本發(fā)明適用于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的方法。

背景技術(shù)：

a,ω-長(zhǎng)鏈二元酸是指含有10個(gè)以上碳原子的直鏈二元羧酸。它是一類用途很廣的重要精細(xì)化工原料，廣泛應(yīng)用于芳香劑、防腐劑和聚合物等。

a,ω-長(zhǎng)鏈二元酸在自然界不存在，目前根據(jù)長(zhǎng)鏈二元酸的不同碳原子個(gè)數(shù)有兩種方法進(jìn)行生產(chǎn)，一種是化學(xué)合成法，一種是生物發(fā)酵法?；ず铣煞ㄖ饕且允驮线M(jìn)行生物轉(zhuǎn)化(liuetal.,2011，biomacromolecules，12:3291–3298)，但是采用化學(xué)法生產(chǎn)有其局限性，首先是化學(xué)合成法的條件苛刻、生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而且產(chǎn)物產(chǎn)率低、危險(xiǎn)性大、易污源環(huán)境。微生物發(fā)酵法則相對(duì)來說條件比較溫和，而且污染較小。

關(guān)于微生物發(fā)酵法，目前有報(bào)道在利用煉油副產(chǎn)物如十二烷烴或其衍生物作為底物(w.luetal.,2010,chem.soc.,132,15451./p.fickersetal.,2005,biotechnol.lett.,27,859.)，利用酵母進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸。但是以煉油副產(chǎn)物十二烷烴或其衍生物作為底物會(huì)存在供給限制，而且原料不可持續(xù)性，而且酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵周期長(zhǎng)，增大了成本，產(chǎn)物多樣性比較差，因此尋找或構(gòu)建一些發(fā)酵周期短，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單微生物或重組菌株利用可持續(xù)性原料進(jìn)行此類發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的意義。

目前也有在大腸桿菌中通過表達(dá)ω-羥化酶，如食油假單胞來源alk系列單氧酶(manfredschreweetal.,catal.2011,353,3485–3495)或者細(xì)胞色素p450系列單氧酶(sumirehondamalcaetal.,commun.,2012,48,5115–5117)等，將添加的底物脂肪烴、脂肪酸酸或者脂肪酸甲酯等轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羥基化產(chǎn)物，如果產(chǎn)物是ω-羥基脂肪酸則可以在醇還原酶和醛還原酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為a,ω-二元酸。大腸桿菌生長(zhǎng)周期比酵母短，但是這種轉(zhuǎn)化方式需要外源添加底物，而且不同鏈長(zhǎng)脂肪烷烴或其衍生物進(jìn)入細(xì)胞困難，雖然也有通過表達(dá)外膜蛋白alkl基因(mattijsketal.,2012,appliedandenvironmentalmicrobiology,5724–5733)提高脂肪酸甲酯的細(xì)胞輸入，但是相對(duì)來說產(chǎn)率還是比較低。因此如何能讓細(xì)胞自行進(jìn)行相應(yīng)鏈長(zhǎng)脂肪烷烴或其衍生物的合成，進(jìn)而進(jìn)一步在胞內(nèi)通過末端羥化酶進(jìn)行氧化是本領(lǐng)域技術(shù)人員研究的方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的方法，即在基因工程微生物中利用可持續(xù)碳源實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)鏈二元酸的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種重組大腸桿菌菌株，所述重組大腸桿菌菌株是通過敲除或弱化了大腸桿菌中的脂肪酸β-氧化降解的路徑基因獲得的。

本發(fā)明提供的另一個(gè)目的是提供一種由上述重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的方法，所述的方法是通過所述重組大腸桿菌菌株利用可持續(xù)性碳源積累得到長(zhǎng)鏈脂肪酸，并進(jìn)一步將所述長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化得到長(zhǎng)鏈二元酸。

具體的，所述方法通過在所述重組大腸桿菌菌株中表達(dá)長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成基因以及調(diào)控基因得到所述的長(zhǎng)鏈脂肪酸。

更為具體的，所述長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成基因?yàn)榫哂行蛄斜碇衧eqidno:1核苷酸序列的加州月桂來源的硫酯酶fatb基因。

更為具體的，所述長(zhǎng)鏈脂肪酸的調(diào)控基因?yàn)榇竽c桿菌來源的fadr基因。

具體的，所述方法通過在所述重組大腸桿菌菌株中表達(dá)ω-羥化酶、醇還原酶和醛還原酶，從而將積累的所述的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化形成所述的長(zhǎng)鏈二元酸。

更為具體的，所述的ω-羥化酶包括alkbfgt系列單氧酶和細(xì)胞色素p450羥化酶。

更為具體的，所述的醇還原酶為醇還原酶alkj。

更為具體的，所述的醛還原酶為醛還原酶alkh。

具體的，所述的碳源為葡萄糖。

由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明中通過構(gòu)建重組大腸桿菌菌株，利用可持續(xù)性碳源生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸，其主要通過在野生型的大腸桿菌菌株中敲除脂肪酸β-氧化降解的路徑基因構(gòu)建重組菌株，而后在此重組菌株中共表達(dá)長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成基因以及調(diào)控基因以進(jìn)行長(zhǎng)鏈脂肪酸的積累，而后在此菌株中通過表達(dá)ω-羥化酶、醇還原酶和醛還原酶，將積累的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化成長(zhǎng)鏈二元酸。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中采用化學(xué)法制備長(zhǎng)鏈二元酸過程中所存在的反應(yīng)條件苛刻、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、危險(xiǎn)性大、易污染環(huán)境的問題，同時(shí)還大大提高了產(chǎn)物的產(chǎn)率。

附圖說明

圖1為實(shí)施例4中十二碳脂肪酸ω-羥化過程；

圖2為實(shí)施例4中pgec47質(zhì)粒alk羥化酶體系示意圖；

圖3為實(shí)施例6中cyp153am.aq.-cprbm3融合蛋白反應(yīng)機(jī)理結(jié)構(gòu)圖；

圖4為實(shí)施例7中mj1/pgec47ms檢測(cè)結(jié)果圖；

圖5為實(shí)施例7中mj1/pez07-alkbfgtms檢測(cè)結(jié)果圖；

圖6為實(shí)施例7中mj1/pez07-cb3mms檢測(cè)結(jié)果圖；

圖7為實(shí)施例9中mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgtms檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面來對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例1重組菌株mj1的構(gòu)建

a,ω-十二碳二元酸合成的前體物是十二元酸，但是在細(xì)胞內(nèi)脂肪酸會(huì)在fadd基因編碼的脂肪acyl-coa合成酶、fade基因編碼的acyl-coa脫氫酶和fadb基因編碼的enoyl-coa等的作用下通過β-氧化途徑逐步降解。因此，首先需要將β-氧化途徑基因進(jìn)行阻斷或者弱化，使細(xì)胞可以在其他脂肪酸合成酶基因的表達(dá)下能夠積累脂肪酸。

以野生型w3110菌株作為基礎(chǔ)菌株敲除fadd基因弱化脂肪酸降解路徑，菌體構(gòu)建過程為：以pkd4為模板，引物對(duì)fadd-k-f/fadd-k-r擴(kuò)增敲除片段(引物序列見表1)，電轉(zhuǎn)化大w3110電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于卡那抗性平板篩選，得到的克隆利用驗(yàn)證引物fadd-200-f/fadd-200-r進(jìn)行菌液pcr驗(yàn)證(引物序列見表1)，得到的重組菌株w3110(δfadd)，即mj1菌株。

具體的構(gòu)建用引物和構(gòu)建方法詳見文獻(xiàn)介紹。(datsenkoka,wannerbl.,2000,procnatlacadsciusa,97:6640–6645./tomoyababaetal.,2006,molecularsystemsbiology.)

實(shí)施例2長(zhǎng)鏈脂肪酸合成表達(dá)質(zhì)粒pez07-fatb的構(gòu)建

根據(jù)seqidno:1，合成加州月桂umbellulariacalifornica來源的acyl-[acp]thioesterase基因fatb，連入puc57載體(購(gòu)自蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司)，獲得質(zhì)粒puc57-fatb。fatb基因主要用于催化長(zhǎng)鏈脂肪酸，尤其是十二碳脂肪酸的合成。

利用無縫克隆重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pez07-fatb。pez07是本實(shí)驗(yàn)室利用利用biovector中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞基因保藏中心的ptrc99a和pcl1920構(gòu)建的，具有奇霉素抗性并以trc為啟動(dòng)子的低拷貝質(zhì)粒。以上述基因合成的質(zhì)粒puc57-fatb為模板，引物對(duì)fatb-n-f/fatb-x-r擴(kuò)增兩端分別含有同源區(qū)域的基因fatb(引物對(duì)序列見表1)，并進(jìn)行回收；回收后通過無縫克隆重組酶將fatb基因與ncoi和xhoi雙酶切回收的載體pez07進(jìn)行ezclone，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞tg1，完成質(zhì)粒pez07-fatb的構(gòu)建。最后將構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒pez07-fatb轉(zhuǎn)化宿主mj1，得到mj1/pez07-fatb。

將上述構(gòu)建的到的重組菌株和對(duì)照菌株mj1/pez07進(jìn)行搖瓶發(fā)酵檢測(cè)十二碳脂肪酸的合成。具體發(fā)酵過程如下：首先分別接種上述2個(gè)重組菌的3個(gè)不同轉(zhuǎn)化子接種于4ml添加100ng/mlspe抗性的lb培養(yǎng)基，于37℃、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，分別取過夜培養(yǎng)的菌液100ul加入到2ml含spe抗性的lb培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)3.5h左右，全部加入到18ml的改良m9發(fā)酵培養(yǎng)基中，改良m9發(fā)酵培養(yǎng)基配方及微量元素tm2母液成分詳見表2。然后，轉(zhuǎn)接過后于37℃、250rpm培養(yǎng)4-5h，每瓶加入誘導(dǎo)劑iptg使其終濃度為1mm，繼續(xù)37℃、250rpm培養(yǎng)過夜。最后，發(fā)酵過夜后取出400ul發(fā)酵液加入800ul的氯仿，將離心管置于渦旋振蕩器上劇烈震蕩，震蕩5-10min后將離心管在12000rpm離心1min，吸取下層0.22um有機(jī)濾膜進(jìn)行g(shù)c檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照菌株mj1/pez07沒有十二碳脂肪酸檢測(cè)到，而菌株mj1/pez07-fatb可以檢測(cè)到0.45g/l十二碳脂肪酸，依據(jù)ms結(jié)果產(chǎn)物為飽和和不飽和十二碳脂肪酸混合物，具體為十二酸和5-烯十二酸，其結(jié)構(gòu)式分別為式a和式b。

上述結(jié)果說明，表達(dá)加州月桂來源的fatb可以實(shí)現(xiàn)十二碳脂肪酸的合成，但是目前的產(chǎn)量偏低，還需要進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)一步提高其產(chǎn)量。

表1質(zhì)粒構(gòu)建引物表

表2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配制及tm2母液成分如表2-1與2-2所示：

表2-1

表2-2

實(shí)施例3長(zhǎng)鏈脂肪酸合成表達(dá)質(zhì)粒pez07-fatb的構(gòu)建

大腸桿菌fadr基因是脂肪酸合成和降解相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因的一個(gè)調(diào)控子，文獻(xiàn)顯示過表達(dá)fadr有助于提高脂肪酸的合成量，因此在實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒pez07-fatb的基礎(chǔ)上再共表達(dá)fadr基因，以期提高十二碳脂肪酸的產(chǎn)量。

利用無縫克隆重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pez07-fatb-fadr。以mg1655基因組為模板，引物對(duì)fadr-p-f/fadr-h-r擴(kuò)增兩端分別含有同源區(qū)域的基因fatr(引物對(duì)序列見表1)，并進(jìn)行回收；回收后通過無縫克隆重組酶將fadr基因與psti和hindiii雙酶切回收的質(zhì)粒pez07-fatb進(jìn)行ezclone，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞tg1，完成質(zhì)粒pez07-fatb-fadr的構(gòu)建。最后將構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒pez07-fatb-fadr轉(zhuǎn)化宿主mj1，得到mj1/pez07-fatb-fadr。

按照實(shí)施例1的搖瓶發(fā)酵方法進(jìn)行mj1/pez07-fatb、mj1/pez07-fatb-fadr搖瓶發(fā)酵比較。gc結(jié)果顯示mj1/pez07-fatb、mj1/pez07-fatb-fadr得到的十二碳脂肪酸的含量分別為0.55g/l和3.55g/l，上述結(jié)果說明fadr基因的表達(dá)可以有效的提高脂肪酸的合成。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明可以在大腸桿菌中利用可持續(xù)性碳源，如葡萄糖等進(jìn)行長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，因此后面需要尋找合適的羥化酶基因，將合成的長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)一步氧化還原成長(zhǎng)鏈二元酸。

實(shí)施例4含alk羥化酶體系質(zhì)粒pgec47表達(dá)確認(rèn)

上述實(shí)施例中重組菌株積累的十二碳脂肪酸需要合適的ω-羥化酶才能轉(zhuǎn)化成十二碳二元酸，參考相關(guān)文獻(xiàn)信息，本發(fā)明選取了2種ω-羥化酶alk系列和細(xì)胞色素p450系列ω-羥化酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化和表達(dá)比較，以期獲得酶活較高的羥化酶進(jìn)行上述氧化反應(yīng)，ω-羥化反應(yīng)過程詳見圖1。

alk體系羥化酶主要來自pgec47，大小為34902bp，其具有烷烴羥化酶體系，可使微生物在以中鏈烷烴(c6-c12)為唯一碳源的條件下，將烷烴進(jìn)行ω-羥化，進(jìn)入β-氧化途徑供菌體生長(zhǎng)，alk相關(guān)基因詳見圖2。pgec47質(zhì)粒alk羥化酶體系主要含有兩個(gè)操縱子，一個(gè)是alkst，一個(gè)是alkbfgthijk。alks基因主要是編碼一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在有中鏈烷烴存在的情況下，激活alk啟動(dòng)子及其后各基因的表達(dá)。alkb是一類亞鐵血紅素單氧酶，反應(yīng)過程用兩個(gè)電子還原氧原子生成水，另一個(gè)氧原子被整合到底物末端的甲基位置完成氧化，這個(gè)反應(yīng)過程除了alkb基因外，還需要一個(gè)可溶的nadh-紅素養(yǎng)還蛋白還原酶基因alkt和可溶的紅素養(yǎng)還蛋白alkg，三者一起構(gòu)成ω-單氧酶，有文獻(xiàn)報(bào)道alkbgt還可以將ω-羥化產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行氧化成ω-醛和酸，但是酶活性要低很多。alkh和alkj分別為醇還原酶和醛還原酶，可以將ω-羥化產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行氧化成ω-醛和ω-酸。

首先要確認(rèn)構(gòu)建的質(zhì)粒pgec47是否可以使其宿主微生物在烷烴或其衍生物為唯一碳源的培養(yǎng)基中存活。將pgec47轉(zhuǎn)化宿主mj1，得到重組菌株mj1/pgec47，將此菌株單克隆在上述搖瓶發(fā)酵固體培養(yǎng)基平板上劃線，此固體培養(yǎng)基添加抗生素12.5mg/l四環(huán)素和100mg/l奇霉素，此外不添加葡萄糖，改用2.5mm癸酸甲酯作為碳源，同時(shí)添加0.025％雙環(huán)丙基酮dcpk作為誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)2天左右劃線處有菌落出現(xiàn)，接種抗性試管生長(zhǎng)正常，鏡檢為大腸桿菌，說明購(gòu)買的pgec如文獻(xiàn)所述可以使其微生物在烷烴或其衍生物為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)，說明alk系列基因功能正常。

實(shí)施例5alk羥化酶相關(guān)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

首先構(gòu)建pez07-alkbfgt質(zhì)粒檢驗(yàn)單氧化反應(yīng)。以pgec47質(zhì)粒為模板，引物對(duì)bfg-n-f/bfg-x-r擴(kuò)增基因alkbfg(引物序列見表1)，并進(jìn)行回收；回收后通過無縫克隆重組酶將alkbfg基因與ncoi和xhoi雙酶切回收的載體pez07進(jìn)行無縫克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞tg1，完成質(zhì)粒pez07-alkbfg的構(gòu)建。隨后將質(zhì)粒pez07-alkbfg進(jìn)行xhoi和ecori雙酶切，和以pgec47質(zhì)粒為模板，引物對(duì)alkt-xhoi-f/alkt-ecori-r擴(kuò)增的基因片段alkt進(jìn)行無縫克隆(引物序列見表1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，完成質(zhì)粒pez07-alkbfgt的構(gòu)建。將質(zhì)粒pez07-alkbfgt轉(zhuǎn)化宿主mj1，得到重組菌株mj1/pez07-alkbfgt，隨后會(huì)在搖瓶發(fā)酵過程添加底物癸酸甲酯檢測(cè)其羥化酶活力。

實(shí)施例6細(xì)胞色素p450系列羥化酶相關(guān)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

脂肪酸的ω-端氧化還可以被細(xì)胞色素p450進(jìn)行催化，而細(xì)菌cyp153a單氧酶對(duì)c5-c12烷烴或其衍生物具有較高的ω-羥化能力。德國(guó)學(xué)者danielscheps將海桿菌屬來源的cyp153a與芽孢桿菌來源p450bm3的還原酶基因進(jìn)行融合，得到的融合蛋白cyp153am.aq.-cprbm3可以將實(shí)現(xiàn)十二碳脂肪酸或其相應(yīng)脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化到ω-羥基十二碳脂肪酸，融合蛋白及反應(yīng)過程詳見圖3，而且scheps研究結(jié)果顯示將此融合蛋白基因的g307a進(jìn)行點(diǎn)突變后會(huì)顯著提高其轉(zhuǎn)化活力。

根據(jù)seqidno:2，合成cb3m即cyp153am.aq.-cprbm3基因，且含有點(diǎn)突變g307a，連入puc57載體(購(gòu)自蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司)，獲得質(zhì)粒puc57-cb3m。

以puc57-cb3m質(zhì)粒為模板，引物對(duì)cb3m-ncoi-f/cb3m-xhoi-r擴(kuò)增基因cb3m(引物序列見表1)，并進(jìn)行回收；回收后通過無縫克隆重組酶將cb3m基因與ncoi和xhoi雙酶切回收的載體pez07進(jìn)行無縫克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞tg1，完成質(zhì)粒pez07-cb3m的構(gòu)建。將質(zhì)粒pez07-cb3m轉(zhuǎn)化宿主mj1，得到重組菌株mj1/pez07-cb3m，隨后在搖瓶發(fā)酵過程添加底物癸酸甲酯檢測(cè)其羥化酶活力。

實(shí)施例7alk羥化酶和細(xì)胞色素p450羥化酶轉(zhuǎn)化能力搖瓶比較

上述構(gòu)建的2類羥化酶轉(zhuǎn)化宿主后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，通過添加底物癸酸甲酯檢測(cè)羥化產(chǎn)物進(jìn)行酶活轉(zhuǎn)化能力比較。選擇癸酸甲酯而沒有選擇十二碳酸，主要是因?yàn)槭技柞ズ褪贾舅峤Y(jié)構(gòu)相似，而且比十二碳脂肪酸更容易進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。羥化過程和圖1類似，底物和可能的三種產(chǎn)物分子量分別是186、202、200、216。通過gc圖譜或者ms分析判定是否發(fā)生羥化反應(yīng)。

與實(shí)施例1發(fā)酵過程類似，將上述構(gòu)建得到的兩種羥化酶的重組菌株以及對(duì)照菌株mj1/pgec47分別接種于4ml添加100ng/mlspe抗性的lb培養(yǎng)基，于37℃、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，分別取過夜培養(yǎng)的菌液100ul加入到2ml含spe抗性的lb培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)3.5h左右，全部加入到18ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接過后于37℃、250rpm培養(yǎng)4-5h，添加底物癸酸甲酯，使其終濃度為5g/l，同時(shí)加入誘導(dǎo)劑iptg使其終濃度為1mm，繼續(xù)37℃、250rpm培養(yǎng)過夜。最后，發(fā)酵過夜后取出400ul發(fā)酵液加入800ul的氯仿，震蕩5-10min后將離心管在12000rpm離心1min，0.22um有機(jī)濾膜進(jìn)行g(shù)c檢測(cè)。

gc檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照菌株mj1/pez07相比gc圖譜在除底物位置還有2個(gè)出峰，但是很小，因此將樣品進(jìn)行ms檢測(cè)確認(rèn)。

mj1/pgec47菌株的總離子流ms檢測(cè)結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示底物癸酸甲酯含量已經(jīng)很低，即分子量186，ms顯示187；而且主要產(chǎn)物是3步羥化產(chǎn)物，即分子量為216，ms顯示217；其次是1步羥化產(chǎn)物，即分子量為202，ms顯示203。

mj1/pez07-alkbfgt菌株的總離子流ms檢測(cè)結(jié)果顯示底物殘留的很多，產(chǎn)物量相比對(duì)照少很多(結(jié)果未顯示)。提取離子流結(jié)果見圖5，結(jié)果顯示mj1/pez07-alkbfgt菌株的主要產(chǎn)物是1步羥化產(chǎn)物，即分子量為202，ms顯示203，也有少量的3步羥羥產(chǎn)物，即分子量為216，ms顯示217。

mj1/pez07-cb3m菌株的總離子流ms檢測(cè)結(jié)果顯示底物殘留的很多，產(chǎn)物量相比對(duì)照少很多(結(jié)果未顯示)，與mj1/pez07-alkbfgt菌株結(jié)果類似。提取離子流結(jié)果見圖6，結(jié)果顯示，mj1/pez07-cb3m菌株的只有1步羥化產(chǎn)物，即分子量為202，ms顯示203，無其他產(chǎn)物可以檢測(cè)到。

上述結(jié)果說明：1)mj1/pez07-alkbfgt和mj1/pez07-cb3m都可以實(shí)現(xiàn)癸酸甲酯的羥化轉(zhuǎn)化反應(yīng)；而且mj1/pez07-alkbfgt如文獻(xiàn)報(bào)道，可以進(jìn)行3步羥化反應(yīng)，后面兩步的催化活力顯然沒有第一步羥化快；2)mj1/pez07-alkbfgt相比較與mj1/pez07-cb3m可能具有更好的轉(zhuǎn)化能力。

隨后在脂肪酸合成基因基礎(chǔ)上表達(dá)alkbfgt進(jìn)行初步驗(yàn)證。

實(shí)施例8二元酸重組菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt的構(gòu)建

實(shí)施6比較可以看出alk系列羥化酶可能具有更高的轉(zhuǎn)化活力，因此將其構(gòu)建到pez07-fatb-fadr上，期望將脂肪酸合成加強(qiáng)基因和羥化基因共表達(dá)后可以得到十二碳的ω-一步或多步羥化產(chǎn)物。

質(zhì)粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt重組質(zhì)粒構(gòu)建過程如下：首先，質(zhì)粒pez07-fatb-fadr用hindiiisali雙酶切，回收；然后，以pez07-alkbfgt質(zhì)粒為模板，利用引物對(duì)bt-hindiii-f/bt-sali-r擴(kuò)增基因alkbfgt，并進(jìn)行回收；最后將酶切回收的質(zhì)粒和擴(kuò)增回收的片段通過無縫克隆重組酶進(jìn)行無縫重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞tg1，完成質(zhì)粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt的構(gòu)建。將質(zhì)粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt轉(zhuǎn)化宿主mj1，得到重組菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt，理論上此菌株具有脂肪酸合成和羥化酶基因，搖瓶發(fā)酵可以得到ω-羥基脂肪酸。

實(shí)施例9重組菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt搖瓶發(fā)酵

將上述構(gòu)建的重組菌株mj1/pez07-fatb-fadr、mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt分別挑取3個(gè)克隆接種于4ml添加100ng/mlspe抗性的lb培養(yǎng)基，于37℃、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，分別取過夜培養(yǎng)的菌液100ul加入到2ml含spe抗性的lb培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)3.5h左右，全部加入到18ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接過后于37℃、250rpm培養(yǎng)4-5h，加入誘導(dǎo)劑iptg使其終濃度為1mm，繼續(xù)37℃、250rpm培養(yǎng)過夜。最后，發(fā)酵過夜后取出400ul發(fā)酵液加入800ul的氯仿，震蕩5-10min后將離心管在12000rpm離心1min，0.22um有機(jī)濾膜進(jìn)行g(shù)c檢測(cè)。

gc檢測(cè)結(jié)果顯示重組菌株mj1/pez07-fatb-fadr、mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt可檢測(cè)到的十二碳脂肪酸含量分別為3.2g/l和2.0g/l,初步可以判斷是有十二碳脂肪酸進(jìn)行其他的反應(yīng)，很有可能是ω-羥化，但是ω-羥化十二碳脂肪酸由于沸點(diǎn)高，因此需要進(jìn)行ms檢測(cè)確認(rèn)。mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt菌株ms檢測(cè)總離子流結(jié)果見圖7，結(jié)果顯示產(chǎn)物十二碳脂肪酸即ms顯示201基本沒有了，對(duì)比對(duì)照菌株mj1/pez07-fatb-fadr，而且可以看到ω-羥基十二元酸，即217出峰，但是產(chǎn)量不高，而且提取離子流可以看到很少量的a,ω-十二碳二元酸，即231出峰；此外兩個(gè)菌株的5-烯十二元酸占很大比例，而且看ms結(jié)果沒有相應(yīng)的羥化產(chǎn)物，可能是烯鍵存在的影響。

上述結(jié)果說明重組菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt可以實(shí)現(xiàn)十二元脂肪酸ω-羥基化，但是目前產(chǎn)物大多是ω-羥基十二元酸，因此需要在此質(zhì)?；A(chǔ)上進(jìn)一步表達(dá)alkh和alkj，它們分別是醇還原酶和醛還原酶，可以將ω-羥基脂肪酸進(jìn)一步氧化成ω-醛基脂肪酸和a,ω-十二碳二元酸。

實(shí)施例10ω-二元脂肪酸重組菌株構(gòu)建和搖瓶發(fā)酵

上述實(shí)施例中重組菌株mj1/pez07-alkbfgt雖然也有少量的3步羥化產(chǎn)物積累，但是含量相對(duì)來說還是很低，因此需要在此質(zhì)粒基礎(chǔ)上進(jìn)一步表達(dá)alkh和alkj，目標(biāo)是將ω-羥基脂肪酸全部轉(zhuǎn)化為a,ω-十二碳二元酸。

質(zhì)粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt-alkhj重組質(zhì)粒構(gòu)建過程如下：首先，質(zhì)粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt用sali單酶切，然后進(jìn)行去磷酸化處理和回收；然后，以pgec47質(zhì)粒為模板，利用引物對(duì)hj-sali-f/hj-sali-r擴(kuò)增基因alkhj(引物序列見表1)，并進(jìn)行回收；最后將酶切回收的質(zhì)粒和擴(kuò)增回收的片段通過無縫克隆重組酶進(jìn)行無縫重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞tg1，完成質(zhì)粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt-alkhj的構(gòu)建。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主mj1，得到重組菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt-alkhj，理論上此菌株已具備醇和醛還原酶基因，可以實(shí)現(xiàn)脂肪酸二元酸的生產(chǎn)。

將上述構(gòu)建的重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，過程和制樣檢測(cè)與實(shí)施例8類似。ms檢測(cè)總離子流與上述類似，5-烯十二元酸比例最大，其次ω-羥基十二元酸僅在提取離子流結(jié)果看到少量，大部分都是a,ω-十二碳二元酸，即231出峰，說明alkhj表達(dá)正常，可以實(shí)現(xiàn)將ω-羥基十二碳酸轉(zhuǎn)化成a,ω-十二碳二元酸。這些結(jié)果也說明了此大腸桿菌重組菌株可以實(shí)現(xiàn)利用可持續(xù)性碳源在微生物中進(jìn)行長(zhǎng)鏈二元脂肪酸的生產(chǎn)。在后續(xù)的研究過程首先需要減少不飽和脂肪酸的合成，最大化的提高長(zhǎng)鏈脂肪酸的產(chǎn)量；其次，關(guān)于羥化基因alk系列ω-羥化酶的表達(dá)還需要進(jìn)一步優(yōu)化，以其獲得更好的轉(zhuǎn)化效率。

綜上所述，本發(fā)明采用的微生物發(fā)酵法制備長(zhǎng)鏈二元酸，首先通過改造微生物使終端β-氧化降解；然后，在改造后的微生物中表達(dá)脂肪酸合成酶和脂肪酸合成調(diào)節(jié)基因，利用可持續(xù)性碳源葡萄糖為原料使細(xì)胞積累a,ω-十二碳二元酸的前體物十二元酸；最后，在此基礎(chǔ)上再表達(dá)脂肪酸羥化酶、脂肪醇和醛還原酶等，使細(xì)胞積累的十二元酸逐步轉(zhuǎn)化為a,ω-十二元酸。整個(gè)制備過程，條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境友好，且產(chǎn)物產(chǎn)率更高。

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110>河北美邦工程科技股份有限公司

<120>一種重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的方法

<160>20

<210>1

<211>906

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<211>51

<212>dna

<213>人工序列酸序列

<400>19

1gtcgacgagtataaaattacctgattagagtcattctaggtaattcaggac

<210>20

<211>47

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<213>人工序列

<400>20

1gatgatgatgatgatggtcgacttacatgcagacagctatcatggcc