本發(fā)明涉及基因熒光定量檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種乙型肝炎病毒核酸提取試劑、提取方法、定量檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)可以引起肝臟炎性病變和多器官損害，是嚴重危害人類健康的流行性病毒之一。人感染hbv后，病毒持續(xù)未被清除者可能發(fā)展為慢性肝炎，如果不進行適當?shù)母深A(yù)，約15％-40％的慢性hbv感染者最終將發(fā)生肝硬化，終末期肝病及肝癌，hbv感染者應(yīng)積極進行抗病毒治療，并監(jiān)測其病毒載量變化。因此，乙型肝炎病毒核酸高靈敏度的定量檢測對臨床診斷治療合理用藥和判斷預(yù)后具有重要意義。乙型肝炎病毒的基因組dna是環(huán)狀部分雙螺旋的結(jié)構(gòu)，長約3.2kb。兩條dna鏈不等長，其中2/3為雙螺旋結(jié)構(gòu)，1/3為單鏈。長鏈的5’端與3’端無共價連接，而是與一種蛋白質(zhì)共價相連。長鏈的5’端以250-300對堿基互補結(jié)合。長鏈為負鏈，短鏈為正鏈。短鏈的長度視病毒而異，一般長約1.6-2.8kb，約為長鏈的2/3。短鏈之間的空隙可由病毒顆粒中的dna聚合酶充填。乙肝病毒是目前已知的感染人類最小的雙鏈dna病毒。因而hbv的基因組結(jié)構(gòu)顯得特別精密濃縮，充分利用其遺傳物質(zhì)。hbv可分為a、b、c、d、e、f、g、h8個基因型，且不同基因型致病性不同，我國屬hbv感染高流行區(qū)，一般人群的hbsag陽性率為9.09％。目前對于乙型肝炎病毒快速檢測的方法主要由免疫學方法、基因芯片方法和核酸分子生物學方法。免疫學檢測方法主要是檢測乙型肝炎病毒感染過程中產(chǎn)生的抗原抗體免疫標志物，最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)，是將特異性抗原或抗體吸附于固相載體上，使其與待測樣品中的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，然后加酶標記的抗原或抗體,再加底物顯色，最后根據(jù)色澤深淺推算待測抗原或抗體的含量?；蛐酒夹g(shù)是將大量特定的寡核昔酸或基因片段作為探針，有規(guī)律地和高密度地排列，固定在一塊很小的支持物如硅片、玻片等，然后與待檢的熒光標記樣品核酸按堿基配對原則雜交，經(jīng)洗滌后通過激光共聚焦熒光系統(tǒng)檢測雜交信號強度，再經(jīng)計算機分析處理數(shù)據(jù)從而獲取樣品的生物信息。將特異探針固定在載玻片上，在pcr擴增乙型肝炎病毒分型區(qū)域時應(yīng)用熒光標記的dnrp即使產(chǎn)物帶有熒光，通過將pcr產(chǎn)物與乙型肝炎病毒芯片雜交后某型處的雜交點出現(xiàn)熒光而確定?？捎糜谝倚透窝撞《镜幕蜃儺悺⒒蚍中偷臋z測。核酸生物學方法是帶有標記物的dna或rna片段即核酸探針能與互補的核酸序列特異結(jié)合。核酸探針的標記可用核素以及非放射性物質(zhì)如生物素、地高辛等。乙型肝炎病毒的核酸探針有dna探針和rna探針兩種。核酸探針法的主要特點是敏感性、特異性都較強。然而elisa特異性強，但elisa檢測hbsag為陰性的樣品也可能乙型肝炎病毒dna為陽性。基因芯片技術(shù)具有自動化程度高、靈敏度高、檢測目的分子量少、效率高等優(yōu)點，但也存在成本高、假陽性率偏高、重復性差等缺陷。因此，目前此類試劑盒普遍存在成本高、假陽性率偏高、重復性差，特異性靈敏度低，不利于自動化等缺點。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，基因檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于臨床，這得益于其高度的靈敏性。dna檢測是重要的用藥指征，尤其是抗病毒治療，其可信值要高于包括免疫法在內(nèi)的其它方法。因此，研發(fā)更加可靠穩(wěn)定的基因診斷試劑盒對臨床的指導意義顯得更加突出。dna的檢測主要涉及到兩個方面，核酸的提取和核酸的擴增檢測。血清中病毒核酸的提取，目前主要有三種方法，煮沸法，柱提取法和磁分離方法，而磁分離法具有減少病毒損失，定量準確，操作簡便，效率高，容易實現(xiàn)自動化等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于核酸的分離與純化。不過，提取所用試劑價格昂貴，從而限制了它的廣泛應(yīng)用。臨床上hbv-dna定量檢測的方法目前主要是基于實時熒光定量pcr技術(shù)，其利用熒光定量pcr擴增儀，通過熒光檢測裝置能夠檢測熒光信號的動態(tài)變化，實時反映pcr的每個循環(huán)的擴增水平，同時通過其自身攜帶的軟件自動分析獲得擴增曲線，根據(jù)擴增曲線與閾值的交點(即ct值)以及擴增曲線的形狀，可以判斷檢測結(jié)果。目前國內(nèi)外已有多種hbv-dna定量檢測試劑盒，此類試劑盒均基于實時熒光定量pcr技術(shù)，其在臨床檢測中的廣泛應(yīng)用突出暴露了很多問題，國外試劑盒購買成本高昂，嚴重限制了它的廣泛的應(yīng)用；而國內(nèi)的多種此類試劑盒均表現(xiàn)出靈敏度不高，特異性不強，提取過程核酸損失嚴重等一些問題。另外，pcr擴增產(chǎn)物中高濃度的目標分子會以氣溶膠的形式污染整個實驗空間，都需要嚴格對pcr擴增產(chǎn)物進行后處理，由于pcr的高度靈敏性，甚至可以檢測出反應(yīng)體系中10個拷貝的模板濃度，從而可能給今后的實驗帶來嚴重的假陽性。因此，迫切需要提高hbv-dna定量檢測試劑盒的靈敏度和特異性。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的之一是提供一種高特異性、高靈敏度提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠。本發(fā)明的目的之二是提供一種高特性性、高靈敏度提取乙型肝炎病毒核酸用提取試劑。本發(fā)明的目的之三是提供一種高特異性、高靈敏度提取乙型肝炎病毒核酸的提取方法。本發(fā)明的目的之四是提供一種高特異性、高靈敏度定量檢測乙型肝炎病毒的試劑盒。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠，由磁珠一、磁珠二和磁珠三按照6：6：1比例混合組成；所述磁珠一為連接有靶核苷酸序列一的磁珠，磁珠二為連接有靶核苷酸序列二的磁珠，磁珠三為連接有靶核苷酸序列三的磁珠；所述靶核苷酸序列一為5’-biotin-agaccaccaaatgcccctatcctatcaacactt-3’；靶核苷酸序列二為5’-biotin-gagaccttcgtctgcgaggcgagggagtt-3’；靶核苷酸序列三為5’-biotin-c12-atcgagggtaatcattaacggtgt-3’。一種提取乙型肝炎病毒核酸用提取試劑，由溶液1、溶液2、溶液3和溶液4組成；其中溶液1由0.1mol/l的edta-na2溶液、2mol/l的naoh溶液、6mol/l的鹽酸胍溶液、質(zhì)量濃度為20％的吐溫溶液按照8：8：40：21的體積比混合組成；溶液2由4mol/l的hcl溶液與濃度為2.5ug/ul的磁珠溶液按照32：1.3的體積比混合組成；所述磁珠為上述磁珠；溶液3由0.1mol/l的edta-na2溶液、4mol/l的nacl溶液、1mol/l的tris-hcl緩沖液與水按照0.25：0.625：0.25：49的體積比混合組成；溶液4由溶液3與質(zhì)量濃度為20％的吐溫按照20：1的體積比混合組成。一種提取乙型肝炎病毒核酸的提取方法，包括以下操作步驟：1)將待測樣本加入離心管中，然后取上述提取試劑中的溶液1加入離心管中，振蕩混勻，瞬時離心；2)取上述提取試劑中的溶液2加入離心管中，振蕩混勻后，50℃溫度下加熱10分鐘后，瞬時離心，室溫冷卻2分鐘；3)將步驟2)處理后的離心管放置在磁力架上收集磁珠10分鐘，棄上清，加入上述提取試劑中的溶液4，振蕩混勻，瞬時離心；5)將步驟3)處理后的離心管放置在磁力架上收集磁珠10分鐘，棄上清，加入上述提取試劑中的溶液3，靜置1分鐘后，棄上清，即完成。一種乙型肝炎病毒定量檢測用試劑盒，包括上述提取試劑、pcr反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和標準品?？蛇x的，所述pcr反應(yīng)液由以下溶液混合組成：10×pcr反應(yīng)用緩沖液、2mmol/ldntps、質(zhì)量濃度為50％的二甲基亞砜溶液、4mol/l甜菜堿溶液、30pmol/ul靶核苷酸引物混合液、30pmol/ul靶核苷酸探針溶液、30pmol/ul內(nèi)標引物混合液、30pmol/ul內(nèi)標探針溶液、1u/μl耐熱dna聚合酶、1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶、水。可選的，所述pcr反應(yīng)液由10×pcr反應(yīng)用緩沖液、2mmol/ldntps、質(zhì)量濃度為50％的二甲基亞砜溶液、4mol/l甜菜堿溶液、30pmol/ul靶核苷酸引物混合液、30pmol/ul靶核苷酸探針溶液、30pmol/ul內(nèi)標引物混合液、30pmol/ul內(nèi)標探針溶液、1u/μl耐熱dna聚合酶、1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶和水按照5：5：2：1：2.5：1：1：1：1.2：1：29.3體積比混合組成。可選的，所述dntps由dntp和dutp組成。可選的，所述30pmol/ul靶核苷酸引物混合液中含有靶核苷酸正向引物和靶核苷酸反向引物；30pmol/ul內(nèi)標引物混合液中含有內(nèi)標正向引物和內(nèi)標反向引物；其中靶核苷酸正向引物序列為：5’-agaccaccaaatgcccctatcctatcaacactt-3’；靶核苷酸反向引物序列為：5’-gagaccttcgtctgcgaggcgagggagtt-3’；內(nèi)標正向引物序列為：5’-atcgagggtaatcattaacggtgt-3’；內(nèi)標反向引物序列為：5’-cgttctcaaacgccagcgaaa-3’；靶核苷酸探針序列為：5’-aggcaggtcccctagaaga-3’，靶核苷酸探針5’端標記fam熒光報告基團，3’端標記mgb熒光淬滅基團；內(nèi)標探針序列為：5’-acggtgtgccagcatgtgtggga-3’，內(nèi)標探針5`端標記hex熒光報告基團，3`端標記bhq1熒光淬滅基團。可選的，所述陰性質(zhì)控品為不含乙型肝炎病毒基因的puc57-t載體質(zhì)粒tmv-dna片段。可選的，所述陽性質(zhì)控品為1.0x103copy/ml含乙型肝炎病毒基因組靶核苷酸序列的puc57-t載體質(zhì)粒片段?？蛇x的，所述標準品為含有乙型肝炎病毒c基因末端保守序列處109個堿基對核苷酸片段的puc57-t重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌dh5a中增殖，具體包括：工作標準品1：含有1.0x107copy/ml的靶核苷酸序列重組質(zhì)粒；工作標準品2：含有1.0x106copy/ml的靶核苷酸序列重組質(zhì)粒；工作標準品3：含有1.0x105copy/ml的靶核苷酸序列重組質(zhì)粒；工作標準品4：含有1.0x104copy/ml的靶核苷酸序列重組質(zhì)粒。使用上述試劑盒檢測血液樣本中乙型肝炎病毒濃度的操作方法為：(1)取待測血液樣本加入離心管中，加入內(nèi)標物；(2)取上述提取試劑中的溶液1加入到血液樣本中，振蕩混勻，瞬時離心(3)取上述提取試劑中的溶液2加入離心管中，振蕩混勻后，50℃溫度下加熱10分鐘后，瞬時離心，室溫冷卻2分鐘；(4)將步驟(3)處理后的離心管放置在磁力架上收集磁珠10分鐘，棄上清，加入上述提取試劑中的溶液4，振蕩混勻，瞬時離心；(5)將步驟(4)處理后的離心管放置在磁力架上收集磁珠10分鐘，棄上清，加入上述提取試劑中的溶液3，靜置1分鐘后，棄上清；(6)用pcr反應(yīng)也洗脫步驟(5)處理后的離心管壁上的磁珠并將其吸入pcr管中，同時取陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，工作標準品加入pcr管中，蓋好管蓋；(7)使用熒光定量pcr儀等進行熒光定量pcr：將步驟(6)處理后的pcr管放入熒光定量儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，按下列表1所示條件進行擴增：表1(8)結(jié)果分析：熒光定量pcr反應(yīng)結(jié)束后，對hbv的曲線和相應(yīng)hbv內(nèi)標的曲線進行分別分析，可以利用儀器自帶的軟件進行分析，也可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，記錄樣本ct值和根據(jù)標準品繪制的標準曲線自動求得各樣本的定值結(jié)果；如果樣本擴增曲線呈s型，有ct值且定值結(jié)果≥10iu/ml，可以判為陽性；如果樣本擴增曲線平直，無ct值顯示或無定值結(jié)果顯示，可以判為陰性。上述步驟(1)中所述內(nèi)標物為tmv的dna片段，其濃度為1.0x104copy/ml。本發(fā)明提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠，在磁珠表面連接靶核苷酸序列，提高磁珠對乙型肝炎病毒核酸提取的特異性和靈敏性。本發(fā)明提取乙型肝炎病毒核酸的提取方法，利用本發(fā)明的磁珠，并且在提取過程中通過升溫和降溫結(jié)合的方式，進一步提升對乙型肝炎病毒核酸提取的特異性和靈敏性。本發(fā)明乙型肝炎病毒定量檢測用試劑盒，采用了由本發(fā)明磁珠組成的提取試劑，提高對乙型肝炎病毒檢測的特異性和靈敏度，明顯優(yōu)于國內(nèi)其他試劑盒；同時，本發(fā)明試劑盒采用乙肝病毒保守序列的引物和探針，具有很好的特異性，應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒，能夠檢測出hbv的八個基因型。進一步地，本發(fā)明試劑盒加入內(nèi)標，可以有效監(jiān)控假陰性的存在。加入適量的ung酶可以預(yù)防pcr產(chǎn)物的污染。進一步地，本發(fā)明試劑盒中連接有靶核苷酸序列的磁珠與提取方法和合理的pcr反應(yīng)液的配制組成，相互之間高度配合，提高了檢測試劑的靈敏度、特異性，更加有利于自動化，效率高，目前在國內(nèi)此類試劑中保持領(lǐng)先。附圖說明圖1是hbv八個基因型標準品的熒光定量pcr擴增曲線圖；圖2是四例hbv陽性血清以及甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、eb病毒和巨細胞病毒已知樣本的熒光定量pcr擴增曲線圖；圖3是4個標準品的熒光定量pcr擴增曲線圖；圖4是4個標準品的濃度與ct值之間對應(yīng)關(guān)系的標準曲線；圖5是20個標準樣品(包括1個陰性內(nèi)參考品)的熒光定量pcr擴增曲線圖。具體實施方式下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。實施例1本實施例提供一種提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠，由磁珠一、磁珠二和磁珠三按照6：6：1比例混合組成；所述磁珠一為連接有靶核苷酸序列一的磁珠，磁珠二為連接有靶核苷酸序列二的磁珠，磁珠三為連接有靶核苷酸序列三的磁珠；靶核苷酸序列一為5’-biotin-agaccaccaaatgcccctatcctatcaacactt-3’；靶核苷酸序列二為5’-biotin-gagaccttcgtctgcgaggcgagggagtt-3’；靶核苷酸序列三為5’-biotin-c12-atcgagggtaatcattaacggtgt-3’。實施例2本實施例提供一種提取乙型肝炎病毒核酸用提取試劑，由溶液1、溶液2、溶液3和溶液4組成；其中溶液1由0.1mol/l的edta-na2溶液、2mol/l的naoh溶液、6mol/l的鹽酸胍溶液、質(zhì)量濃度為20％的吐溫溶液按照8：8：40：21的體積比混合組成；溶液2由4mol/l的hcl溶液與濃度為2.5ug/ul的磁珠溶液按照32：1.3的體積比混合組成；所述磁珠為實施例1提供的磁珠；溶液3由0.1mol/l的edta-na2溶液、4mol/l的nacl溶液、1mol/l的tris-hcl緩沖液與水按照0.25:0.625:0.25:49的體積比混合組成；溶液4由溶液3與質(zhì)量濃度為20％的吐溫按照20：1的體積比混合組成。本實施提供的提取試劑中各組分的組成，具體參見表2，表2利用本實施例提供的提取試劑提取乙型肝炎病毒核酸的提取方法，包括以下操作步驟：1)將待測樣本加入離心管中，然后取上述提取試劑中的溶液1加入離心管中，振蕩混勻，瞬時離心；2)取上述提取試劑中的溶液2加入離心管中，振蕩混勻后，50℃溫度下加熱10分鐘后，瞬時離心，室溫冷卻2分鐘；3)將步驟2)處理后的離心管放置在磁力架上收集磁珠10分鐘，棄上清，加入上述提取試劑中的溶液4，振蕩混勻，瞬時離心；5)將步驟3)處理后的離心管放置在磁力架上收集磁珠10分鐘，棄上清，加入上述提取試劑中的溶液3，靜置1分鐘后，棄上清，即完成。實施例3本實施例提供一種乙型肝炎病毒定量檢測用試劑盒，包括實施例2提供的提取試劑、pcr反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和標準品；pcr反應(yīng)液由以下溶液由10×pcr反應(yīng)用緩沖液、2mmol/ldntps、質(zhì)量濃度為50％的二甲基亞砜溶液、4mol/l甜菜堿溶液、30pmol/ul靶核苷酸引物混合液、30pmol/ul靶核苷酸探針溶液、30pmol/ul內(nèi)標引物混合液、30pmol/ul內(nèi)標探針溶液、1u/μl耐熱dna聚合酶、1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶和水按照5：5：2：1：2.5：1：1：1：1.2：1：29.3體積比混合組成；其中30pmol/ul靶核苷酸引物混合液中含有靶核苷酸正向引物和靶核苷酸反向引物；30pmol/ul內(nèi)標引物混合液中含有內(nèi)標正向引物和內(nèi)標反向引物；其中靶核苷酸正向引物序列為：5’-agaccaccaaatgcccctatcctatcaacactt-3’；靶核苷酸反向引物序列為：5’-gagaccttcgtctgcgaggcgagggagtt-3’；內(nèi)標正向引物序列為：5’-atcgagggtaatcattaacggtgt-3’；內(nèi)標反向引物序列為：5’-cgttctcaaacgccagcgaaa-3’；靶核苷酸探針序列為：5’-aggcaggtcccctagaaga-3’，靶核苷酸探針5’端標記fam熒光報告基團，3’端標記mgb熒光淬滅基團；內(nèi)標探針序列為：5’-acggtgtgccagcatgtgtggga-3’，內(nèi)標探針5`端標記hex熒光報告基團，3`端標記bhq1熒光淬滅基團。陰性質(zhì)控品為不含乙型肝炎病毒基因組靶核苷酸序列的puc57-t載體；陽性質(zhì)控品為1.0x103copy/ml含乙型肝炎病毒基因組靶核苷酸序列的puc57-t載體；標準品為含有乙型肝炎病毒c基因末端保守序列處109個堿基對核苷酸片段的puc57-t重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌dh5a中增殖，具體包括：工作標準品1：含有1.0x107copy/ml的靶核苷酸序列重組質(zhì)粒；工作標準品2：含有1.0x106copy/ml的靶核苷酸序列重組質(zhì)粒；工作標準品3：含有1.0x105copy/ml的靶核苷酸序列重組質(zhì)粒；工作標準品4：含有1.0x104copy/ml的靶核苷酸序列重組質(zhì)粒。其中pcr反應(yīng)液的具體組成(50μl體系)，詳見表3，表3實施例4采用實施例3提供的試劑盒對臨床血液樣本和血漿樣本進行檢測，血清樣本的采集方法為：一次性針筒抽取病人靜脈血1ml，至于無菌的不含抗凝劑的試管中，于室溫靜置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清。血清應(yīng)立即進行下一步操作或置于-20℃或-80℃保存待檢。血漿樣本的采集方法為：一次性針筒抽取病人靜脈血1ml，置于無菌的一次性抗凝試管中，標本采集后30分鐘內(nèi)于1000g離心15分鐘，取上清。上清應(yīng)立即進行下一步操作或置于-20℃或-80℃保存待檢。樣本存放和運輸要求：可在2℃-8℃放置72小時，或置于-20℃保存8個月；樣本不易反復凍融，運輸應(yīng)采用泡沫盒加冰袋運輸。檢測方法的具體操作步驟為：(1)取2ml離心管并做好標記，分別取320ul臨床人血清或血漿樣本加入離心管中，在每份樣本中加入1.5ul內(nèi)標物，內(nèi)標物為tmv的dna片段，其濃度為1.0x104copy/ml；(2)取770ul提取試劑的溶液1加入到離心管中，震蕩混勻，瞬時離心，打開離心管蓋；(3)取160ul提取試劑的溶液2加入到離心管中，震蕩混勻，50℃加熱10min，瞬時離心，打開離心管蓋，室溫冷卻2min；(4)放置于磁力架上收集磁珠10min，棄上清，加入1ml提取試劑的溶液4，震蕩混勻，瞬時離心，打開離心管蓋；(5)放置于磁力架上收集磁珠10min，棄上清，加入1ml提取試劑的溶液3，靜置1min，棄上清；(6)用50ulpcr反應(yīng)液洗脫離心管壁上的磁珠并將其吸入pcr管中，同時陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，工作標準品各取1ul分別加入pcr管中，蓋好管蓋；(7)熒光定量pcr：將步驟(6)處理好的pcr管放入熒光定量pcr儀q7(abi)/7500/steponeplus的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，按下列表1的條件進行擴增：表1(8)結(jié)果分析：熒光定量pcr反應(yīng)結(jié)束后，對hbv的曲線和相應(yīng)hbv內(nèi)標的曲線進行分別分析，利用儀器自帶的軟件進行分析，得出擴增曲線，記錄樣本ct值和根據(jù)標準品ct值與濃度關(guān)系繪制的標準曲線自動求得各樣本的定值結(jié)果；如果樣本擴增曲線呈s型，有ct值且定值結(jié)果≥10iu/ml，可以判為陽性；如果樣本擴增曲線平直，無ct值顯示或無定值結(jié)果顯示，可以判為陰性；檢測結(jié)果需要同時滿足hbv陰性對照，無ct值顯示；hbv內(nèi)標檢測為陽性，且ct≤40。hbv陽性對照，檢測濃度值介于1.58x102-1.58x103iu/ml。四個hbv定量參考品：均檢測為陽性，且標準曲線相關(guān)系數(shù)r2≥0.98以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則本次試驗無效，需重新進行。按照上述檢測方法通過參考值的研究實驗確定本發(fā)明實施例3提供的試劑盒的檢測下限位為10iu/ml，內(nèi)對照ct參考值為40。注意事項：1、pcr擴增產(chǎn)物中高濃度的目標分子會以氣溶膠的形式污染整個實驗空間，都需要嚴格對pcr擴增產(chǎn)物進行后處理，由于pcr的高度靈敏性，甚至可以檢測出反應(yīng)體系中10個拷貝的模板濃度，從而可能給今后的實驗帶來嚴重的假陽性；2、提取過程中瞬時離心為把離心管中的氣溶膠離心到溶液中，操作過程中不必考慮離心力，瞬時離心即可；3、提取過程中震蕩混勻時務(wù)必把離心管蓋緊，防止溶液灑出，造成其他樣品的污染。對比例1本對比例提供一種試劑盒，與實施例3不同的是，該試劑盒中的提取試劑中的磁珠未連接靶核苷酸序列。對比例2本對比例提供一種檢測方法，與實施例4不同的是，步驟(3)中取160ul提取試劑的溶液2加入到離心管中，震蕩混勻，瞬時離心，打開離心管蓋，其他同實施例4。試驗例1特異性實驗試驗方法：按照采用實施例3提供的試劑盒實施例4所述的檢測方法對hbv八個基因型標準品、四例hbv陽性血清以及甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、eb病毒和巨細胞病毒已知樣本進行檢測，考查本發(fā)明試劑盒的特異性，獲得的擴增曲線如圖1和圖2所示，由圖1和圖2所示的擴增曲線可知本發(fā)明試劑盒能夠特異性的檢測hbv的八個基因型。試驗例2靈敏度實驗試驗方法：采用實施例3提供的試劑盒按照實施例4所述的檢測方法對20個標準樣品(包括1個陰性內(nèi)參考品)和4個標準品進行檢測，利用儀器自帶的軟件進行分析，得出不同檢測樣品的擴增曲線，結(jié)果如圖3、圖4、圖5所示，該結(jié)果顯示了本靈敏度試驗的有效性。采用實施例4所述的檢測方法分別對2.5iu/ml和10iu/ml的標準品進行檢測，每個濃度的標準品檢測100份，結(jié)果統(tǒng)計如下表4所示：表4iu/mldetectednotdetecteddetected(％)00002.591991101000100由上述表4所示的結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒對hbv的檢測出靈敏度高，最低檢測線達到10iu/ml陽性樣品。試驗例3對比臨床檢測實驗試驗方法：分為a、b、c、d四組對40份臨床樣品(含陰性樣品)進行檢測，以檢出結(jié)果進行統(tǒng)計比較其靈敏性，其中a組是采用本發(fā)明實施例3提供的試劑盒按照實施例4所述的檢測方法進行檢測；b組是采用湖南圣湘生物科技有限公司開發(fā)的hbv熒光定量pcr檢測試劑盒按照實施例4所述的檢測方法進行檢測；c組為采用對比例1所述的試劑盒按照實施例4所述的檢測方法進行檢測；d組為采用實施例3提供的試劑盒按照對比例2所述的檢測方法進行檢測，結(jié)果如下表5所示：表5統(tǒng)計結(jié)果如下表6所示：表6組別總樣本/個陽性/個陰性/個檢出率％a4031977.5b40261465c40192147.5d40211952.5由上述表6所示的結(jié)果可知通過本發(fā)明提供的試劑盒和湖南圣湘生物科技有限公司開發(fā)的劑盒分別對40份臨床樣品進行檢測的檢出率進行比對，可以有效的驗證本試劑盒具有較高的靈敏度；通過本發(fā)明提供的試劑盒和對比例1提供的試劑盒分別對40份臨床樣本進行檢測的檢出率進行比對，證明本發(fā)明試劑盒通過在磁珠上連接靶核苷酸序列的方式，提高了對hbv檢測的特異性和靈敏性；通過與對比例2提供的檢測方法進行檢出率的比對，本發(fā)明在提取乙型肝炎病毒核酸的過程中，采用先升溫后降溫的處理方式，提高了檢測的特異性和靈敏度。說明書核苷酸和氨基酸序列表<110>鄭州市第六人民醫(yī)院<120>一種提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠、提取試劑、提取方法、定量檢測用試劑盒<160>9<210>1<211>33<212>dna<213>人工序列<223>根據(jù)特性核苷酸序列設(shè)計，用以目標連接目標核苷酸序列。<400>1agaccaccaaatgcccctatcctatcaacactt33<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<223>根據(jù)特性核苷酸序列設(shè)計，用以目標連接目標核苷酸序列。<400>2gagaccttcgtctgcgaggcgaggagtt29<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<223>根據(jù)特性核苷酸序列設(shè)計，用以目標連接目標核苷酸序列。<400>3atcgagggtaatcattaacggtgt24<210>4<211>33<212>dna<213>人工序列<223>根據(jù)特性核苷酸序列設(shè)計，用以pcr擴增的引物。<400>4agaccaccaaatgcccctatcctatcaacactt33<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列<223>根據(jù)特性核苷酸序列設(shè)計，用以pcr擴增的引物。<400>5gagaccttcgtctgcgaggcgaggagtt29<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<223>根據(jù)特性核苷酸序列設(shè)計，用以pcr擴增的探針。<400>6aggcaggtcccctagaaga19<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<223>根據(jù)特性核苷酸序列設(shè)計，用以pcr擴增的引物。<400>7atcgagggtaatcattaacggtgt24<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<223>根據(jù)特性核苷酸序列設(shè)計，用以pcr擴增的引物。<400>8cgttctcaaacgccagcgaaa21<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列<223>根據(jù)特性核苷酸序列設(shè)計，用以pcr擴增的探針。<400>9acggtgtgccagcatgtgtggga23當前第1頁12