本發(fā)明涉及型熒光化合物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光分析是一種靈敏性高、選擇性強(qiáng)、使用簡(jiǎn)便的分析方法，被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物分析、環(huán)境工程、材料科學(xué)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。熒光化合物是一種具有特殊光學(xué)性能的物質(zhì)，當(dāng)吸收紫外、可見(jiàn)光等能量后，電子躍遷至激發(fā)態(tài)，然后發(fā)生輻射衰變回復(fù)到基態(tài)，放出光子，產(chǎn)生熒光。近年來(lái)，人們以杯芳烴——一類由亞甲基橋連苯酚單元所形成的新型空穴狀化合物為分子平臺(tái)，研制出各種熒光探針化合物，在臨床診斷、分子生物學(xué)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的潛在應(yīng)用價(jià)值。例如，杯芳烴衍生物可作為金屬離子熒光識(shí)別試劑測(cè)定人體血漿內(nèi)na⁺、k⁺、ca²⁺和mg²⁺等金屬離子。

鐵，是人體必需的微量元素之一，豐富存在于生物體內(nèi)。在許多生化反應(yīng)中，fe³⁺扮演著非常重要的角色，它的缺乏與過(guò)量都會(huì)使機(jī)體的功能發(fā)生紊亂，例如，阿爾茲海默癥、帕金森綜合征和貧血等疾病的發(fā)生發(fā)展都與體內(nèi)鐵離子濃度的異常有密切關(guān)系。因此，開(kāi)發(fā)用于定量檢測(cè)人體內(nèi)fe³⁺的選擇性熒光探針，對(duì)于保證生命健康具有重要意義。目前鐵離子熒光探針有金屬有機(jī)骨架材料(如tb-mof)、羅丹明類、納米材料(如s-gqds、gsh@agnc)等，但是這些熒光探針合成方法繁瑣，毒副作用較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物，其易于合成，選擇性高，無(wú)明顯細(xì)胞毒性，對(duì)fe³⁺檢測(cè)極限達(dá)到1.25ppm，可以根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)出體內(nèi)fe³⁺的含量。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物，具有如式i所示的結(jié)構(gòu)。

作為一種優(yōu)選方案，具有如式i所示結(jié)構(gòu)的熒光化合物對(duì)mg²⁺、pb²⁺、al³⁺、cd^2+、co²⁺、ni²⁺、cu²⁺和fe³⁺均具有選擇性，特別是fe³⁺。

作為一種優(yōu)選方案，具有如式i所示結(jié)構(gòu)的熒光化合物對(duì)fe³⁺的檢測(cè)極限達(dá)到1.25ppm。

一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物的制備方法，包括以下步驟，

1).將間苯二酚和丙醛充分溶于一定濃度的乙醇中，形成混合物a；

2).將混合物a冰凍，并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加一定濃度鹽酸，形成混合物b；

3).將混合物b溫?zé)嶂潦覝兀僭跍囟葹?0℃的條件下加熱24小時(shí)，待冷卻至室溫后，真空干燥10小時(shí)得到黃色粉末；

4).將黃色粉末放置在冷水中洗滌，直至廢液的ph呈中性，得到淺黃色固體；

5).將淺黃色固體放置在溫度為100℃的條件下真空干燥16小時(shí)，得到穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物。

作為一種優(yōu)選方案，步驟1)中的間苯二酚、丙醛和乙醇的質(zhì)量比為1-2:1:2.5-3.5，所述乙醇的體積濃度為50％。

作為一種優(yōu)選方案，步驟2)中的鹽酸與混合物a的質(zhì)量比為1:7-8，所述鹽酸的體積濃度為37％。

作為一種優(yōu)選方案，步驟3)中的室溫的溫度范圍為18℃-25℃。

作為一種優(yōu)選方案，步驟3)和步驟5)中的真空度為0.1mpa。

本發(fā)明熒光化合物對(duì)金屬離子的識(shí)別能力是依據(jù)其自身熒光激發(fā)峰強(qiáng)度的變化來(lái)進(jìn)行分析判斷的。通過(guò)各種不同金屬離子對(duì)本發(fā)明熒光化合物的熒光滴定實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)金屬離子的存在可以使熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，尤其是fe³⁺能使熒光發(fā)生猝滅，而且對(duì)fe³⁺檢測(cè)極限達(dá)到1.25ppm。因此，本發(fā)明化合物能作為熒光探針對(duì)fe³⁺進(jìn)行識(shí)別檢測(cè)。

本發(fā)明熒光化合物的細(xì)胞毒性也進(jìn)行了探討，通過(guò)使用不同濃度本發(fā)明物對(duì)hek293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)生長(zhǎng)進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)本發(fā)明物對(duì)人類正常細(xì)胞的影響。具體使用mtt方法：外源性的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2、5-二苯基四氮唑溴鹽)在活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶的作用下能被還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此作用。dmso(二甲基亞砜)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。mtt實(shí)驗(yàn)表明，一定濃度范圍內(nèi)的本發(fā)明熒光化合物對(duì)正?；罴?xì)胞無(wú)明顯毒性。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明熒光化合物對(duì)fe³⁺具有很好的識(shí)別性能，該熒光化合物對(duì)fe³⁺檢測(cè)極限達(dá)到1.25ppm，且制備方法簡(jiǎn)易，產(chǎn)率高，無(wú)明顯細(xì)胞毒性，在環(huán)境、生物體內(nèi)fe³⁺的檢測(cè)等方面具有廣泛應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的熒光化合物的核磁共振碳譜；

圖2為本發(fā)明的熒光化合物的核磁共振氫譜；

圖3為本發(fā)明的熒光化合物對(duì)各種金屬離子的熒光識(shí)別光譜；

圖4為本發(fā)明的熒光化合物對(duì)不同濃度的鐵離子的熒光識(shí)別光譜；

圖5為經(jīng)不同濃度本發(fā)明的熒光化合物干預(yù)hek293細(xì)胞24、48和72h后的細(xì)胞活性圖。

具體實(shí)施方式

一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物，具有如式i所示的結(jié)構(gòu)。

具有如式i所示結(jié)構(gòu)的熒光化合物對(duì)mg²⁺、pb²⁺、al³⁺、cd^2+、co²⁺、ni²⁺、cu²⁺和fe³⁺均具有選擇性，特別是fe³⁺。且具有如式i所示結(jié)構(gòu)的熒光化合物對(duì)fe³⁺的檢測(cè)極限達(dá)到1.25ppm。

實(shí)施例1

1).將11.6g間苯二酚和15ml丙醛充分溶于73.5ml體積濃度為95％的乙醇中，形成混合物a；

2).將混合物a冰凍，并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加17ml體積濃度為37％的鹽酸，形成混合物b；

3).將混合物b溫?zé)嶂潦覝?，再在溫度?0℃的條件下加熱24小時(shí)，待冷卻至室溫后，真空干燥10小時(shí)得到黃色粉末；

4).將黃色粉末放置在冷水中洗滌，直至廢液的ph呈中性，得到淺黃色固體；

5).將淺黃色固體放置在溫度為100℃的條件下真空干燥16小時(shí)，得到穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物，產(chǎn)率為93％。

實(shí)施例2

1).將23.2g間苯二酚和15ml丙醛充分溶于103ml體積濃度為50％的乙醇中，形成混合物a；

2).將混合物a冰凍，并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加21.6ml體積濃度為37％的鹽酸，形成混合物b；

3).將混合物b溫?zé)嶂潦覝兀僭跍囟葹?0℃的條件下加熱24小時(shí)，待冷卻至室溫后，真空干燥10小時(shí)得到黃色粉末；

4).將黃色粉末放置在冷水中洗滌，直至廢液的ph呈中性，得到淺黃色固體；

5).將淺黃色固體放置在溫度為100℃的條件下真空干燥16小時(shí)，得到穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物，產(chǎn)率為96％。

實(shí)施例3

1).將15g間苯二酚和11.6ml丙醛充分溶于70ml體積濃度為50％的乙醇中，形成混合物a；

2).將混合物a冰凍，并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加15ml體積濃度為37％的鹽酸，形成混合物b；

3).將混合物b溫?zé)嶂潦覝?，再在溫度?0℃的條件下加熱24小時(shí)，待冷卻至室溫后，真空干燥10小時(shí)得到黃色粉末；

4).將黃色粉末放置在冷水中洗滌，直至廢液的ph呈中性，得到淺黃色固體；

5).將淺黃色固體放置在溫度為100℃的條件下真空干燥16小時(shí)，得到穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物，產(chǎn)率為94％。

以上實(shí)施例中室溫的溫度范圍為：18℃-25℃，真空度為0.1mpa。

綜上可知，本發(fā)明熒光化合物的制備方法簡(jiǎn)易，產(chǎn)率高，便于工業(yè)生產(chǎn)。

以上實(shí)施例中，實(shí)施例3為最優(yōu)方案，以下實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)使用的熒光化合物均由實(shí)施例3制得。

實(shí)施例4

對(duì)本發(fā)明熒光化合物中的碳進(jìn)行核磁共振，得到核磁共振碳譜，結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例5

對(duì)本發(fā)明熒光化合物中的氫進(jìn)行核磁共振，得到核磁共振氫譜，結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例6

本發(fā)明熒光化合物對(duì)各種金屬離子的熒光識(shí)別實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：參與熒光識(shí)別的金屬化合物是kno3、ca(no3)2、nano3、lino3、zn(no3)2、mg(no3)2、pb(no3)2、al(no3)3、cd(no3)2、co(no3)2、ni(no3)2、cu(no3)2和fe(no3)3。所有的金屬濃度為0.01m。

實(shí)驗(yàn)步驟：在若干個(gè)5ml容量瓶中加入5mg本發(fā)明熒光化合物，然后再分別加入以上金屬溶液，最后加入經(jīng)5a分子篩干燥的定溶劑dmf(n,n-二甲基甲酰胺)定容，在超聲頻率為10khz的條件下超聲20分鐘，室溫下放置12小時(shí)后進(jìn)行測(cè)試，記錄數(shù)據(jù)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖3可知，no^3-不會(huì)影響本發(fā)明化合物的熒光強(qiáng)度，而熒光強(qiáng)度的變化確實(shí)是由金屬離子本身引起的。本發(fā)明熒光化合物在未加任何金屬的時(shí)候，在528nm處有最強(qiáng)激發(fā)峰，隨著金屬化合物的加入，最強(qiáng)激發(fā)峰的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了變化。尤為顯著的是fe(no3)3可以使熒光猝滅，因此本發(fā)明熒光化合物可作為fe³⁺的熒光探針。除此之外，除了ca(no3)2、nano3、lino3和zn(no3)2使本發(fā)明物528nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)外，mg(no3)2、pb(no3)2、al(no3)3、cd(no3)2、co(no3)2、ni(no3)2和cu(no3)2都能一定程度地減弱這個(gè)最強(qiáng)激發(fā)峰的熒光。

實(shí)施例7

本發(fā)明熒光化合物被fe(no3)3逐漸猝滅實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)步驟：稱取5mg本發(fā)明熒光化合物溶于5ml經(jīng)過(guò)5a分子篩干燥的dmf(n,n-二甲基甲酰胺)溶液中，在超聲頻率為10khz的條件下超聲處理20分鐘，靜置12小時(shí)后再在超聲頻率為10khz的條件下超聲處理20分鐘，然后測(cè)試，逐滴滴加fe(no3)3(1000ppm)，記錄數(shù)據(jù)，繪制得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖4可知，隨著fe(no3)3濃度的逐漸增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，最后發(fā)生猝滅。

實(shí)施例8

本發(fā)明熒光化合物用于mtt細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)不同濃度本發(fā)明熒光化合物的配制

將hek293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)放入96孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。用dmso(二甲基亞砜)將本發(fā)明熒光化合物配成40mg/ml，然后將40mg/ml的本發(fā)明熒光化合物溶液分別用不含血清的高糖dmem培養(yǎng)液稀釋成25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和300μg/ml的溶液放在溫度為4℃的條件下保存。待96孔板內(nèi)的細(xì)胞貼壁后，分別取10μl上述配好的溶液放于已經(jīng)含有90μl含血清培養(yǎng)液的96孔板內(nèi)培養(yǎng)(本發(fā)明熒光化合物的濃度被稀釋10倍，在孔內(nèi)的本發(fā)明熒光化合物濃度分別為2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml)。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)——計(jì)數(shù)——接板

hek293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)貼壁生長(zhǎng)至90-95％即可傳代。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，吸棄上述96孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，再用2ml經(jīng)高壓除菌后的pbs(磷酸鹽緩沖液)對(duì)96孔板內(nèi)的貼壁細(xì)胞進(jìn)行潤(rùn)洗，然后加入1ml胰蛋白酶(gibco公司生產(chǎn)的0.25％trypsin-edta)對(duì)96孔板內(nèi)的貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化，在顯微鏡下觀察至大部分細(xì)胞縮小變后圓后，立刻加入2ml培養(yǎng)液終止消化，然后用離心管吸取15ml經(jīng)消化后的細(xì)胞液并將其放入離心機(jī)中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心5分鐘。去除上清液后，加入1ml培養(yǎng)液，然后將底部沉淀的細(xì)胞打散均勻形成細(xì)胞懸液。吸取400μl細(xì)胞懸液放入另一培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)，另外再吸取100μl細(xì)胞懸液放于細(xì)胞計(jì)數(shù)板數(shù)數(shù)，然后對(duì)余下500μl細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋使其密度達(dá)到5.6*10⁴/ml，并將稀釋后的細(xì)胞懸液接種于3塊96孔板(每孔加入90μl細(xì)胞懸液)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

(3)mtt試驗(yàn)

次日觀察96孔板內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞貼壁后，分別加入10μl(25μg/ml)、10μl(50μg/ml)、10μl(100μg/ml)、10μl(200μg/ml)和10μl(300μg/ml)的本發(fā)明化合物和不含血清的高糖dmem培養(yǎng)液于孔內(nèi)。mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2、5-二苯基四氮唑溴鹽)溶解于pbs(磷酸鹽緩沖液)中形成mtt溶液。培養(yǎng)1、2、3天后，在孔內(nèi)分別加入10μl(5mg/ml)經(jīng)過(guò)濾除菌的mtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，吸棄孔內(nèi)廢液，每孔加入150μldmso(二甲基亞砜)溶液，放置搖床(其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)的ts-2搖床)在擺振幅度為70rpm的條件下?lián)u晃20分鐘，最后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(伯騰儀器公司生產(chǎn)的epoch系列)在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，記錄數(shù)據(jù)，以本發(fā)明熒光化合物的濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活力為縱坐標(biāo)繪制柱狀圖，如實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖5可知，在一定濃度范圍內(nèi)的本發(fā)明熒光化合物對(duì)正?；罴?xì)胞無(wú)明顯毒性。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。