馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株及無痕基因組改造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種營養(yǎng)缺陷型菌株、以及一種基因改造方法，尤其涉及一種無痕基 因改造構(gòu)建的馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株、以及所述菌株的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酵母菌是一類低等的真核生物，它既具有類似原核生物的生長特性，又具有一般 真核生物的分子和細胞生物學(xué)特征。隨著分子生物學(xué)技術(shù)以及全基因組測序技術(shù)的快速發(fā) 展，酵母表達系統(tǒng)逐漸成為外源蛋白重組表達的有力工具。
[0003] 1981年Hitzeman首次在釀酒酵母中重組表達了人a干擾素，1986年第一個由 釀酒酵母表達的基因工程藥物乙型肝炎病毒表面抗原進入市場。此外，白細胞介素、多肽 類激素、乙型肝炎病毒表面抗原及凝乳酶、淀粉酶、甜味蛋白、血漿蛋白等先后在釀酒酵母 表達系統(tǒng)中得到重組表達。但釀酒酵母表達系統(tǒng)存在有不可忽視的局限性，如很難進行 高密度發(fā)酵、利用葡萄糖產(chǎn)生乙醇、外源基因的表達水平不高、分泌系統(tǒng)不理想，對于大于 30KD的蛋白幾乎不分泌等等。因此，科學(xué)家開發(fā)了不同類型的非常規(guī)酵母表達系統(tǒng)，包 括乳酸克魯維亞酵母（Kluyveromyceslactis)、粟酒裂殖糖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowialipolytica)、西方許旺氏酵母（Schwanuiomyces occidentalis)、多形漢遜酵母（Hansenulapolymorpha)和巴氏畢赤酵母（Pichia pastoris)等等，并實現(xiàn)了不同類型蛋白的在這些酵母系統(tǒng)中的重組表達，例如人白蛋白、 植酸酶等在畢赤酵母中的分泌表達量都超過了l〇g/L。畢赤酵母是能夠以甲醇為唯一C源 進行生長的酵母，具有高密度發(fā)酵，高水平分泌表達外源蛋白的優(yōu)勢，但該酵母以甲醇作為 C，在生產(chǎn)安全和食用安全性上都存在一定的局限性，同時發(fā)酵時間較長。
[0004] 酵母表達系統(tǒng)主要包括宿主菌和表達載體，其中，馬克思克魯維酵母已經(jīng)通過了 美國和歐洲的GRAS和QPS安全認證，其自身不僅被認為是安全的微生物菌株，同時也被認 為是可用于制備食品級重組蛋白（酶）的安全微生物菌株，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
[0005] 構(gòu)建新型酵母表達系統(tǒng)，首先要獲理想的酵母出發(fā)菌株，并建立恰當?shù)暮Y選標記。 篩選標記一般分為營養(yǎng)缺陷型篩選和抗生素篩選兩種。對于食用安全級別的酵母表達系 統(tǒng)，通常選用營養(yǎng)缺陷型篩選標記，包括URA3、HIS3、ADE2等。通過利用分子生物學(xué)的技術(shù) 手段，構(gòu)建營養(yǎng)缺陷型酵母菌株，實現(xiàn)表達外源蛋白的重組表達。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株、以及一種用于菌株改造的 無痕基因改造方法。
[0007] 本發(fā)明第一個方面是提供一種馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株，所述馬克思克魯 維酵母營養(yǎng)缺陷菌株是馬克思克魯維酵母菌株CGMCCNo. 10621敲除全部或部分營養(yǎng)基因 之后的菌株。
[0008] 其中，所述營養(yǎng)基因優(yōu)選為選自URA3基因、HIS3基因、ADE2基因中的任意一種或 幾種。
[0009] 其中，在一種優(yōu)選實施例中，所述馬克思克魯維酵母菌株CGMCCNo. 10621敲除全 部或部分URA3基因。
[0010] 其中，所述敲除部分基因URA3基因優(yōu)選為至少敲除該基因全部或部分0RF區(qū)，更 優(yōu)選為至少敲除該基因全部或部分CDS區(qū)。
[0011] 其中，在一種更優(yōu)選實施例中，所述馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株在Uraci1營 養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長。
[0012] 本發(fā)明所述的馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株，還可以是所述馬克思克魯維酵母 菌株CGMCCNo. 10621敲除全部或部分HIS3基因、ADE2基因中的任意一種或幾種之后的菌 株。
[0013] 其中，更優(yōu)選地，敲除全部或部分HIS3基因后，所述馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷 菌株在SC-Histidine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長。
[0014] 其中，更優(yōu)選地，敲除全部或部分ADE2基因后，所述馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷 菌株在SC-Adenine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長。
[0015] 在一種優(yōu)選實施例中，所述馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株，是馬克思克魯維酵 母菌株CGMCCNo. 10621敲除全部或部分URA3基因、以及全部或部分HIS3基因的菌株。
[0016] 在一種更優(yōu)選實施例中，所述馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株在SC-Uracil、 SC-Histidine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長。
[0017] 在一種優(yōu)選實施例中，所述馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株，是馬克思克魯維酵 母菌株CGMCCNo. 10621敲除全部或部分URA3基因、以及全部或部分ADE2基因的菌株。
[0018] 在一種更優(yōu)選實施例中，所述馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株在SC-Uracil、 SC-Adenine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長。
[0019] 在一種優(yōu)選實施例中，所述馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株，是馬克思克魯維酵 母菌株CGMCCNo. 10621敲除全部或部分URA3基因、全部或部分HIS3基因、以及全部或部 分ADE2基因的菌株。
[0020] 在一種更優(yōu)選實施例中，所述的馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株在SC-Uracil、 SC-Histidine、SC-Adenine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長。
[0021] 在一種優(yōu)選實施例中，所述馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株，是馬克思克魯維酵 母菌株CGMCCNo. 10621敲除全部或部分HIS3基因之后的菌株。
[0022] 其中，在一種優(yōu)選實施例中，所述敲除部分HIS3基因為至少敲除全部或部分該基 因的0RF區(qū)，更優(yōu)選為至少敲除全部或部分該基因的CDS區(qū)。
[0023] 其中，在一種優(yōu)選實施例中，所述的馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株在 SC-Histidine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長。
[0024] 在一種優(yōu)選實施例中，所述的馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株，是馬克思克魯維 酵母菌株CGMCCNo. 10621敲除全部或部分HIS3、以及全部或部分ADE2基因的菌株。
[0025] 在一種更優(yōu)選實施例中，所述的馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷菌株在 SC-Histidine、SC-Adenine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長。
[0026] 本發(fā)明第二個方面是提供一種無痕基因改造方法，步驟包括：敲除馬克思克魯維 酵母菌CGMCCNo. 10621至少部分營養(yǎng)缺陷型基因，使其形成營養(yǎng)缺陷型菌株。
[0027] 其中，本發(fā)明所述營養(yǎng)缺陷型基因是指能夠編碼產(chǎn)生馬克思克魯維酵母菌CGMCC No. 10621營養(yǎng)物質(zhì)的基因。
[0028] 本發(fā)明所述營養(yǎng)缺陷型基因選自全部或部分URA3基因、全部或部分HIS3基因、全 部或部分ADE2基因中的一種或幾種。
[0029] 其中，更優(yōu)選為敲除至少部分營養(yǎng)缺陷型基因的步驟包括：
[0030] 敲除馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621中的全部或至少部分第一基因；
[0031] 進一步敲除全部或部分第二基因。
[0032] 其中，更優(yōu)選為所述的步驟包括：
[0033] 敲除馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621中的全部或至少部分第一基因；
[0034] 進一步敲除全部或部分第二基因；
[0035] 然后通過重組回補第一基因。
[0036] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，敲除基因的步驟包括：
[0037] 敲除馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621中的全部或至少部分第一基因，得到第 一基因缺失的菌株A，
[0038] 擴增第二基因片段和第一基因標簽基因序列，使第二基因片段和第一基因標簽基 因序列發(fā)生內(nèi)源性重組。
[0039] 更優(yōu)選地，步驟包括：
[0040] 敲除馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621中的全部或至少部分第一基因，得到第 一基因缺失的菌株A，
[0041] 設(shè)計引物擴增得到第二基因的上游片段、第一下游片段和第二下游片段，并擴增 得到第一基因標簽序列；其中，所設(shè)計引物使得：
[0042] -一上游片段和第二下游片段的5'末端包含同源序列；
[0043] -一第一下游片段和第一基因標簽基因序列的3'末端包含同源序列；
[0044] 一一上游片段5'末端與第一線性化載體3'末端包含同源序列；
[0045] -一第二下游片段3'末端與第二線性化載體5'末端包含同源序列；
[0046] 將上游片段與第二下游片段連接的第一線性化載體上，酶切獲得包含上游片段和 第二下游片段的線性化載體A;
[0047] 將第一下游片段與第一基因標簽序列連接到第二線性化載體上，PCR擴增得到第 一下游片段與第一基因標簽基因序列的連接片段B;
[0048] 其中，其中連接片段B的5'末端和上游片段的3'末端有同源序列，連接片段B的 3'末端和第二下游片段的5'末端有同源序列；
[0049] 將連接片段B、線性化載體A進行連接，獲得第二基因缺失突變質(zhì)粒；在所述第二 基因缺失突變質(zhì)粒中，第一下游片段和第一基因標簽序列位于上游片段和第二下游片段之 間，第一基因標簽序列位于第一下游片段和第二下游片段之間；
[0050] 酶切第二基因缺失突變質(zhì)粒得到第二基因缺失突變表達框，轉(zhuǎn)化第一基因缺失的 菌株A，得到敲除部或部分第一基因、第二基因的馬克思克魯維酵母菌。
[0051] 在第一種優(yōu)選實施例中，所述方法還包括：培養(yǎng)所得敲除部或部分第一基因、第二 基因的馬克思克魯維酵母菌，使得第一基因標簽序列兩端的第一下游片段和第二下游片段 之間發(fā)生同源重組，將第一基因標簽序列從基因組中去除，回收第一基因標簽序列。
[0052] 其中，所述第一基因和第二基因可以分別獨立地是一種或多種基因，并優(yōu)選為至 少一種所述營養(yǎng)缺陷型基因。其中，第一基因優(yōu)選為至少包括URA3基因，第二基因優(yōu)選為 HIS3基因、ADE2基因中的一種或幾種?；蛘叩谝换騼?yōu)選為URA3基因和HIS3基因，第二 基因為ADE2基因。
[0053] 其中，所述第一基因標簽基因序列優(yōu)選為URA3基因標簽基因序列，更優(yōu)選為 Chromosomel: 1542629-1544057 序列。
[0054] 其中，所述第一線性化載體和第二線性化載體可以相同或不同，并優(yōu)選為相同，并 更優(yōu)選為PMD-18T載體。
[0055] 在第一種優(yōu)選實施例中，本發(fā)明敲除馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621的全 部或部分URA3基因，得到在Uracil營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長的馬克思克魯維酵母菌 F頂-1 (ura3 A )。
[0056] 在第一種優(yōu)選實施例中，敲除部或部分URA3基因的步驟包括：
[0057] 根據(jù)URA3基