一株利用木質纖維素水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)L?天冬氨酸的基因工程菌及其構建方法與應用與流程

文檔序號：11582354閱讀：545來源：國知局

本發(fā)明屬于基因工程及發(fā)酵工程技術領域，具體涉及一株利用木質纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的基因工程菌構建方法與應用。

背景技術：

l-天冬氨酸在醫(yī)藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途。在醫(yī)藥方面，是氨基酸制劑的主要成分；在化工方面，可以作為制造合成樹脂的原料，大量用于合成環(huán)保材料聚天門冬氨酸；尤其在食品工業(yè)方面，l-天門冬氨酸是一種良好的營養(yǎng)增補劑，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生產(chǎn)原料。l-天冬氨酸需求約7萬噸/年，市場需求量大。

目前l(fā)-天冬氨酸主要以富馬酸為原料，采用生物酶法合成，而目前富馬酸主要采用化學法制備，因此從全周期分析，l-天冬氨酸的制備仍然依賴化石資源。葡萄糖、木糖等單糖可來源于可再生的生物質資源，其產(chǎn)量豐富，篩選或構建獲得一株能夠直接通過發(fā)酵制備l-天冬氨酸的生產(chǎn)菌株具有重要的意義。國內全生物合成上述產(chǎn)品尚處于實驗室研究階段，其產(chǎn)業(yè)化實施經(jīng)濟性偏低，造成這一現(xiàn)狀的主要問題包括：1)原料成本高；2)原料轉化率低。

先期已獲得了一株有氧條件下能夠利用葡萄糖發(fā)酵制備l-天冬氨酸的菌株(cn106434510a)，但該菌株因有氧條件下菌株生物量高且脫羧反應導致二氧化碳釋放，導致收率偏低僅0.55g/l，生產(chǎn)成本高。與有氧發(fā)酵相比，厭氧發(fā)酵具有收率高的特點，因此構建了一株在厭氧條件下能夠利用單糖發(fā)酵制備l-天冬氨酸的菌株(cn105296411a)，但厭氧環(huán)境下菌株生長穩(wěn)定性偏差，且產(chǎn)物濃度僅10g/l，因此進一步構建篩選獲得了一株在厭氧條件下生長性能優(yōu)良且濃度更高的菌株具有顯著意義，同時為了能實現(xiàn)利用木質纖維素水解液的目標，在菌株構建過程中提高木糖利用效率，及混合糖的同步利用均需考慮。本發(fā)明基于此，公開了相關的技術。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是，提供一株利用木質纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的基因工程菌。

本發(fā)明還要解決的技術問題是，提供上述基因工程菌的構建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術問題是，提供上述基因工程菌在發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸中的應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：

一株利用木質纖維素水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的基因工程菌，敲除保藏號為cgmccno：2301菌株中蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶的編碼基因aceba，并在aceba基因的位置處插入l-天冬氨酸酶基因，再敲除該菌種中糖轉運系統(tǒng)的ptsg基因，得到重組大腸桿菌as31；基因的敲除和敲除插入采用通用的red重組技術。

將能夠催化草酰乙酸合成l-天冬氨酸的天冬氨酸轉氨酶基因aspc、磷酸烯醇式丙酮酸激酶編碼基因pck克隆到表達質粒上，將該重組質粒轉化大腸桿菌as31，即得到木質纖維素水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的基因工程菌as32?；虻谋磉_采用具有較高本底表達水平的ptrc99a大腸桿菌表達質粒，aspc基因和pck基因的表達采用單質粒表達模式，兩個基因采用人工合成基因序列的方式，各自帶有自身獨立的啟動子序列。

本發(fā)明中，

所述蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶的編碼基因aceba的genbank登記號為eu889415.1；

所述糖轉運系統(tǒng)的ptsg基因在大腸桿菌信息學數(shù)據(jù)庫中的登記號為：eg10787；

所述l-天冬氨酸酶基因的核苷酸序列如seqidno：1所示；

所述天冬氨酸轉氨酶基因aspc的核苷酸序列如seqidno：2所示；

所述磷酸烯醇式丙酮酸激酶編碼基因pck的核苷酸序列如seqidno：3所示。

其中，所述的表達質粒為ptrc99a。

其中，天冬氨酸轉氨酶基因aspc的啟動子如seqidno：4所示，磷酸烯醇式丙酮酸激酶編碼基因pck的啟動子如seqidno：5所示。

上述利用木質纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶的編碼基因aceba的敲除與l-天冬氨酸酶基因的插入：

(1)以seqidno：6和seqidno：7所示的核苷酸序列為引物，質粒pij773為模板，pcr擴增得到線性片段1；

以seqidno：8和seqidno：9所示的核苷酸序列為引物，seqidno：1所示的核苷酸序列為模板，pcr擴增得到線性片段2；

以seqidno：6和seqidno：9所示的核苷酸序列為引物，線性片段1和線性片段2為模板擴增得到基因敲除片段a；

(2)將pkd46質粒轉化cgmccno：2301菌株，利用l-阿拉伯糖誘導其表達λ重組酶，再將該菌株制備成感受態(tài)?。?/p>

(3)將步驟(1)中基因敲除片段a轉化步驟(2)得到的感受態(tài)ⅰ中，涂布安普霉素的平板篩選出陽性重組子a；

(4)將pcp20轉化到步驟(3)得到的陽性重組子a中，42℃熱激使其表達flp重組酶，利用無抗性平板和含有安普霉素抗性的平板進行雙挑，能夠在無抗性平板上生長，但不能在安普霉素抗性平板上生長的菌株即為大腸桿菌as12；

ptsg基因的敲除：

(5)將pkd46質粒轉化大腸桿菌as12，利用l-阿拉伯糖誘導其表達λ重組酶，再將該菌株制備成感受態(tài)ⅱ；

(6)以seqidno：10和seqidno：11為引物，質粒pij773為模板，pcr擴增得到基因敲除片段b；

(7)將步驟(6)得到的基因敲除片段b轉化步驟(5)得到的感受態(tài)ⅱ中，涂布安普霉素的平板篩選出陽性重組子b；

(8)將pcp20轉化到步驟(7)得到的陽性重組子b中，42℃熱激使其表達flp重組酶，利用無抗性平板和含有安普霉素抗性的平板進行雙挑，能夠在無抗性平板上生長，但不能在安普霉素抗性平板上生長的菌株即為重組大腸桿菌as31；

天冬氨酸轉氨酶基因aspc、磷酸烯醇式丙酮酸激酶編碼基因pck過表達：

(9)將seqidno：12所示的序列插入表達質粒ptrc99a中，得到重組質粒，將該重組質粒轉化重組大腸桿菌as31，得到所述利用木質纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的基因工程菌as32。

上述利用木質纖維素水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的基因工程菌在發(fā)酵制備l-天冬氨酸中的應用在本發(fā)明的保護范圍之內。

利用本發(fā)明的基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的具體發(fā)酵培養(yǎng)過程如下：

(s1)將基因工程菌as32轉接到搖瓶lb培養(yǎng)基中，有氧培養(yǎng)10～12h，得到一級種子液；

(s2)將一級種子液轉接到發(fā)酵罐lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到二級種子液；

(s3)待二級種子液od600至2.5～4時，再接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下：

谷氨酸9g/l、玉米漿干粉5g/l、檸檬酸3.0g/l、na2hpo4·7h2o3.00g/l、kh2po48.00g/l、(nh4)2hpo420.00g/l、nh4cl10g/l、(nh4)2so45g/l、mgso4·7h2o1.00g/l溶劑為水；

發(fā)酵過程中，分次加入滅菌葡萄糖或木質素水解液，保證培養(yǎng)基中葡萄糖或木質素水解液的濃度在1～50g/l；

發(fā)酵過程中，谷氨酸濃度控制為6～15g/l。

步驟(s1)和(s2)中，培養(yǎng)溫度為35～38℃。

步驟(s3)中，采用兩階段發(fā)酵模式，當菌體od600為20以下時，通氧氣進行有氧發(fā)酵，溶解氧為5～40％；當菌體od600至20以上時改通二氧化碳氣體進行厭氧發(fā)酵，通氣量控制在0.01～0.5vvm。

其中，兩階段發(fā)酵過程中溫度為25～30℃，培養(yǎng)過程ph用氨水調節(jié)為7.0～8.5。

有益效果：

本發(fā)明創(chuàng)新性地建立了原有l(wèi)-天冬氨酸采用酶轉化制備的替代路線，徹底擺脫了依賴于石油基富馬酸的問題，同時針對之前有氧和厭氧發(fā)酵制備l-天冬氨酸存在的問題，重新設計路線，最終提高了厭氧下l-天冬氨酸的收率和濃度，具有顯著的經(jīng)濟性和社會效益，工藝路線綠色、環(huán)保。

附圖說明

圖1帶有安普霉素抗性基因的長鏈片段鑒定圖。

圖2ptsg突變體的菌落pcr鑒定圖。

圖3誘導pcp20表達flp重組酶去除抗性基因后菌落pcr鑒定圖。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1：

本實施例說明利用重疊pcr技術和同源重組技術敲除親本大腸桿菌jm125(cgmccno：2301)中aceba基因(seqidno：2)的同時插入l-天冬氨酸酶基因(seqidno：1)的過程。

(1)利用lb培養(yǎng)基，于37℃、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌jm125至od600＝0.4～0.6，制備成電轉感受態(tài)；

(2)將重組質粒電轉入感受態(tài)的大腸桿菌cgmccno：2301。電擊條件為：200ω，25μf，電擊電壓2.3kv，電擊時間4～5ms。電擊后迅速將菌體加入預冷1ml的soc培養(yǎng)基，150r/min、30℃培養(yǎng)1h之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的lb培養(yǎng)基平板篩選出陽性轉化子cgmccno：2301(pkd46)；

(3)在lb培養(yǎng)基中加入10mm的l-阿拉伯糖，于30℃下誘導質粒pkd46表達出λ重組酶，制成電轉感受態(tài)；

(4)以兩側帶有frt位點的安普霉素抗性基因(pij773)和l-天冬氨酸酶基因的(genbank：x03629.1)為模板設計引物f1，r1和f2，r2，具體序列為：

f1(seqidno：6)：

ccttcgttcacagtggggaagttttcggatccatgacgaggagctgcacgtgtaggctggagctgcttcgaag；

r1(seqidno：7)：attccggggatccgtcgactacaaactcttgtaatggcggcg；f2(seqidno：8)：taaggcccctaggcagctgatgtttgagaacattaccgccgc；r2(seqidno：9)：

tgcggcgtgaacgccttatccggcctacagtcagcaacggttgttgttgccgggcttcattgtttttaatgcttacagca；

(5)以f1，r1和f2，r2分別擴增出安普霉素抗性基因(線性片段1)和l-天冬氨酸酶基因(線性片段2)，再以f1和r2為引物擴增出兩端帶有aceba基因同源臂的dna敲除片段；

(6)電轉線性dna片段至已誘導表達λ重組酶的大腸桿菌cgmccno：2301(pkd46)感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的lb平板篩選出陽性重組子，并進行了pcr鑒定；

(7)陽性重組子制備成感受態(tài)后倒入能誘導表達flp重組酶的質粒pcp20，于42℃熱激表達flp重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌落即為已經(jīng)敲除抗性的菌株，命名為as12。

實施例2：

本實施例利用red同源重組技術敲除大腸桿菌as12糖轉運系統(tǒng)的ptsg基因，具體步驟包括：

(1)利用lb培養(yǎng)基，于37℃、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌as12至od600＝0.4～0.6，制備成電轉感受態(tài)。

(2)將重組質粒電轉入感受態(tài)的大腸桿菌as12。電擊條件為：200ω，25μf，電擊電壓2.3kv，電擊時間4～5ms。電擊后迅速將菌體加入預冷1ml的soc培養(yǎng)基，150r/min、30℃培養(yǎng)1h之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的lb培養(yǎng)基平板篩選出陽性轉化子as12(pkd46)。

(3)在lb培養(yǎng)基中加入10mm的l-阿拉伯糖，于30℃下誘導質粒pkd46表達出λ重組酶，制成電轉感受態(tài)。

(4)以兩側帶有frt位點的安普霉素抗性基因為模板，利用高保真pcr擴增系統(tǒng)，以質粒pij773為模板，并設計兩端帶有fum同源片段的擴增引物，擴增出線性dna同源片段，鑒定結果見附圖1，引物序列如下：

上游帶同源臂引物h1-p1，下劃線為同源片段(seqidno：10)：

5’-atgtttaagaatgcatttgctaacctgcaaaaggtcggtaaatcgctggtgt

aggctggagctgcttc-3’；

下游帶同源臂引物h2-p2，下劃線為同源片段(seqidno：11)：

5’-ttagtggttacggatgtactcatccatctcggttttcaggttatcggaatgg

gaattagccatggtcc-3’。

反應體系：帶同源臂的上下游引物(100pmol/μl)各0.5μl；模板dna(100ng/μl)0.5μl；10×buffer5μl；dntps(10mm)各1μl；dmso(100％)2.5μl；pyrobestdna聚合酶(2.5u/μl)1μl；ddh2o36/35.5μl；總體積50μl。

反應條件：94℃，2min；(94℃，45sec；50℃，45sec；72℃，90sec；10個循環(huán))；(94℃，45sec；55℃，45sec；72℃，90sec；15個循環(huán))；72℃，5min。

(5)電轉線性dna片段至已誘導表達λ重組酶的大腸桿菌as12感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的lb平板篩選出陽性重組子，并進行了菌落pcr鑒定，結果見附圖2。

(6)陽性重組子制備成感受態(tài)后倒入能誘導表達flp重組酶的質粒pcp20，于42℃熱激表達flp重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌，并通過pcr鑒定(附圖3)即可確定是否已經(jīng)敲除抗性，敲除抗性的菌株為as31。

實施例3：

本實施例說明采用質粒共表達的方式超量表達兩個酶，即能夠催化草酰乙酸合成l-天冬氨酸的天冬氨酸轉氨酶基因aspc和磷酸烯醇式丙酮酸激酶編碼基因pck，并將重組質粒導入突變株as31中，獲得l-天冬氨酸高產(chǎn)菌as32，具體方法如下：

1、構建超量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶編碼基因(pck)和天冬氨酸轉氨酶編碼基因(aspc)的表達質粒，其過程包括：

(1)人工設計并合成兩端帶有ecori和hindiii酶切位點，兩個基因的各自帶有自身

操縱子，可實現(xiàn)無誘導下的高本底表達，具體序列見seqidno：1。

(2)表達質粒ptrc99a分別用ecori和hindiii雙酶切，并與合成的基因連接獲得重組質粒ptrc99a-pck-aspc。

2、將質粒ptrc99a-ppc-aspa導入突變株as31感受態(tài)，獲得的陽性轉化子即為本發(fā)明的新構建菌株as32。

實施例4：

本實施例說明新構建的重組大腸桿菌as32厭氧發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的能力。

1、采用lb培養(yǎng)基按1～2％(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，有氧培養(yǎng)10～12h，進一步按1～2％(v/v)接種量接種至種子發(fā)酵罐(培養(yǎng)基也為lb)，培養(yǎng)4～6h后待菌體od600至2.5～4之間，按5～10％接種發(fā)酵培養(yǎng)基(jspg培養(yǎng)基，葡萄糖為碳源分批補加)；

2、種子培養(yǎng)過程溫度控制在35～38℃，培養(yǎng)中不需調節(jié)ph。發(fā)酵過程采用有氧-厭氧兩階段發(fā)酵模式，od600為20以下時，通氧氣進行有氧發(fā)酵，溶解氧為5～40％；當菌體od600至20以上時改通二氧化碳氣體進行厭氧發(fā)酵，通氣量控制在0.01～0.5vvm。發(fā)酵過程溫度控制在25～30℃，培養(yǎng)過程ph用氨水控制在7.0～8.5。

出發(fā)菌株與重組菌株的厭氧發(fā)酵48h后的結果見表1。

表1出發(fā)菌株及兩株重組菌發(fā)酵產(chǎn)酸情況

實施例5：

本實施例說明新構建的重組大腸桿菌as32厭氧發(fā)酵時，添加不同濃度谷氨酸對產(chǎn)l-天冬氨酸的能力的影響。

不同谷氨酸添加時重組菌株as32的厭氧發(fā)酵48h后的結果見表1。

表2不同谷氨酸添加時重組菌發(fā)酵產(chǎn)酸情況

實施例6：

本實施例說明新構建的重組大腸桿菌as32利用木質纖維素水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的能力。

出發(fā)菌株與重組菌株的厭氧發(fā)酵48h后的結果見表3。

表3出發(fā)菌株及兩株重組菌利用木質纖維素發(fā)酵產(chǎn)酸情況

sequencelisting

<110>南京工業(yè)大學

<120>一株利用木質纖維素水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)l-天冬氨酸的基因工程菌及其構建方

法與應用

<130>sg20170518011

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1191

<212>dna

<213>l-天冬氨酸酶基因的核苷酸序列

<400>1

atgtttgagaacattaccgccgctcctgccgacccgattctgggcctggccgatctgttt60

cgtgccgatgaacgtcccggcaaaattaacctcgggattggtgtctataaagatgagacg120

ggcaaaaccccggtactgaccagcgtgaaaaaggctgaacagtatctgctcgaaaatgaa180

accaccaaaaattacctcggcattgacggcatccctgaatttggtcgctgcactcaggaa240

ctgctgtttggtaaaggtagcgccctgatcaatgacaaacgtgctcgcacggcacagact300

ccggggggcactggcgcactacgcgtggctgccgatttcctggcaaaaaataccagcgtt360

aagcgtgtgtgggtgagcaacccaagctggccgaaccataagagcgtctttaactctgca420

ggtctggaagttcgtgaatacgcttattatgatgcggaaaatcacactcttgacttcgat480

gcactgattaacagcctgaatgaagctcaggctggcgacgtagtgctgttccatggctgc540

tgccataacccaaccggtatcgaccctacgctggaacaatggcaaacactggcacaactc600

tccgttgagaaaggctggttaccgctgtttgacttcgcttaccagggttttgcccgtggt660

ctggaagaagatgctgaaggactgcgcgctttcgcggctatgcataaagagctgattgtt720

gccagttcctactctaaaaactttggcctgtacaacgagcgtgttggcgcttgtactctg780

gttgctgccgacagtgaaaccgttgatcgcgcattcagccaaatgaaagcggcgattcgc840

gctaactactctaacccaccagcacacggcgcttctgttgttgccaccatcctgagcaac900

gatgcgttacgtgcgatttgggaacaagagctgactgatatgcgccagcgtattcagcgt960

atgcgtcagttgttcgtcaatacgctgcaggaaaaaggcgcaaaccgcgacttcagcttt1020

atcatcaaacagaacggcatgttctccttcagtggcctgacaaaagaacaagtgctgcgt1080

ctgcgcgaagagtttggcgtatatgcggttgcttctggtcgcgtaaatgtggccgggatg1140

acaccagataacatggctccgctgtgcgaagcgattgtggcagtgctgtaa1191

<210>2

<211>1191

<212>dna

<213>天冬氨酸轉氨酶基因aspc的核苷酸序列

<400>2