本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有高生長速率的微藻突變體藻株的篩選方法和應(yīng)用。特別涉及一種通過結(jié)合群體dna遺傳圖譜技術(shù)aflp和流式細(xì)胞技術(shù)篩選微藻快速生長突變體的方法。該方法篩選迅速，結(jié)果可靠。

背景技術(shù)：

微藻屬于古老的低等植物，廣泛分布于湖泊、海洋等水域，具有高效吸收太陽能，固定二氧化碳進(jìn)行快速增殖的能力(光合作用)。同時微藻細(xì)胞可以生產(chǎn)多種高價值的營養(yǎng)物質(zhì)及化工原料，如類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、多糖、油脂等。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，能源短缺問題亟待解決。在經(jīng)歷了兩代生物質(zhì)能源的開發(fā)后(乙醇、纖維素乙醇)，微藻以其增殖快、油脂占細(xì)胞干重大、不與人爭糧不與糧爭地、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)漸漸發(fā)展成為第三代生物質(zhì)能源的主力。

目前生產(chǎn)中所用藻種多是從自然界直接分離所得的野生種，其后代性狀單一且容易產(chǎn)生藻種退化。所以有必要人為地對現(xiàn)有藻種進(jìn)行育種改良。目前主要的育種手段有：從自然界篩選的天然藻種、經(jīng)物理化學(xué)誘變得到的突變體、基因工程手段得到的轉(zhuǎn)基因藻種。每個方法都有自身的優(yōu)缺點(diǎn)：天然藻種篩選工作量大且存在藻種退化的現(xiàn)象，物理化學(xué)誘變專一性不強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因表達(dá)不穩(wěn)定。

中國專利201410844238.2涉及熒光顯微篩檢生長快和油脂含量高的微藻單細(xì)胞。該方法利用顯微鏡圖像處理軟件通過拍攝的顯微鏡圖像對藻細(xì)胞的顏色進(jìn)行定量化數(shù)據(jù)分析，篩選出生長速率快的優(yōu)勢微藻單細(xì)胞。但該方法忽視了藻細(xì)胞大小及每個藻細(xì)胞葉綠素含量的個體差異。比如，若一個藻細(xì)胞較大，其每個細(xì)胞葉綠素含量較高，所得熒光顯微的圖片顏色較深，但可能其細(xì)胞數(shù)量并不高，故而顏色較深不能說明該藻株具有生長較快的優(yōu)勢。

中國專利申請201310691127.8涉及一種微藻藻株人工選育方法。該方法利用常壓室溫等離子體對野生藻株進(jìn)行誘變，利用酶標(biāo)儀或者具有孔板掃描功能的分光光度計對孔板培養(yǎng)的微藻od值進(jìn)行測定，獲得藻細(xì)胞生長情況。但該方法不能準(zhǔn)確得出優(yōu)勢藻種具體的細(xì)胞濃度及增長比例，并且突變體株的穩(wěn)定性有待驗(yàn)證。

中國專利申請201510127466.2涉及一種快速生長微藻藻株高通量篩選系統(tǒng)和方法。該方法是利用微流控系統(tǒng)，將微藻細(xì)胞洗滌并分散到凝膠至適當(dāng)濃度，注入到微流控芯片中，形成單分散單細(xì)胞液滴，對包裹在油相中的微球進(jìn)行去油、過濾、再分散，于恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；通過倒置顯微鏡成像判別是否存在活細(xì)胞及細(xì)胞生長速度的快慢，通過隨機(jī)間隔取樣采集凝膠放大圖片，并對有細(xì)胞生長的凝膠微球進(jìn)行計數(shù)，進(jìn)而監(jiān)測微藻在單細(xì)胞水平的生長狀況。但該方法涉及復(fù)雜的微流控系統(tǒng)的建立并且要解決如何防止污染的問題。

中國專利申請201310164886.9涉及提高微藻生長速率和油脂產(chǎn)率的方法。該申請中利用適應(yīng)進(jìn)化來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即不通過基因工程手段而活化潛在途徑、強(qiáng)化特定代謝表型或提高環(huán)境適應(yīng)能力。培養(yǎng)微生物到達(dá)一定的指標(biāo)(細(xì)胞密度、生長速率或底物消耗等)后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，不斷重復(fù)這個過程直至代謝表型不再變化。但該方法只是盲目的傳代20-200個培養(yǎng)循環(huán)，導(dǎo)致傳代次數(shù)過多，培養(yǎng)周期過長。

由于已有方法中的不足，本領(lǐng)域中仍然需要更加高效、可靠的微藻突變體特別是快速生長突變體的篩選方法。

發(fā)明簡述

在本發(fā)明中，將物理化學(xué)誘變、天然藻種篩選的方法與群體dna遺傳圖譜技術(shù)結(jié)合，通過分析代間遺傳背景差異，避免了常規(guī)藻種篩選中不斷傳代的盲目性，同時可以解決物理化學(xué)誘變突變株的不穩(wěn)定遺傳的問題。

本發(fā)明的一具體實(shí)例中，對化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate，ems)誘變處理后的雨生紅球藻nies-144藻株傳代培養(yǎng)，傳代期間利用群體dna遺傳圖譜分析技術(shù)——擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，aflp)監(jiān)測不同代間遺傳背景的變化趨勢，用來確定傳代培養(yǎng)次數(shù)，進(jìn)而利用流式細(xì)胞技術(shù)快速篩選出生長優(yōu)勢突變體藻株。

附圖說明

圖1為用10對高多態(tài)性引物擴(kuò)增所得的f0-f14代的aflp遺傳圖譜。

圖2示出f0-f14代遺傳背景的變化趨勢。

圖3篩選出的3株血球藻nies-144的快速生長突變體與野生型生長曲線對比。

發(fā)明詳述

在第一方面，本發(fā)明提供了一種篩選微藻細(xì)胞突變體的方法，包括以下步驟：

a)對微藻細(xì)胞群體進(jìn)行誘變，或提供包含微藻細(xì)胞突變體的微藻細(xì)胞群體；

b)對經(jīng)誘變的微藻細(xì)胞群體或所述包含微藻細(xì)胞突變體的微藻細(xì)胞群體進(jìn)行傳代；

c)通過群體dna遺傳圖譜技術(shù)分析每代的微藻細(xì)胞群體的遺傳背景；

d)根據(jù)群體遺傳背景的變化確定最佳傳代；和

e)對處于最佳傳代的微藻細(xì)胞群體進(jìn)行篩選，獲得期望的微藻細(xì)胞突變體。

在一些實(shí)施方案中，所述誘變是隨機(jī)誘變，例如化學(xué)誘變或輻射誘變，優(yōu)選甲基磺酸乙酯(ems)誘變。本領(lǐng)域已知的其他誘變方法也可用于本發(fā)明的方法中，只要其能夠在微藻細(xì)胞群體中產(chǎn)生期望的突變。在一些實(shí)施方案中，所述微藻細(xì)胞突變體是天然突變體。

在一些實(shí)施方案中，所述群體dna遺傳圖譜技術(shù)包括但不限于限制性酶切片段長度多態(tài)性(rflp)、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性dna(rapd)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(aflp)、短串聯(lián)重復(fù)序列dna遺傳多態(tài)性分析(str)和單核苷酸多態(tài)性分析(snp)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述群體dna遺傳圖譜技術(shù)是擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(aflp)。如何執(zhí)行群體dna遺傳圖譜技術(shù)屬于本領(lǐng)域上技術(shù)人員的能力范圍。

可以通過本發(fā)明的方法篩選突變體的微藻可以是各種微藻，包括但不限于小球藻(chlorella)、眼蟲藻(euglenagracilis)、柵藻(scenedesmus)、扁藻(tetraselmisgracilis)、菱形藻(nitzschia)、富油新綠藻(neochlorisoleoabundans)、微擬球藻(nannochloropsis)、杜氏藻(dunaliella)和血球藻(haematococcuspluvialis)。在一具體實(shí)施方式中，所述微藻是血球藻。

在一些實(shí)施方案中，所要篩選的微藻突變體是快速生長突變體。在相同培養(yǎng)條件下，目標(biāo)微藻細(xì)胞突變體相對于相應(yīng)的野生型微藻細(xì)胞具有增加的生長速率。生長速率例如可以通過細(xì)胞數(shù)目或生物質(zhì)計算。例如，所述微藻細(xì)胞突變體的生長速率相對于相應(yīng)的野生型微藻細(xì)胞增加大約50％-500％，例如增加大約50％、大約100％、大約150％、大約200％、大約250％、大約300％、大約350％、大約400％、大約450％或大約500％。

在一些實(shí)施方案中，其中步驟d)中將群體遺傳背景經(jīng)歷劇烈變化后，其群體遺傳背景與前一代相比無明顯變化或變化較少的一代確定為最佳傳代。例如，在使用alfp分析群體遺傳背景的實(shí)施方案中，可以通過比較相鄰兩代之間dna擴(kuò)增條帶的差異來顯示遺傳背景的變化程度。通常而言，在傳代開始時，野生型微藻細(xì)胞占優(yōu)勢，因此群體遺傳背景變化較小。隨著傳代進(jìn)行，突變體微藻細(xì)胞(例如快速生長突變體微藻細(xì)胞)比例逐漸增加，這將伴隨著群體遺傳背景的劇烈變化。在傳代后期，突變體微藻細(xì)胞已經(jīng)占據(jù)主導(dǎo)地位，群體遺傳背景因而也趨于穩(wěn)定。此時，由于突變體細(xì)胞在群體中已經(jīng)占多數(shù)，可以停止傳代，開展后續(xù)的篩選，將更容易獲得期望的突變體，例如快速生長突變體。此外，由于經(jīng)過上述傳代，微藻的遺傳背景已經(jīng)趨于穩(wěn)定，因此獲得的期望的微藻突變體將很可能是能夠穩(wěn)定遺傳的突變體。根據(jù)本文上述教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定最佳的傳代數(shù)目。通過本發(fā)明的方法，可以更加高效、可靠地獲得穩(wěn)定遺傳的微藻突變體特別是快速生長突變體。

在本發(fā)明的方法的一些實(shí)施方案中，其中步驟e)中通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行所述篩選。使用流式細(xì)胞術(shù)可以對突變體微藻細(xì)胞進(jìn)行快速、精確、高通量篩選。

在第二方面，本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法獲得的微藻細(xì)胞突變體。

所述微藻可以是各種微藻，包括但不限于小球藻(chlorella)、眼蟲藻(euglenagracilis)、柵藻(scenedesmus)、扁藻(tetraselmisgracilis)、菱形藻(nitzschia)、富油新綠藻(neochlorisoleoabundans)、微擬球藻(nannochloropsis)、杜氏藻(dunaliella)和血球藻(haematococcuspluvialis)。在一具體實(shí)施方式中，所述微藻是血球藻。

在一些實(shí)施方案中，所述微藻突變體是快速生長突變體。在相同培養(yǎng)條件下，所述微藻細(xì)胞突變體相對于相應(yīng)的野生型微藻細(xì)胞具有增加的生長速率。例如，所述微藻細(xì)胞突變體的生長速率相對于相應(yīng)的野生型微藻細(xì)胞增加大約50％-500％，例如增加大約50％、大約100％、大約150％、大約200％、大約250％、大約300％、大約350％、大約400％、大約450％或大約500％。在一些實(shí)施方案中，所述微藻突變體能夠穩(wěn)定遺傳。

實(shí)施例

現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實(shí)施例來描述本發(fā)明。

實(shí)施例1、血球藻的活化及預(yù)培養(yǎng)：

從固體平板上挑取血球藻nies-144單克隆藻株接種于含10mlbasal液體培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，15μmol·m^-2·s^-1、20℃下靜置培養(yǎng)10d，轉(zhuǎn)接入含100mlbasal培養(yǎng)基的250ml三角瓶里同等條件下培養(yǎng)4d。1500g，5min離心收集藻細(xì)胞。

實(shí)施例2、ems化學(xué)誘變藻細(xì)胞：

1、1500g，5min離心收集對數(shù)期血球藻細(xì)胞，用4％ems(甲基磺酸乙酯)處理1h；1500g，5min離心去除誘變劑。

2、50ml硫代硫酸鈉na2s2o3重懸細(xì)胞以終止誘變反應(yīng)。

3、離心去除硫代硫酸鈉，用basal培養(yǎng)基清洗藻細(xì)胞兩次，最后重懸于basal培養(yǎng)基中并避光24h。

4、將誘變后的藻細(xì)胞接種于250ml三角瓶，記為f0代，15μmol·m^-2·s^-1、20℃下靜置培養(yǎng)，待f0代恢復(fù)活力并長出新鮮藻細(xì)胞后依次傳代接種，分別記為f1、f2、f3.....。

實(shí)施例3、通過計算推測合適的傳代次數(shù)

假設(shè)初始接種量為n個細(xì)胞，其中包含一個快速生長突變體。

野生型增長到對數(shù)期可增長10倍，假設(shè)快速生長突變體到對數(shù)期可增長20倍，則可以通過計算當(dāng)該快速生長突變體比例增至50％時所需的傳代次數(shù)。

各代生長到對數(shù)期時快速生長突變體所占比例(fn)如下所示

當(dāng)fn＝50％時，若初始接種量n＝4x10⁴，則可推導(dǎo)出傳代次數(shù)n＝13.7。然而，由于誘變后獲得的突變體增長效率具有不確定性，以及初始接種量可能存在差異，實(shí)際中需要的傳代次數(shù)和理論計算會存在較大差異。因此仍然需要適于實(shí)踐的確定最佳傳代次數(shù)的方法。

實(shí)施例4、aflp檢測血球藻遺傳背景變化

1、收集經(jīng)誘變后每一代的藻細(xì)胞并用試劑盒(qiagenplantminikit)提取血球藻總dna。

2、限制性內(nèi)切酶ecori和msei37℃5min消化dna。隨后80℃處理5min使酶失活。注意酶切反應(yīng)的各成分需在室溫按照以下順序依次添加。

表1.利用限制性內(nèi)切酶消化基因組dna的反應(yīng)組成

3、酶切后的dna片段與接頭于25℃反應(yīng)10min。連接體系如下表2：

表2.酶切片段與接頭連接反應(yīng)的條件

4、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增：

兩輪pcr均采用20μl體系。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系如下表3所示：

表3.預(yù)擴(kuò)增pcr反應(yīng)體系

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)程序：

選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系如下表4所示：

表4.選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系

選擇性擴(kuò)增反應(yīng)程序：

5、pcr產(chǎn)物加變性緩沖液，90℃5min變性后置于冰上，配制20ml7％的聚丙烯酰胺膠，電泳緩沖液為1xtbe，所用儀器為li-cor4300。

上述實(shí)驗(yàn)過程中用到的接頭及兩輪pcr引物信息如下：

e-l、e-s、m-l、m-s為ecori和msei接頭引物，e-a，m-c為預(yù)擴(kuò)增引物，其余為熒光標(biāo)記的選擇性擴(kuò)增引物，選擇性擴(kuò)增引物兩兩配對可形成64對引物。

表5.接頭引物與擴(kuò)增引物

aflp結(jié)果如圖1所示。圖1顯示10對高多態(tài)性引物(1-2、1-7、2-3、2-7、3-2、4-3、4-4、5-4、8-3、8-4)所擴(kuò)增得到的條帶有所差異。通過這些差異，可以顯示出不同代之間的變化。起初突變體混合液遺傳背景復(fù)雜，所以11代之前的dna遺傳背景變化較大并沒有穩(wěn)定下來，11代之后隨著傳代次數(shù)的增加，生長優(yōu)勢株突變體逐漸占據(jù)較高比例，所以11代之后的遺傳圖譜條帶變化不大，逐漸趨于穩(wěn)定。

圖2為f0-f14代遺傳背景的變化趨勢，更加直觀的顯示不同代之間遺傳背景的差異?？梢缘贸鼋臃N至第14代時，優(yōu)勢突變株已經(jīng)占據(jù)較高比例，與公式推導(dǎo)得出的最佳傳代次數(shù)相一致。此時aflp遺傳圖譜也顯示其dna背景趨于穩(wěn)定，可以進(jìn)行后續(xù)突變株的快速篩選。

實(shí)施例5、突變體篩選

aflp帶型逐漸穩(wěn)定之后，將血球藻突變體按照2500/5000/10000個細(xì)胞涂布于basal固體平板上，約1個月后長出單克隆，挑取出單克隆藻株接種到24孔板，長至對數(shù)期時用流式細(xì)胞儀檢測各藻株的細(xì)胞數(shù)，按照相同的接種量接種于12孔板并在第二天、第四天用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞濃度，即可代表各藻株的生長速度。從中挑選出生長速度較快的突變體。

挑選出的7個生長突變體用血球計數(shù)板計數(shù)的方法進(jìn)行復(fù)篩，進(jìn)一步驗(yàn)證挑選出的生長突變體的可重復(fù)性。

圖3示出了用上述方法篩選出的3株生長速度最快的突變株與野生型對比，這3株突變體相對野生型都有明顯的生長優(yōu)勢，最后生物質(zhì)相比野生型增長了47％。由此，說明以aflp技術(shù)為監(jiān)測基礎(chǔ)結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)的微藻快速生長突變體篩選方法是可行的。該方法所篩選到的突變體可以穩(wěn)定遺傳。