā)酵培養(yǎng)：將保存在斜面培養(yǎng)基的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株jxnuwx-1挑一菌環(huán)到種子培養(yǎng)基中，置于搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37℃、170r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12h；然后再將種子培養(yǎng)基中的菌液以2％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48h。其中，斜面培養(yǎng)基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，nacl0.5％，瓊脂2％，ph為7.0；種子培養(yǎng)基：酵母提取物5％，胰蛋白胨1％，nacl1％，ph值為7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖2％，蛋白胨2％，nacl0.1％，k2hpo4·3h2o0.1％，mgso4·7h2o0.05％，cacl20.1％，ph值為7.0。

(2)粗提純豆豉纖溶酶：

將發(fā)酵液在溫度為4℃條件下高速離心，離心條件為10000r/min，離心時(shí)間為10min，取上清液，該上清液為粗酶液，用65％w/v飽和度硫酸銨鹽析沉淀，用ph為7.0的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到粗豆豉纖溶酶液。

(3)精提取豆豉纖溶酶：

采用現(xiàn)代色譜技術(shù)對(duì)步驟(2)中得到的粗豆豉纖溶酶液進(jìn)行純化，主要采取以下方法獲得色譜純的豆豉纖溶酶：

a、用透析袋進(jìn)行透析除鹽同時(shí)進(jìn)行緩沖液交換，透析緩沖液為ph為8.5的tris-hcl緩沖液，濃度為20mm。

b、將脫鹽后含有豆豉纖溶酶的溶液上deae-sepharoseff柱，使用含有0～0.5mol/lnacl的ph為8.5的tris-hcl緩沖液，濃度為20mm進(jìn)行洗脫，收集有纖溶活性組分。

c、然后再用superdex75柱進(jìn)行凝膠層析，用ph為7.0的磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液含0.3mol/lnacl，收集有纖溶活性成分，得到色譜純的豆豉纖溶酶。

本發(fā)明的有益效果：該豆豉纖溶酶分子在適宜人體的ph下溶栓性質(zhì)穩(wěn)定，不僅可以降解纖維蛋白和纖維蛋白原，而且可以作為纖溶酶原激活因子，能夠降解凝血酶，而且對(duì)人體血液中的蛋白影響較小，這為抗血栓藥物開(kāi)發(fā)利用提供了新的路徑。

附圖說(shuō)明

圖1為利用人血纖維蛋白板法證明本發(fā)明產(chǎn)品豆豉纖溶酶溶解纖維蛋白的圖片。

圖2為sds-pgae測(cè)定纖溶酶對(duì)人血纖維蛋白原(1)和人血纖維蛋白(2)的降解機(jī)理圖片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：制備液體發(fā)酵培養(yǎng)物

以解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株jxnuwx-1(保藏號(hào)為：cctccm2014638)為培養(yǎng)菌種，進(jìn)行斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵3天后得到液體發(fā)酵培養(yǎng)物。

其中，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：

(1)斜面培養(yǎng)基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，nacl0.5％，瓊脂2％，ph為7.0。培養(yǎng)基的滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為30min。培養(yǎng)條件為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h，然后于4℃保藏斜面。

(2)種子培養(yǎng)基：酵母提取物5％，胰蛋白胨1％，nacl1％，ph值為7.0。培養(yǎng)基的滅菌溫度為115℃，滅菌時(shí)間為30min。培養(yǎng)條件為搖瓶培養(yǎng)，170r/min，12h，37℃。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖2％，蛋白胨2％，nacl0.1％，k2hpo4·3h2o0.1％，mgso4·7h2o0.05％，cacl20.1％，ph值為7.0。培養(yǎng)基的滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為30min。培養(yǎng)條件為搖瓶培養(yǎng)，170r/min，72h，39℃，接種量為0.5％。

實(shí)施例2：豆豉纖溶酶的分離純化

實(shí)施例1得到的液體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)65％的飽和度硫酸銨鹽析沉淀，用ph為7.0的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到粗酶液后，再經(jīng)過(guò)：

a、用透析袋進(jìn)行透析除鹽同時(shí)進(jìn)行緩沖液交換，透析緩沖液為ph為8.5的tris-hcl緩沖液，濃度為20mm。

b、將脫鹽后含有纖溶酶的溶液上deae-sepharoseff柱，使用0～0.5mol/lnacl的ph為8.5的tris-hcl緩沖液，濃度為20mm進(jìn)行洗脫，收集有纖溶活性組分。

c、然后再用superdex75柱進(jìn)行凝膠層析，用ph為7.0的磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液含0.3mol/lnacl，收集有纖溶活性成分，得到豆豉纖溶酶。

實(shí)施例3：測(cè)定分離純化后的豆豉纖溶酶的性質(zhì)

采用sds-page法測(cè)定法得出實(shí)施例2得到的豆豉纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量為29kda，最適溫度和最適ph分別為41℃和7.6，該豆豉纖溶酶會(huì)被pmsf、sbti、edta、fe³⁺、fe²⁺所抑制，該豆豉纖溶酶能夠快速降解纖維蛋白(原)的aα亞基，緊接著是bβ和cγ亞基，該豆豉纖溶酶既可以直接降解纖維蛋白(原)又可以作為纖溶酶原激活因子，同時(shí)該豆豉纖溶酶還能降解凝血酶。

實(shí)施例4：豆豉纖溶酶纖溶活性證明

采用人纖維蛋白板法檢驗(yàn)實(shí)施例2得到的豆豉纖溶酶對(duì)纖維蛋白的溶解性。

(a)纖維蛋白板法

巴比妥鈉-hcl緩沖液：先配100ml濃度為0.04mol/l巴比妥鈉溶液，再將其與11.47ml濃度為0.2mol/lhcl溶液混合，用0.2mol/l的hcl調(diào)節(jié)緩沖液的ph至7.8左右。凝血酶溶液：將凝血酶溶解于無(wú)菌巴比妥鈉-hcl緩沖液中，配制成20iu/ml，保存在4℃冰箱中。纖維蛋白溶液(2mg/ml)：將一支纖維蛋白原(100mg)溶解于50ml無(wú)菌巴比妥鈉-hcl緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。瓊脂糖溶液：將0.6g瓊脂糖溶于50ml巴比妥鈉-hcl緩沖液中，加熱溶解，保存在55℃水浴鍋中備用。

取8ml纖維蛋白原溶液和在55℃事先預(yù)熱的8ml瓊脂糖溶液充分混合之后，加入0.6ml凝血酶溶液，立刻倒入90mm培養(yǎng)皿中靜止放置1h，再用打孔器打孔，將豆豉纖溶酶液10μl加入孔中，于37℃孵育18h，該豆豉纖溶酶將纖維蛋白溶解，在平板凝膠表面形成肉眼可見(jiàn)的透明圈見(jiàn)圖1。

(b)電泳法

纖維蛋白原(46μl的2％人血纖維蛋白原溶解在20mmtris-hcl緩沖液，調(diào)節(jié)ph到7.8)同時(shí)與純化的纖溶酶(46μl2.3×10-3mg/ml)混合。37℃反應(yīng)，在不同的時(shí)間間隔終止反應(yīng)(1min、2min、3min、4min、15min、30min、1h和4h)將反應(yīng)完成后的樣本立即放在冰上，同時(shí)加入上樣緩沖液，煮沸后，用sds-page法檢測(cè)纖維蛋白原降解的條帶。

纖維蛋白(46μl的2％人血纖維蛋白原溶解在20mmtris-hcl緩沖液，調(diào)節(jié)ph到7.8,)，同時(shí)與10μl的凝血酶(20iu/ml)，室溫下保存1h，使其充分凝結(jié)，加入純化的纖溶酶(46μl2.3×10-3mg/ml)混合。37℃反應(yīng)，在不同的時(shí)間間隔終止反應(yīng)(1min、2min、3min、4min、15min、30min、1h和4h)將反應(yīng)完成后的樣本立即放在冰上，重復(fù)纖維蛋白原的檢測(cè)方法，對(duì)纖維蛋白鏈的降解進(jìn)行測(cè)定。

由圖2可知，通過(guò)sds-page分析可知，該豆豉纖溶酶展示出了降解纖維蛋白以及纖維蛋白原的降解機(jī)理。在該豆豉纖溶酶降解纖維蛋白原的過(guò)程中(1)，纖維蛋白原的aα鏈在1min之內(nèi)最先先被降解，其次在第4min的時(shí)候bβ鏈被降解，在4h的酶反應(yīng)后，纖維蛋白原的cγ被完全降解。該豆豉纖溶酶降解纖維蛋白的過(guò)程(2)與降解纖維蛋白原的過(guò)程類似，首先是纖維蛋白的aα鏈在1min之內(nèi)被降解，1h后bβ鏈也被降解，在4h的酶反應(yīng)后，纖維蛋白的cγ也被完全降解。