技術領域：
：本發(fā)明屬于生物催化
技術領域：
，具體涉及微生物催化反應中海藻酸鈉接枝衍生環(huán)糊精固定化細胞及其應用。
背景技術：
：：甾體化合物作為僅次于抗生素的第二大類藥物，其在生命體內具有調控各種物質代謝及生理作用的功能。甾體藥物的工業(yè)化生產主要是改造天然甾體化合物的結構，與傳統(tǒng)化學方法合成相比，微生物轉化的方法可以形成多種甾體藥物活性中間體且產物純度高。環(huán)糊精作為增溶劑能增加疏水性甾體的溶解度，其特殊空腔結構可以包結甾體底物，從而提高甾體化合物的生物利用度和產率。然而環(huán)糊精的價格較高制約了其在生物催化領域中的大范圍應用，采用合適的方法擴大環(huán)糊精在生物轉化反應中的應用是亟待解決的重要問題。通過接枝技術將環(huán)糊精固載到殼聚糖、海藻酸鈉等高分子載體上，可以把β-環(huán)糊精從溶于水的粉體材料制備成不溶于水的高分子材料，克服環(huán)糊精難回收的缺陷，使其能夠循環(huán)利用，降低工業(yè)使用的成本。接枝后的環(huán)糊精仍保留獨特的空腔結構及其它優(yōu)良性質，同時還擁有了高分子載體良好的機械性能、穩(wěn)定性等特征，這大大拓寬了環(huán)糊精的應用空間，提升了它的應用價值。海藻酸鈉是一種天然聚陰離子多糖高分子化合物，由g、m兩個單元構成，遇水后表面具有粘性，會使得溶液也具有粘性。其安全無毒，成本低，生物可降解性以及生物相容性良好，具備藥用輔料所需的性質，遇到ca2+、zn2+等陽離子時，會發(fā)生化學反應形成凝膠球，針對這種性質，可用作藥物的緩釋和控釋材料，以及用于固定性質不穩(wěn)定物質，提高穩(wěn)定性，同時還可用于固定微生物、細胞、酶等，實現循環(huán)利用。目前海藻酸鈉的應用主要涉及到農藥、食品、生物醫(yī)藥等領域，也被逐漸延伸到重金屬污染的救治方面。中國專利cn105754984-a公布了海藻酸鈉復合固定化菌劑及其制備方法以及用途，公開了海藻酸鈉復合固定化菌劑及其制備方法，解決了現有技術中并沒有適用于二氯喹啉酸降解用假單胞菌的固定化方式的問題。本發(fā)明包括將具有假單胞菌的載體培養(yǎng)基和海藻酸鈉混合后，滴入濃度為1～4％的氯化鈣中靜置2～4h制成的顆粒劑；所述海藻酸鈉的質量濃度為2～6％；所述載體培養(yǎng)基包括吸附載體和無機鹽液體培養(yǎng)基；該吸附載體與海藻酸鈉的重量比為1～3:1,該吸附載體由重量比為1:1～2:1的玉米芯、竹炭和油枯組成。本發(fā)明通過有效提高菌體的降解效率；且本發(fā)明固定化菌劑的降解率遠遠高于空白小球物理吸附效率和游離菌株的生物降解效率之和,能有效達到相互促進的效果。海藻酸鈉作為天然高分子載體，分子中含有-cooh和-oh兩種親水基團，具有較強的親水性，并且可以環(huán)氧氯丙烷為交聯劑與環(huán)糊精進行接枝，形成的環(huán)糊精-海藻酸鈉接枝物可以固定化細胞，實現環(huán)糊精和細胞的共循環(huán)。目前關于以海藻酸鈉作為載體，以天然高分子材料接枝環(huán)糊精的形式作為促溶劑運用于難溶化合物的生物轉化，并對環(huán)糊精及細胞進行共循環(huán)利用的技術尚未可見。技術實現要素：：為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種甾體生物催化反應中環(huán)糊精介質及催化細胞循環(huán)利用的方法，具體如下：在甾體生物催化反應中，以衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠作催化劑，反應結束后，進行過濾，濾液用于收集反應產物，過濾物即衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，使用反應溶液洗滌1-8次后，重新用于甾體生物催化反應，從而實現環(huán)糊精介質及細胞循環(huán)利用；所述反應溶液為tris-hcl緩沖溶液、生理鹽水或純水等，ph7.0-ph7.6；所述洗滌細胞膠珠的反應溶液的用量為每克細胞膠珠10-100ml；所述衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠的制備方法如下：(1)海藻酸鈉接枝環(huán)糊精按海藻酸鈉和衍生環(huán)糊精按摩爾比1:0.2-1:1.5稱取海藻酸鈉和環(huán)糊精，加入三角瓶中，并加入海藻酸鈉45-55倍(質量體積比)的蒸餾水，30-70℃水浴中攪拌使之完全溶解；按環(huán)氧氯丙烷與蒸餾水體積比0.05-1:50加入環(huán)氧氯丙烷，同時按環(huán)氧氯丙烷與naoh溶液體積比0.05-1:10滴加0.5mol/l的naoh溶液，滴加時間10min，之后反應1.5-6.5h；(2)固定化細胞膠珠的制備待步驟(1)的反應液冷卻后，加入終濃度為1-30g/l的菌體靜息細胞，攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.1-0.5mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續(xù)浸泡1-6h，過濾，用反應溶液洗滌1-8次，即得衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠；所述反應溶液為tris-hcl緩沖溶液、生理鹽水或純水等，ph7.0-ph7.6；所述的衍生環(huán)糊精，具體為羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、磺酸基-β-環(huán)糊精、羥丙基-γ-環(huán)糊精或甲基-γ-環(huán)糊精等；所述衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠可在不補加環(huán)糊精及微生物細胞的條件下循環(huán)使用8次以上；所述衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠可通過活化延長循環(huán)利用的次數，所述的活化方法具體如下：(1)將催化效率降低的衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠10g,投入到30ml發(fā)酵培養(yǎng)基進行活化，160r/min，32℃的搖床下振蕩培養(yǎng)20h；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)菌體時使用的培養(yǎng)基；(2)培養(yǎng)結束后將發(fā)酵液過濾得到膠珠，用反應溶液將膠珠洗滌干凈后，將其置于cacl2溶液中再次固定2h，反應溶液洗滌收集膠珠1-8次，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；活化后衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠可再次循環(huán)利用3-5次。有益效果：(1)本發(fā)明首次實現環(huán)糊精介質及細胞的循環(huán)利用，在循環(huán)8次后甾體底物轉化率仍在90％以上，達到提高甾體催化反應效率的同時降低生產成本的目的，具有很好的應用價值和推廣前景。(2)本發(fā)明可以提高甾體底物生物催化初始轉化速率，提高最終轉化率。(3)本發(fā)明所述的環(huán)糊精循環(huán)利用工藝方法簡單便捷，便于實現，成本節(jié)約。具體實施方式：以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1：衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠及其在醋酸可的松c1,2位脫氫反應中的應用微生物菌種采用簡單節(jié)桿菌(arthrobactersimplex)tccc11037，它能實現甾體化合物的c1，2位脫氫轉化，將醋酸可的松(ca)轉化為醋酸潑尼松；斜面培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖10，酵母膏10，瓊脂20，ph7.2；種子培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖10，玉米漿10，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5，ph7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖10，玉米漿15，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5，ph7.2；簡單節(jié)桿菌靜息細胞的制備：tccc11037在32℃，160r/min，30/250ml種子培養(yǎng)基裝量條件下培養(yǎng)18h后，按5％接種量接種于裝有30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，32℃，160r/min條件下培養(yǎng)20h，將發(fā)酵培養(yǎng)獲得的細胞5000r/min離心后用ph7.2的tris-hcl緩沖液洗滌三遍，重懸于ph7.2的tris-hcl緩沖液中得簡單節(jié)桿菌靜息細胞菌懸液；衍生環(huán)糊精接枝海藻酸鈉固定化細胞的制備：準確稱取海藻酸鈉0.99g(5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:0.2的羥丙基-β-環(huán)糊精于100ml三角瓶中，加入約50ml蒸餾水，30℃水浴中電動攪拌使之完全溶解，加入0.6ml的環(huán)氧氯丙烷，同時滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，約3.5h后停止反應。待反應液冷卻后，加入菌體靜息細胞懸液，使得菌體濃度為20g/l。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.3mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續(xù)浸泡3h，過濾，用tris-hcl(ph7.2)洗滌4次。生物轉化：稱取0.06g的ca于100ml三角瓶中，加入20ml的tris-hcl(ph7.2)，實驗組加入10g上述步驟制備的環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠(接枝的羥丙基-β-環(huán)糊精量為0.043g)，對照組加入不接枝環(huán)糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠，控制加入的菌體與實驗組等量，34℃、180r/min轉化8h，hplc法測定底物轉化率；環(huán)糊精及細胞的循環(huán)利用工藝：將環(huán)糊精與海藻酸鈉接枝固定細胞后用于上述ca的生物催化反應，反應結束后收集衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，將其用tris-hcl(ph7.2)洗滌3次，用量為每次每克細胞膠珠50ml，洗滌后重新用于醋酸可的松的生物轉化，用量不變，hplc法測定每次循環(huán)后的底物轉化率；循環(huán)利用5次后，轉化率降至91％，將衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠進行活化，步驟如下：將回收的10g衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠投入到30ml發(fā)酵培養(yǎng)基進行活化，160r/min，32℃的搖床下振蕩培養(yǎng)20h；培養(yǎng)結束后將發(fā)酵液過濾得到膠珠，用tris-hcl(ph7.2)緩沖液將膠珠洗滌干凈后，將其置于cacl2溶液中再次固定2h，洗滌收集膠珠，再次用于ca的生物催化反應；結果表明，對照組的初次轉化率為86％，接枝羥丙基-β-環(huán)糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠的初次轉化率是95％，初始轉化速率是對照組(1.1×10-2g/lmin-1)的1.3倍，循環(huán)利用8次后，ca的最終轉化率為92％，見表1。表1循環(huán)次數12345678轉化率95％96％95％94％91％94％92％92％實施案例2：除以下內容外，其他同實施例1。衍生環(huán)糊精接枝海藻酸鈉固定化細胞的制備：準確稱取海藻酸鈉0.99g(5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:1.5的磺丁基-β-環(huán)糊精于100ml三角瓶中，加入約50ml蒸餾水，60℃水浴中電動攪拌使之完全溶解，加入1ml的環(huán)氧氯丙烷，同時滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，6.5h后停止反應。待反應液冷卻后，加入菌體靜息細胞懸液，使得菌體濃度為30g/l。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.5mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續(xù)浸泡6h，過濾，用生理鹽水(ph7.2)洗滌3次備用。生物轉化：稱取0.06g的ca于100ml三角瓶中，加入20ml的生理鹽水(ph7.2)，實驗組加入10g上述步驟制備的環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠(接枝的磺丁基-β-環(huán)糊精量為0.119g)，對照組加入不接枝環(huán)糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠，控制加入的菌體與實驗組等量，34℃、180r/min轉化8h，hplc法測定底物轉化率；將環(huán)糊精與海藻酸鈉接枝后用于上述ca的生物催化反應，反應結束后收集衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，將其用生理鹽水(ph7.2)洗滌4次，用量為每次每克細胞膠珠80ml，洗滌后重新用于醋酸可的松的生物轉化，用量不變。結果表明，接枝磺丁基-β-環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠首次用于ca生物催化的初始轉化速率是對照組(1.1×10-2g/lmin-1)的1.4倍，且循環(huán)利用5次后對磺丁基-β-環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞進行活化，活化方法同實施例1，活化后繼續(xù)循環(huán)使用3次，ca的最終轉化率為94％。實施案例3：除以下內容外，其他同實施例1。環(huán)糊精接枝海藻酸鈉固定化細胞：準確稱取海藻酸鈉0.99g(5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:1的甲基-β-環(huán)糊精于100ml三角瓶中，加入約50ml蒸餾水，70℃水浴中電動攪拌使之完全溶解，加入0.1ml的環(huán)氧氯丙烷，同時滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，約1.5h后停止反應。待反應液冷卻后，加入菌體靜息細胞懸液，使得菌體濃度為15g/l。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.25mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續(xù)浸泡2h，過濾，用tris-hcl(ph7.5)洗滌2次。生物轉化：稱取0.06g的ca于100ml三角瓶中，加入20ml的tris-hcl(ph7.5)，再加入10g衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠(接枝的甲基-β-環(huán)糊精量為0.063g)，對照組加入不接枝環(huán)糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠，控制加入的菌體與實驗組等量，34℃、180r/min轉化8h，hplc法測定底物轉化率；將環(huán)糊精與海藻酸鈉接枝后用于上述ca的生物催化反應，反應結束后收集衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，將其用tris-hcl(ph7.5)洗滌2次，用量為每次每克細胞膠珠100ml，洗滌后重新用于醋酸可的松的生物轉化，用量不變。結果表明，接枝甲基-β-環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠首次用于ca生物催化的初始轉化速率是對照組(1.1×10-2g/lmin-1)的1.5倍，且循環(huán)利用5次后對甲基-β-環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細胞進行活化，活化方法同實施例1，活化后繼續(xù)循環(huán)使用4次，ca的最終轉化率為92％。雖然上文已經用一般性說明、具體實施方式及實驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁12