本發(fā)明屬于高分子材料制備技術(shù)及其在河豚毒素分離分析中的應用，具體的說涉及一種新型河豚毒素的分子印跡整體柱。

背景技術(shù)：

河豚毒素(TTX)是一種小分子生物堿類的神經(jīng)毒素。廣泛存在于河豚等多種海洋脊椎動物、無脊椎動物體內(nèi)或體表，是自然界毒性最強的非蛋白物質(zhì)之一。河豚毒素對人體毒性極強，且無特效解救藥物，在各國沿海分布廣泛，已發(fā)生多起該類毒素造成的人員中毒死亡事件，受到人們的高度關(guān)注，是相關(guān)海產(chǎn)品食用安全的必檢項目。

目前對海洋河豚毒素的檢測方法有小白鼠生物試驗法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、毛細管電泳法、酶聯(lián)免疫法和細胞毒性測試方等。盡管河豚毒素的檢測方法已經(jīng)取得很多進展，但現(xiàn)行認可的官方方法為河豚毒素檢測的柱后衍生液相色譜-熒光法。上述方法均采用溶劑提取待測物，在提取物中存在大量的基體和干擾物質(zhì)。通過常規(guī)凈化手段并不能消除基質(zhì)對檢測結(jié)果準確度的影響，因此需要開發(fā)一種新型的高選擇性的樣品前處理方法。

由于動物可食用組織樣品的基質(zhì)和組成相當復雜，分析物容易被干擾和隱蔽，因此，樣品前處理方法已成為動物性食品殘留檢測分析中的關(guān)鍵步驟。在河豚毒素分析中應用較多的凈化方法是固相萃取法，SPE是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，共萃物因其極性或者理化性質(zhì)相似，通過多柱串聯(lián)或者多種凈化方式的組合并不能很好的消除共萃物帶來的干擾，反而因凈化步驟過多，而使一些目標物的回收率受到影響，因此，在樣品預處理過程中需要高選擇性的萃取介質(zhì)。

分子印跡技術(shù)是指對特定目標分子(模板分子)及其結(jié)構(gòu)類似物具有特異性識別的聚合物的制備與應用技術(shù)。分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)的制備一般采用本體聚合法，得到的聚合產(chǎn)物經(jīng)研磨、過篩后在一定的溶劑條件下充分洗滌除去模板分子、致孔劑和未反應的單體等物質(zhì)，進而得到對模板分子具有特殊識別作用的聚合物材料。該聚合物在復雜的體系中能選擇性地識別模板分子，并具有抗惡劣環(huán)境能力強、穩(wěn)定性好、使用壽命長等優(yōu)點，已廣泛用于樣品前處理色譜分析。

整體柱，又稱為棒狀柱，是一種用有機或無機聚合方法在色譜柱內(nèi)進行原位聚合的連續(xù)床固定相。整體柱具有內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻、滲透率高、易改性和傳質(zhì)速率快等優(yōu)點，可解決填充色譜柱空間占用率低、 傳質(zhì)速率慢、柱負壓高、色譜峰拖尾嚴重等問題，被譽為第4代色譜固定相。

基于分子印跡聚合物的選擇識別能力和整體柱的諸多優(yōu)點，將二者相結(jié)合制備分子印跡整體柱(Molecularly imprinted monolithic colunln，MIPMC)成為必然的發(fā)展趨勢。作為一種新型的固相萃取材料和色譜固定相，分子印跡整體柱已被廣泛用于環(huán)境、生物、醫(yī)藥分析等領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是實現(xiàn)河豚毒素的特異性富集與檢測。提供一種河豚毒素整體柱的制備方法，以及在高效液相色譜中河豚毒素的快速富集與檢測。

在毛細管柱內(nèi)制備分子印跡整體柱，并在液相色譜中實現(xiàn)了河豚毒素的快速富集與檢測，該方法包括以下步驟：

(1)將河豚毒素標準品溶解在二甲亞砜溶液中，加入功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑，超聲混合，通氮除氧，靜置至少20min以形成穩(wěn)定的復合物。

(2)加入引發(fā)劑占溶液總重量的0.5％～5％，超聲溶解。

(3)將(2)灌注在經(jīng)γ-(甲基丙烯酰氧基)-三甲氧基硅烷修飾的25～250μm id的石英毛細管中，封端。60～70℃水浴中聚合12-16小時

(4)將印跡柱連接到高效液相色譜上，利用溶劑沖洗致孔劑與模板分子，便可得到具有良好印跡效果的整體柱。

(5)通過高效液相色譜，使用印跡柱作為捕集柱與分析柱，實現(xiàn)河豚毒素的快速富集與檢測。

其中：

(1)所述的致孔劑為十二醇、1,4-丁二醇的混合物，其物質(zhì)量之比為10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9:或0:10。

(2)所述模板分子所占單體物質(zhì)量的比例為1％、2％、5％、10％、20％，所用經(jīng)經(jīng)γ-(甲基丙烯酰氧基)-三甲氧基硅烷修飾的毛細管柱為內(nèi)徑25μm、50μm、75μm、100μm、150μm、200μm、250μm，聚合溫度為60～70℃水浴，印跡整體柱長度5cm或10cm。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：在石英毛細管柱內(nèi)制備了河豚毒素的分子印跡整體柱，分析速度快，溶劑用量少，分子識別性能好。

本發(fā)明制備的分子印跡整體柱具有良好的選擇識別性和小的傳質(zhì)阻力，作為高效液相色譜微柱，可實現(xiàn)對河豚樣品中河豚毒素的分離、富集與檢測。

附圖說明

圖1為整體柱掃描電鏡圖。

圖2為印跡整體柱柱壓與流速關(guān)系圖。

圖3為印跡整體柱富集凈化前后河豚樣品圖。

具體實施方式

實施例1

(1)首先將模板分子河豚毒素0.1μmol，甲基丙烯酸1.0μmol，十二醇18mg、1,4-丁二醇17mg，亞甲基雙丙烯酰胺1.1μmol，二甲亞砜為30mg，偶氮二異丁腈0.04mg，超聲溶解5分鐘混勻，通氮除氧5分鐘，灌注在經(jīng)過γ-(甲基丙烯酰氧基)-三甲氧基硅烷修飾的25μm id的石英毛細管中，封端。60～70℃水浴中聚合12小時。聚合反應完成后采用高壓液相色譜泵沖洗未反應的單體和模板分子，可得MIP1。

實例2

(2)加入致孔劑(十二醇、1,4-丁二醇，10:0)其他同實施例1，可得MIP2。

實例3

(3)加入致孔劑(十二醇、1,4-丁二醇，9:1)其他同實施例1，可得MIP3。

實例4

(4)加入致孔劑(十二醇、1,4-丁二醇，8:2)其他同實施例1，可得MIP4。

實例5

(5)加入致孔劑(十二醇、1,4-丁二醇，7:3)其他同實施例1，可得MIP5。

實例6

(6)加入致孔劑(十二醇、1,4-丁二醇，6:4)其他同實施例1，可得MIP6。

實例7

(7)加入致孔劑(十二醇、1,4-丁二醇，5:5)其他同實施例1，可得MIP7。

圖1為MIP1整體柱掃描電鏡圖；圖2為MIP1整體柱應用圖，其應用條件為當流動相(乙腈)流速從0.02ml/min增加到0.08ml/min時，整體柱的柱壓降也相應從3.6Mpa線性提高到15.3Mpa。

圖3為MIP1整體柱應用圖，其應用條件為流動相體系為0.1％(v/v)甲酸5mM甲酸銨水溶液-乙腈(15∶85，v/v)，其他條件為流動相流速0.2mL/min，柱溫30℃，檢測波長為196nm。