本發(fā)明涉及基因工程、單細胞分選技術(shù)及抗體文庫展示技術(shù)領域，具體地說，涉及一種人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k及其應用。

背景技術(shù)：

自2013年2月以來，中國東南部陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了由甲型h7n9禽流感病毒引起人感染病例，由上海、安徽逐漸蔓延到全國其他省市。截至2017年2月，全國共報道1079例h7n9流感感染，死亡人數(shù)為417例，死亡率高達38.6％。目前并無治療該高致病型禽流感感染的特效藥，而現(xiàn)有非特異性藥物神經(jīng)氨酸酶抑制劑-奧司他韋的療效僅局限于感染早期。由于高致病性h7n9感染的前期癥狀與普通流感并無明顯區(qū)別，大部分感染者錯過最佳治療時間而發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ards)和多器官衰竭。高致病性禽流感病毒的抗原快速、靈敏診斷需求迫切。

單克隆抗體是由單一b細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的免疫球蛋白。人源單克隆抗體由于副作用小，其應用于人類疾病治療通常不需要進行人源化，避免了此過程中的的親和力丟失。人源單克隆抗體在感染性疾病的預防和控制過程中發(fā)揮了巨大作用，其能中和病毒，還能介導效應細胞對病毒感染細胞的殺傷，其保護效果在hiv、流感病毒、mers病毒，登革熱病毒，漢坦病毒、麻疹病毒、rsv病毒、狂犬病毒等動物感染模型中得到充分的證實。此外，高親和力、高特異性單克隆抗體還是病原的快速檢測試劑的關(guān)鍵組分。

2008年以來，單個b細胞分選和抗體基因直接擴增技術(shù)成為人源抗體篩選的主要途徑之一(tiller等，journalofimmunologicalmethods329，(2008)，112–124)。2010年，wu等(science329,(2010)856-861)利用流式細胞分選技術(shù)分選hiv感染者外周血中抗原特異性的單個記憶性b細胞，進而利用逆轉(zhuǎn)錄pcr技術(shù)直接擴增單個細胞的抗體基因vh和vκ/vλ，然后將上述基因片段插入全長igg重組載體進行真核細胞轉(zhuǎn)染和表達純化，成功獲得著名的hiv廣譜中和單克隆抗體vrc01。由于該技術(shù)可以在最短的時間內(nèi)獲得單細胞來源的抗體基因和重組抗體蛋白，并且可以保證抗體重鏈和輕鏈的原始配對(抗體功能最優(yōu))，單細胞分選和抗體基因直接擴增技術(shù)迅速成為抗體開發(fā)領域的重磅工具。迄今為止，該技術(shù)已在hiv，流感，mers，埃博拉，登革熱等病毒的廣譜中和單克隆抗體的篩選上成功運用，該技術(shù)獲得的多個高效抗體先后進入藥物臨床研究。單個b細胞來源的基因工程抗體為抗原快速檢測和抗體制藥領域帶來了新的希望和廣闊前景。

自h7n9流感病毒爆發(fā)以來，國內(nèi)外報道的h7n9特異性抗體屈指可數(shù)。已有抗體雖然具有較好的中和h7n9流感病毒的能力，然而其針對ha7親和力的高低及亞型特異性方面的研究有待進一步深入。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k及其應用。

本發(fā)明的構(gòu)思如下：全人源抗體的獲得目前主要通過抗體文庫展示篩選技術(shù)和單個b細胞分選技術(shù)。與單細胞分選法相比，抗體文庫篩選獲得的單克隆抗體原始輕重鏈配對的概率較低，而抗體的原始輕重鏈配對可能使抗體的功能實現(xiàn)最大化。單細胞分選法獲得的抗體基因的輕重鏈，理論上均是來自于原始配對，因此，單細胞分選法獲得高效功能性抗體的概率遠高于抗體文庫展示篩選法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k或其活性片段，所述高親和力抗體10k或其活性片段的輕鏈及重鏈高變區(qū)cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如下表所示：

前述的高親和力抗體10k，i)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及

ii)其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.5所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

前述高親和力抗體10k的輕鏈、重鏈全長氨基酸序列分別如seqidno.3和seqidno.6所示。

本發(fā)明還提供編碼所述高親和力抗體10k的基因。其中，編碼輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如seqidno.1和seqidno.4所示。

本發(fā)明還提供表達盒、表達載體或克隆載體，其包括包含編碼所述高親和力抗體10k的基因序列的核酸。

本發(fā)明還提供含有所述高親和力抗體10k的編碼基因，或所述表達盒、載體的宿主細胞。

本發(fā)明還提供所述高親和力抗體10k或其活性片段經(jīng)改造得到的單鏈抗體scfv或fab抗體或全抗體免疫球蛋白igg。

本發(fā)明中所述h7n9流感病毒高親和力抗體10k的活性片段是指能夠與7型血凝素蛋白結(jié)合的人源h7n9親和抗體10k的fab片段。

本發(fā)明所述的人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k，可按如下方法制備：利用單個記憶性b細胞分選和抗體基因直接擴增法獲得h7n9病毒血凝素蛋白特異性抗體的可變區(qū)片段，隨后通過基因工程方法構(gòu)建完整igg抗體的真核瞬間表達載體，并表達純化出igg蛋白。

該抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(cdrs)特異性基因序列決定的，并能夠在真核細胞中獲得有效表達的特異性結(jié)合h7n9流感病毒血凝素蛋白的功能性抗體。它能高效結(jié)合7型血凝素蛋白(圖3，圖4)，并具有介導效應細胞對h7n9病毒感染細胞的殺傷(adcc)功能(圖5)。

本發(fā)明h7n9流感病毒高親和力抗體10k的輕鏈和重鏈基因來源于h7n9禽流感病毒感染患者外周血b細胞。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應的三個cdr區(qū)序列組合及其cdr區(qū)之間的框架區(qū)序列構(gòu)成了該抗體可變區(qū)序列特征，抗體10k的輕鏈可變區(qū)基因?qū)儆诩易錳gkv3-20，重鏈屬于家族ighv5-51。抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的互補決定簇cdr1、cdr2和cdr3中特異性核苷酸序列及其互補序列所決定，6個相應的cdr區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定了本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合特征和抗h7n9禽流感病毒功能特征。

此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，對編碼10k可變區(qū)的基因序列進行改造，獲得編碼具有相同功能的抗體的基因。本領域技術(shù)人員可以根據(jù)表達抗體宿主的密碼子偏愛性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達效率。

進一步地，本發(fā)明所述h7n9流感病毒高親和力抗體10k的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)可經(jīng)過重組以形成較小分子量的fab抗體或更小分子量的單鏈抗體(scfv)。fab抗體和單鏈抗體同樣具有識別h7n9流感病毒表面抗原的特性。小分子量的抗體具有穿透力強，易進入局部組織或細胞內(nèi)發(fā)揮作用。

可將上述編碼fab抗體的基因、scfv抗體的基因克隆到表達載體，進而轉(zhuǎn)化宿主，通過誘導表達獲得fab抗體和單鏈抗體(scfv)。

利用sds-page、elisa、體外病毒中和實驗、抗體依賴細胞介導的細胞毒性殺傷(adcc)實驗等方法對獲得的igg抗體10k進行功能鑒定，結(jié)果表明表達純化的人源igg抗體10k分子量大小符合預期(圖2)，其可以高效特異性結(jié)合7型血凝素蛋白(圖3，圖4)，具有介導效應細胞對h7n9病毒感染細胞的殺傷(adcc)活性(圖5)。

本發(fā)明還提供所述高親和力抗體10k或其活性片段在制備預防或治療由h7n9禽流感病毒引起的疾病，特別是呼吸道疾病的藥物中的應用。

本發(fā)明還提供所述高親和力抗體10k或其活性片段在制備h7n9禽流感病毒抗原檢測試劑或檢測試劑盒中的應用。

本發(fā)明進一步提供含有所述高親和力抗體10k或其活性片段的藥物、檢測試劑或檢測試劑盒。

本發(fā)明采用多色熒光標記的流式細胞儀分選法獲得7型血凝素蛋白抗原特異性記憶性b細胞，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得單個b細胞的cdna，利用抗體特異性引物擴增抗體基因可變區(qū)片段，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建真核igg表達載體，利用細胞工程技術(shù)通過瞬間轉(zhuǎn)染和抗體純化技術(shù)獲得純化的目標igg抗體10k；利用上述獲得的人源高親和力h7n9禽流感病毒基因工程抗體可變區(qū)基因，可以以fab抗體、單鏈抗體基因及全長igg抗體的形式在原核細胞、真核細胞(包括酵母細胞)及任何重組蛋白表達系統(tǒng)中表達和生產(chǎn)該抗體，或以上述可變區(qū)基因為基礎的改造后的含有該抗體基因的任何其他基因，獲得具有高親和力特異性識別h7n9流感病毒并能介導殺傷h7n9病毒感染細胞的抗體產(chǎn)物，用以開發(fā)h7n9流感病毒抗原快速檢測試劑盒或制成臨床上用于預防和治療由h7n9禽流感病毒引起的疾病，如急性呼吸道傳染病的特異性抗體藥物。

本發(fā)明提供的抗體10k可以高效結(jié)合h7n9流感病毒血凝素蛋白ha7，其針對ha7蛋白親和力的ec50＝0.00698μg/ml(0.0465nm)(圖3)。具體地，抗體10k在與7型血凝素蛋白親和力檢測的elisa實驗中，當抗體濃度低至0.00698μg/ml(0.0465nm)時，其od450值仍可以達到最大值的一半。本發(fā)明提供的抗體可用于h7n9流感病毒抗原檢測試劑的開發(fā)。

本發(fā)明提供的抗體10k可以特異性地識別h7n9流感病毒血凝素蛋白ha7。通過elisa實驗檢測igg10k與h1n1、h5n1和h7n9流感病毒的血凝素蛋白的親和力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，igg10k特異性地識別h7n9的血凝素蛋白，ec50＝0.00698μg/ml(0.0465nm)，而對h1n1和h5n1流感病毒的血凝素蛋白不具有結(jié)合能力，說明其為ha7亞型特異性抗體(圖4)。本發(fā)明提供的抗體可用于h7n9流感病毒抗原檢測試劑的開發(fā)。

本發(fā)明提供的抗體10k可以有效地介導效應細胞(如nk細胞)對h7n9感染細胞的殺傷。具體地，10μg/ml的10k抗體介導的針對h7n9感染的mdck細胞的殺傷百分數(shù)可達43.5％(圖5)。本發(fā)明提供的抗體可以用于h7n9流感病毒感染患者的治療。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基于單細胞分選和抗體基因擴增的全人源單克隆抗體技術(shù)平臺示意圖。

圖2為本發(fā)明igg10k的變性和非變性sds-page電泳檢測抗體分子量和純度。

圖3為本發(fā)明實施例中igg10k針對ha7蛋白親和力檢測結(jié)果(elisa法)。其中，ha7蛋白以1μg/ml的濃度包被在elisa板上，igg10k從333.3nm開始4倍梯度稀釋。當od450值為最高值一半時抗體10k的濃度即為其針對ha7的ec50值。igg9114l作為陰性對照同樣進行梯度稀釋檢測其與ha7的親和力，igg9114l為廣譜中和抗體cr9114(參考文獻：dreyfusc,laursenns,kwakst,zuijdgeestd,khayatr,ekiertdc,etal.highlyconservedprotectiveepitopesoninfluenzabviruses.science2012sep14；337(6100):1343-8)。

圖4為本發(fā)明實施例中igg10k針對不同亞型及不同片段ha蛋白的親和力檢測結(jié)果(elisa法)。igg10k的孵育濃度為0.1μg/ml。h7為包被的influenzaah7n9(a/shanghai/2/2013)血凝素蛋白1μg/ml(acrobiosystems,貨號ha9-v5227)；h1為包被的influenzaah1n1(a/beijing/22808/2009)血凝素蛋白1μg/ml(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，貨號40035-v08h-100)，h5為包被的influenzaah5n1(a/commonmagpie/hongkong/2256/2006)血凝素蛋白1μg/ml(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，貨號11700-v08h-100)。

圖5為本發(fā)明實施例中igg10k針對h7n9感染細胞的adcc活性檢測結(jié)果。sp17病毒感染mdck細胞48h后，加入10μg/ml的抗體吸附細胞，去掉上清后加入健康人外周血淋巴細胞，培養(yǎng)4h后檢測上清乳酸脫氫酶活性(od492)。每個抗體各設6個試驗復孔，4個陰性對照復孔(未加抗體)和4個陽性對照復孔(加入裂解液)，取平均值用于計算細胞殺傷活性：adcc％＝100×(od492試驗孔-od492陰性對照孔)/(od492陽性對照-od492陰性對照)。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k及其制備方法

1、抗原的標記

從acrobiosystems(ha9-v5227)公司購買ha7蛋白，用pbs稀釋成0.5-2mg/ml，然后利用thermal公司的生物素(ez-link^tmsulfo-nhs-lc-biotin，21335)按照其試劑盒流程將ha7蛋白標記(分子數(shù)之比為蛋白：生物素＝1：20-100)，室溫避光孵育0.5-2h，然后用10kd的離心半透柱(merckmillipore，ufc501096)以8000g離心4-6次，用無菌pbs補充，將多余的生物素分子去除干凈，標記好的ha7蛋白分子將用于篩選ha7特異性的記憶性b細胞。

2、抗原特異性的記憶性b細胞分選及逆轉(zhuǎn)錄

分離h7n9感染患者恢復期外周血單個核細胞，用pbs洗滌一次，然后用含1％bsa的pbs(pbsa)重懸到10⁶～10⁸/ml，先加入生物素化的ha7蛋白使?jié)舛冗_到10μg/ml，混勻后4℃孵育半小時，然后用pbs洗滌一次，再用同樣體積的pbsa重懸pbmc，然后按照1：50的體積比加入購自biolegend公司的小鼠抗人cd19(apc-h7),小鼠抗人igg(apc),小鼠抗人igm(percp-cy5.5)和小鼠抗人cd27(fitc)，同時按照1：200的體積比加入invitrogen公司的7aad(percp-cy5.5)和jacksonimmunolab的streptavidin-pe(016-110-084)，混勻后4℃孵育半小時。pbs洗滌兩遍，pbsa重懸后用于細胞分選。利用bdfacsariaiii分選患者pbmc中cd19+，igm-,igg+，cd27+，7aad-，ha7/pe+陽性的細胞，每孔1個細胞，用5μlresuspensionbuffer(superscript^tmiiicellsdirectcdnasynthesissystem,invitrogen18080-300)收集細胞，-80℃保存或直接按照試劑盒的說明逆轉(zhuǎn)錄成cdna，-20℃保存。

3、抗體基因可變區(qū)的擴增

利用tiller于2008年發(fā)表在jimmunolmethods雜志上描述的引物和擴增方式擴增抗體基因重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vk/vl)。vh，vk，vl分別進行兩輪擴增，首先取3-5μlcdna作為模板，用抗體可變區(qū)基因先導序列特異性引物進行第一輪擴增，具體地，引物1-4和引物45、46擴增重鏈可變區(qū)(vh)；引物17、18、19和引物51擴增kappa鏈可變區(qū)(vk)，引物31-37和引物57擴增lambda鏈可變區(qū)(vl)。然后利用帶有酶切位點的巢式引物，以5μl第一輪擴增的產(chǎn)物為模板進行第二輪擴增，具體地，引物5-16和引物48-50擴增重鏈可變區(qū)(vh)；引物21-30和引物53-56擴增kappa鏈可變區(qū)(vk)，引物38-43和引物58擴增lambda鏈可變區(qū)(vl)。pcr體系采用tiangen的superhifipcrmix(kt212)2×pcrmix。pcr程序為：95℃3min；95℃30sec，58-60℃30sec，72℃1min，50個循環(huán)；72℃10min；4℃10min。擴增產(chǎn)物利用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳(120v，40min)，切取400bp左右的可變區(qū)片段。為了避免污染造成的假陽性，利用沒有分選細胞的孔的cdna為模板作為第一輪pcr的陰性對照，利用沒有加入第一輪pcr產(chǎn)物為模板的反應作為第二輪pcr的陰性對照。對于已經(jīng)擴增出來的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)進行配對，只有同時擴增出重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的配對才進行下一步酶切和載體構(gòu)建。

4、瞬時真核表達載體的構(gòu)建

利用tiller于2008年發(fā)表在jimmunolmethods雜志上描述的抗體基因瞬間表達載體系統(tǒng)構(gòu)建瞬間表達載體。該系統(tǒng)共含3個載體，分別用于表達igg1重鏈、kappa鏈和lambda鏈，分別命名為igh(accessionnumberdq407610)、igk(accessionnumberdq407610)和igl(accessionnumberfj517647)。按照該系統(tǒng)，只要將載體和帶有酶切位點的可變區(qū)片段進行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化，即可得到能在真核細胞轉(zhuǎn)染獲得全長igg1的抗體。重鏈載體和片段采用agei和sali雙酶切，kappa鏈載體和片段采用agei和bsiwi雙酶切，lambda鏈載體和片段采用agei和xhoi雙酶切。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取單克隆，利用5’absense引物(引物44)對載體插入序列進行測序，每個轉(zhuǎn)化挑取3-5個細菌單克隆進行測序，以三個測序結(jié)果一致，插入序列和載體一起可以翻譯成完整抗體片段，且插入序列不同于原始載體酶切前序列為載體構(gòu)建成功。

抗體基因擴增所用的引物(5′-3′)：

1l-vh1acaggtgcccactcccaggtgcag

2l-vh3aaggtgtccagtgtgargtgcag

3l-vh4/6cccagatgggtcctgtcccaggtgcag

4l-vh5caaggagtctgttccgaggtgcag

5ageivh1ctgcaaccggtgtacattcccaggtgcagctggtgcag

6ageivh1/5ctgcaaccggtgtacattccgaggtgcagctggtgcag

7ageivh3ctgcaaccggtgtacattctgaggtgcagctggtggag

8ageivh3–23ctgcaaccggtgtacattctgaggtgcagctgttggag

9ageivh4ctgcaaccggtgtacattcccaggtgcagctgcaggag

10ageivh4–34ctgcaaccggtgtacattcccaggtgcagctacagcagtg

11ageivh1–18ctgcaaccggtgtacattcccaggttcagctggtgcag

12ageivh1–24ctgcaaccggtgtacattcccaggtccagctggtacag

13ageivh3–33ctgcaaccggtgtacattctcaggtgcagctggtggag

14ageivh3–9ctgcaaccggtgtacattctgaagtgcagctggtggag

15ageivh4–39ctgcaaccggtgtacattcccagctgcagctgcaggag

16ageivh6–1ctgcaaccggtgtacattcccaggtacagctgcagcag

17lvκ1/2atgaggstcccygctcagctgctgg

18lvκ3ctcttcctcctgctactctggctcccag

19lvκ4atttctctgttgctctggatctctg

20panvκatgacccagwctccabycwccctg

21ageivκ1–5ctgcaaccggtgtacattctgacatccagatgacccagtc

22ageivκ1–9ttgtgctgcaaccggtgtacattcagacatccagttgacccagtct

23ageivκ1d–43ctgcaaccggtgtacattgtgccatccggatgacccagtc

24ageivκ2–24ctgcaaccggtgtacatggggatattgtgatgacccagac

25ageivκ2–28ctgcaaccggtgtacatggggatattgtgatgactcagtc

26ageivκ2–30ctgcaaccggtgtacatggggatgttgtgatgactcagtc

27agevκ3–11ttgtgctgcaaccggtgtacattcagaaattgtgttgacacagtc

28agevκ3–15ctgcaaccggtgtacattcagaaatagtgatgacgcagtc

29agevκ3–20ttgtgctgcaaccggtgtacattcagaaattgtgttgacgcagtct

30agevκ4–1ctgcaaccggtgtacattcggacatcgtgatgacccagtc

31lvλ1ggtcctgggcccagtctgtgctg

32lvλ2ggtcctgggcccagtctgccctg

33lvλ3gctctgtgacctcctatgagctg

34lvλ4/5ggtctctctcscagcytgtgctg

35lvλ6gttcttgggccaattttatgctg

36lvλ7ggtccaattcycaggctgtggtg

37lvλ8gagtggattctcagactgtggtg

38ageivλ1ctgctaccggttcctgggcccagtctgtgctgackcag

39ageivλ2ctgctaccggttcctgggcccagtctgccctgactcag

40ageivλ3ctgctaccggttctgtgacctcctatgagctgacwcag

41ageivλ4/5ctgctaccggttctctctcscagcytgtgctgactca

42ageivλ6ctgctaccggttcttgggccaattttatgctgactcag

43ageivλ7/8ctgctaccggttccaattcycagrctgtggtgacycag

44absensegcttcgttagaacgcggctac

45cγch1ggaaggtgtgcacgccgctggtc

46cμch1gggaattctcacaggagacga

47igg(internal)gttcggggaagtagtccttgac

48salljh1/2/4/5tgcgaagtcgacgctgaggagacggtgaccag

49salljh3tgcgaagtcgacgctgaagagacggtgaccattg

50salljh6tgcgaagtcgacgctgaggagacggtgaccgtg

51cκ543gtttctcgtagtctgctttgctca

52cκ494gtgctgtccttgctgtcctgct

53bsiwijκ1/4gccaccgtacgtttgatytccaccttggtc

54bsiwijκ2gccaccgtacgtttgatctccagcttggtc

55bsiwijκ3gccaccgtacgtttgatatccactttggtc

56bsiwijκ5gccaccgtacgtttaatctccagtcgtgtc

57cλcaccagtgtggccttgttggcttg

58xhoicλctcctcactcgagggygggaacagagtg

5、單克隆抗體的制備和純化

將2ml含有構(gòu)建成功載體的大腸桿菌接種到2yt培養(yǎng)基(trypton16g/l，yeastextract10g/l，nacl5g/l，ampicillin100μg/ml)200ml中，37℃220rpm培養(yǎng)16h。6000g離心15min收集菌體，按照thermal公司的質(zhì)粒大量提取試劑盒(hipureplasmidmaxiprepkit，k210006)操作流程提取質(zhì)粒，過濾除菌備用。利用freestyle^tm293expressionmedium(thermal,12338018)培養(yǎng)基于37℃co2搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)293f(thermal,r79007)細胞，待其按照s型增長曲線增殖長到密度為1.0×10⁶/ml時，進行轉(zhuǎn)染。每30ml的293f細胞轉(zhuǎn)染37.5ug抗體質(zhì)粒，其中重鏈和輕鏈質(zhì)粒質(zhì)量比為2：3，轉(zhuǎn)染后細胞在含8％co2的37℃搖床培養(yǎng)箱125rpm震蕩培養(yǎng)96-120h，離心收集上清。利用北京義翹神舟公司的proteingagarosebeads(13103-pnae-rn)，按照操作流程純化單克隆igg抗體。用0.2mph2.2的甘氨酸溶液洗脫抗體，立即用1/20體積的1mtris-hcl(ph9.2)中和，然后利用10kd的半透離心柱(merckmillipore，ufc501096)，以8000g離心4-6次，用無菌pbs補充，將多余的甘氨酸分子去除干凈。nanodrop分光光度計檢測od280值以測定抗體濃度，0.22μm濾器過濾除菌，分裝后保存在-20℃或-80℃。

為本發(fā)明基于單細胞分選和抗體基因擴增的全人源單克隆抗體技術(shù)平臺示意圖見圖1。

實施例2單克隆抗體10k針對ha7蛋白的ec50測定

用elisa包被液稀釋ha7蛋白至1μg/ml，然后每孔50μl包被elisa板(corning，3690)，4℃過夜。pbst洗板，含5％脫脂牛奶的pbs封閉2h以上。將單克隆抗體從50μg/ml的起始濃度開始，用含5％脫脂牛奶的pbs進行4倍梯度稀釋后，加入封閉好的elisa板。共設置10個梯度，兩個重復，不加抗體的孔為陰性對照，加入梯度稀釋的igg9114l(即cr9114，dreyfusc,laursenns,kwakst,zuijdgeestd,khayatr,ekiertdc,etal.highlyconservedprotectiveepitopesoninfluenzabviruses.science2012sep14；337(6100):1343-8)為抗體對照。羊抗人iggfc-hrp(1:10000,jacksonimmunolab,109-036-098)為二抗，100μltmb顯色，100μl0.2m的硫酸終止，酶標儀讀取od450值。取每個梯度的復孔的平均值，繪制od450-濃度曲線，按照graphpadprism的sigmoidaldoseresponse模型進行曲線擬合，并計算od450值為最高值一半(即1.6)時對應的抗體濃度，此即為抗體針對ha7的ec50值。

實施例3單克隆抗體10k針對h7n9(a/shenzhen/sp17/2014(h7n9))的中和活性測定

在96孔細胞培養(yǎng)板接種mdck細胞，培養(yǎng)至細胞密度約為70％-90％，pbs洗兩遍后備用；將待檢測的單克隆抗體在96孔微量滴定板上進行3倍的倍比稀釋(100μg/ml起始)，每個待檢測抗體做4個孔的重復，8個梯度；根據(jù)病毒的tcid50滴度稀釋病毒，使稀釋后的病毒滴度為200tcid50/100μl；取60μl稀釋后的病毒液與60μl稀釋好的單克隆抗體樣本混合，37℃培養(yǎng)箱中孵育2h使抗原抗體充分作用；然后取病毒血漿混合物100μl置洗好的96孔mdck細胞，37℃培養(yǎng)箱中感染1h，用加有tpck胰酶的mem培養(yǎng)基150μl置換病毒液，置37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，觀察cpe，紅細胞凝集試驗確認cpe結(jié)果。根據(jù)reed-muench法計算距離比，以能夠抑制半數(shù)孔mdck細胞感染的濃度作為衡量單抗中和活性的ic50值。

實施例4單克隆抗體10k的抗體依賴細胞介導的細胞毒性殺傷(adcc)活性檢測

在96孔細胞培養(yǎng)板接種mdck細胞，培養(yǎng)至細胞密度約為70％-90％，pbs洗兩遍；用1000tcid50每孔的病毒量感染每孔mdck細胞，于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中感染1h，隨后去掉上清，加170μl病毒生長液(mem培養(yǎng)基[thermal，11095-080)含1％青霉素-鏈霉素雙抗(thermal,15140163)和0.1-0.5μg/mltpck胰酶(sigma，t1426)]，置于37℃co2，濃度為5％的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；pbs洗滌病毒感染的細胞兩遍，每孔加入含10μg/ml待測抗體的mem培養(yǎng)基(thermal，11095-080)，置于37℃，co2濃度為5％的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，去掉上清，pbs洗滌一次，去掉上清，每孔加入200μl含5×10⁵來自健康人pbmc的mem培養(yǎng)基，置于37℃，co2濃度為5％的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。利用promega公司的非放射性細胞毒性試驗檢測試劑盒(g1780)，按照操作流程檢測培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(ldh)活性。酶標儀讀取od492值。未加抗體或加入非流感相關(guān)抗體的孔為陰性對照，加入試劑盒裂解液(未加pbmc)的孔為陽性對照。adcc％＝100×(od492試驗孔-od492陰性對照孔)/(od492陽性對照-od492陰性對照)。

本發(fā)明提供的抗體10k可以高效結(jié)合h7n9流感病毒血凝素蛋白ha7，其針對ha7蛋白親和力的ec50＝0.00698μg/ml(0.0465nm)(圖3)。具體地，抗體10k在與7型血凝素蛋白親和力檢測的elisa實驗中，當抗體濃度低至0.00698μg/ml(0.0465nm)時，其od450值仍可以達到最大值的一半。本發(fā)明提供的抗體可用于h7n9流感病毒抗原檢測試劑的開發(fā)。

本發(fā)明提供的抗體10k可以特異性地識別h7n9流感病毒血凝素蛋白ha7。通過elisa實驗檢測igg10k與h1n1、h5n1和h7n9流感病毒的血凝素蛋白的親和力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，igg10k特異性地識別h7n9的血凝素蛋白，ec50＝0.00698μg/ml(0.0465nm)，而對h1n1和h5n1流感病毒的血凝素蛋白不具有結(jié)合能力，說明其為ha7亞型特異性抗體(圖4)。本發(fā)明提供的抗體可用于h7n9流感病毒抗原檢測試劑的開發(fā)。

本發(fā)明提供的抗體10k可以有效地介導效應細胞(如nk細胞)對h7n9感染細胞的殺傷。具體地，10μg/ml的10k抗體介導的針對h7n9感染的mdck細胞的殺傷百分數(shù)可達43.5％(圖5)。本發(fā)明提供的抗體可以用于h7n9流感病毒感染患者的治療。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110>深圳普蘭達科技有限公司

<120>人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k及其應用

<130>khp171113095.8

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>328

<212>dna

<213>抗體10k輕鏈可變區(qū)dna序列

<400>1

gaaattgtgttgacacagtctccaggcaccctgtcattgtctccaggggacagagccacc60

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cctgaagattttgcagtctattactgtcaccagtatggttcctcacctccgttcactttt300

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<210>2

<211>110

<212>prt

<213>抗體10k輕鏈可變區(qū)

<400>2

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151015

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100105110

<210>3

<211>216

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<213>抗體10k輕鏈全長

<400>3

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<212>dna

<213>抗體10k重鏈可變區(qū)dna序列

<400>4

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tcctgtaagggttctggatacagctttaccaactactggatcggctgggtgcgccagatg120

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ctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagggggtgg300

cataacgcatactactactttggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtc360

tcttca366

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<212>prt

<213>抗體10k重鏈可變區(qū)

<400>5

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<211>452

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<213>抗體10k重鏈全長

<400>6

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202530

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859095

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