本發(fā)明涉及基因工程領域。具體地,本發(fā)明涉及真菌來源的多結構域酸性纖維素酶及其基因和應用。
背景技術:
纖維素酶根據(jù)其催化反應功能的不同可分為內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖產生兩分子的葡萄糖。真菌纖維素酶產量高、活性大,在畜牧業(yè)和飼料工作中主要應用真菌來源的纖維素酶。
纖維素酶已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、紡織印染、石油開采、精細化工及生物技術等諸多領域,是一種新型的工業(yè)酶,具有很大的潛在應用價值。
纖維素酶的最主要來源是微生物,不同微生物合成的纖維素酶在組成上差異明顯,對纖維素的降解能力也不盡相同。細菌與放線菌生產的纖維素酶產量均不高,在工業(yè)上很少應用,而真菌具有產酶的諸多優(yōu)點。
目前國內外,雖然許多纖維素酶被克隆分離及性質測定,但這些酶的性質特征,均存在一些缺陷,例如,ph作用范圍不合適,熱穩(wěn)定性差,表達量低等,均不能滿足實際應用的需要。因此人們希望能夠找到新的能夠滿足實際應用需求的纖維素酶,從而能夠進一步推廣纖維素酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用。
本發(fā)明從talaromycesleycettanusjcm12802菌株中得到了一個新的多結構域纖維素酶基因,其編碼的纖維素酶具有以下幾個優(yōu)點:酸性、耐高溫、容易發(fā)酵生產。所有這些優(yōu)點都意味著新發(fā)明的纖維素酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中,將會比一千報道的纖維素酶更有應用價值。
技術實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種多結構域酸性纖維素酶。
本發(fā)明的再一目的是提供上述纖維素酶的基因。
本發(fā)明的再一目的是提供包含上述纖維素酶的重組載體。
本發(fā)明的再一目的是提供包含上述纖維素酶基因的重組菌株。
本發(fā)明的再一目的是提供一種制備纖維素酶的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供上述纖維素酶的應用。
本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足,提供一種性質優(yōu)良的、適合于在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用的新的酸性纖維素酶,其氨基酸序列如seqidno.1:
其中,該酶全長654個氨基酸,n端18個氨基酸為信號肽序列“mqvllvatlasfvggawa”。
因此,成熟的纖維素酶cel5的理論分子量為68.5kda,其氨基酸序列如seqidno.2:
該纖維素酶的最適ph為3.0,在ph2.2-4.0范圍內,該酶能夠維持其50%以上的酶活力;最適溫度為50℃,在30℃時依然具有約63%的酶活力,在50℃下處理60min,剩余酶活在60%以上,在60℃下處理10min,依然能夠保持20%的酶活力。
本發(fā)明還提供了編碼上述纖維素酶的基因。該酶的全基因序列如seqidno.3所示:
本發(fā)明通過pcr的方法分離克隆了這個纖維素酶基因cel5x,dna全序列分析結果表明,纖維素酶cel5x結構基因全長2411bp,含有7個內含子,+77~152bp,+222~282bp,+637~688bp,+821~873bp,+1225~1285bp,+1308~1368bp,+2168~2249bp為其內含子序列,cdna長1965bp,其cdna序列如seqidno.4所示:
其中,信號肽的堿基序列為:
“atgcaagtgttgctcgtcgccaccctcgcatccttcgttggaggtgcctgggcg”
因此,成熟基因的編碼序列為
seqidno.5所示:
成熟蛋白理論分子量為68.5kda,該酶屬于糖基水解酶第5家族。將纖維素酶基因cel5xcdna序列及推導出的氨基酸序列在genbank中進行blast比對發(fā)現(xiàn),確定cel5x是一種新的纖維素酶基因,與已經報道的來源于penicilliumdecumbens的cel5c相似度達到71%。cel5x為多結構域纖維素酶,其n端包含一個家族cbm區(qū),c端包含一個cbmx2。
本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶基因的重組載體,優(yōu)選為ppic9-cel5x。將本發(fā)明的纖維素酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間,使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案,優(yōu)選為將纖維素酶基因插入到質粒ppic9上的snabi和noti限制性酶切位點之間,使該核苷酸序列位于aoxl啟動子的下游并受其調控,得到重組酵母表達質粒ppic9-cel5x。
本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶基因的重組菌株,優(yōu)選為重組菌株gs115/cel5x。
本發(fā)明還提供了一種制備纖維素酶的方法,包括以下步驟:
1)用上述重組載體轉化宿主細胞,得重組菌株;
2)培養(yǎng)重組菌株,誘導重組纖維素酶的表達;以及
3)回收并純化所表達的纖維素酶。
其中,優(yōu)選所述宿主細胞為畢赤酵母(pichiapastoris)細胞、啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)細胞或多型漢遜酵母(hansenulapolymorpha)細胞,優(yōu)選將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞(pichicpastoris)gs115,得到重組菌株gs115/cel5x。
本發(fā)明還提供了上述纖維素酶的應用。運用基因工程手段來產業(yè)化生產纖維素酶。本發(fā)明提供了一個新的纖維素酶基,可作應用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術方案就可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產性質優(yōu)良適合工業(yè)應用的纖維素酶。
附圖說明
圖1為重組纖維素酶的sds-page電泳圖。
圖2顯示本發(fā)明的纖維素酶的酶學性質。
具體實施方式
試驗材料和試劑
1、菌株及載體:畢赤酵母(pichiapastorisgs115)為本實驗室保存;畢赤酵母表達載體ppic9及菌株gs115購自于invitrogen公司。
2、酶類及其它生化試劑:內切酶購自takara公司,連接酶購自invitrogen公司,其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
3、培養(yǎng)基:
(i)產酶培養(yǎng)基:30g/l麥麩,30g/l玉米芯粉,30g/l豆粕,5g/l大麥葡聚糖,5g/l(nh4)so4,1g/lkh2po4,0.5g/lmgso4·7h2o,0.01g/lfeso4·7h2o,0.2g/lcacl2于1l去離子水中,121℃,15磅條件下滅菌處理20min
(2)大腸桿菌培養(yǎng)基lb(126蛋白胨、0.5%酵母提取物、126naci,ph7.o)。
(3)bmgy培養(yǎng)基;1%酵母提取物,2%蛋白胨,1.34%ynb,0.000049<biotin,1%甘油(v/v)。
(4)bmmy培養(yǎng)基:除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均與bmgy相同,ph4.0。
說明:以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法,均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行,或者按照試劑盒和產品說明書進行。
實施例1纖維素酶編碼基因cel5x的克隆
提取talaromycesleycettanusjcm12802基因組dna,以talaromycesleycettanus總dna為模板,以cel5x-f和cel5x-r為引物進行pcr擴增(見表1),pcr反應參數(shù)為:95℃5min;94℃30sec,60℃30sec,72℃30sec,30個循環(huán),得到一約1400bp片段,將該片段回收后送睿博生物技術有限公司測序。
表1本實驗所需的引物
實施例2纖維素酶cdna的獲得
提取talaromycesleycettanusjcm12802總rna,利用oligo(dt)20和反轉錄酶得到cdna的一條鏈,然后以cel5x-f和cel5x-r(見表1),擴增該單鏈cdna,獲得纖維素酶的cdna序列,擴增得到產物回收后送睿博生物技術有限公司測序。
通過對纖維素酶cel5x的基因組序列和cdna序列比對后發(fā)現(xiàn)該基因有含有7個內含子,cdna長1965bp,編碼654個氨基酸和一個終止密碼子,n端18個氨基酸為其信號肽序列,經比對證明從talaromycesleycettanusjcm12802中分離克隆得到的編碼纖維素酶的基因為新基因。
實施例3纖維素酶工程菌株的構建
(1)表達載體的構建及在酵母的表達
以測序正確的纖維素酶cel5x的cdna為模板,設計合成了帶有snabi和noti限制性酶切位點的引物cel5x-f和cel5x-r(見表1),對cel5x的成熟蛋白的編碼區(qū)進行擴增,并利用snabi和noti酶切pcr產物,連接進入表達載體ppic9(invitrogen,sandiego),纖維素酶cel5x成熟蛋白的序列插入到上述表達載體的信號肽序列的下游,與信號肽形成正確的閱讀框架,構建成酵母表達載體ppic9-cel5x,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞trans1。陽性轉化子進行dna測序,測序表明序列正確的轉化子用于大量制備重組質粒。用限制性內切酶bglii進行線性化表達質粒載體dna,電擊轉化酵母gs115感受態(tài)細胞,30℃培養(yǎng)2-3天,挑取在md平板上生長的轉化子進行進一步的表達實驗,具體操作請參考畢赤酵母表達操作手冊。
以同樣的方式構建含cel5x信號肽序列的cdna的表達載體,并轉化。
(2)高纖維素酶活性轉化子的篩選
用滅過菌的牙簽從長有轉化子的md板上挑取單菌落,按照編號先點到md平板上,將md平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2天,至菌落長出。按編號從md平板上挑取轉化子接種于裝有3mlbmgy培養(yǎng)基的離心管中,30℃、220rpm搖床培養(yǎng)48h;將搖床培養(yǎng)48h的菌液3,000×g離心15min,去上清,離心管中再加入1ml含有0.5%甲醇的bmmy培養(yǎng)基,在30℃、220rpm誘導培養(yǎng);誘導培養(yǎng)48h后,3,000×g離心5min,取上清用于酶活性檢測,從中篩選出高纖維素酶活性的轉化子,具體操作請參考畢赤酵母表達操作手冊。
實施例4重組纖維素酶的制備
(1)纖維素酶基因cel5x在畢赤酵母中搖瓶水平的大量表達
篩選出酶活較高的轉化子,接種于300mlbmgy液體培養(yǎng)基的1l三角瓶中,30℃,220rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h;5,000rpm離心5min,輕柔棄上清,再向菌體加入100ml含有0.5%甲醇的bmmy液體培養(yǎng)基,30℃,220rpm誘導培養(yǎng)72h。誘導培養(yǎng)期間,間隔24h補加一次甲醇溶液以補償甲醇的損失,使甲醇濃度保持在0.5%左右;12,000×g離心10min,收集上清發(fā)酵液,檢測酶活性并進行sds-page蛋白電泳分析。
(2)重組纖維素酶的純化
收集搖瓶表達的重組纖維素酶上清液,通過10kda膜包進行濃縮,同時用低鹽緩沖液置換其中的培養(yǎng)基,然后用10kda超濾管進一步的濃縮。濃縮能稀釋到一定倍數(shù)的重組cel5x,通過離子交換層析進行純化。具體地,取cel5x濃縮液2.0ml經預先用10mmtris-hcl(ph7.8)平衡過的hitrapqsepharosexl陰離子柱,然后用0-1mol/l的nacl進行線性梯度洗脫,對分步收集的洗脫液檢測酶活性和進行蛋白濃度的測定。
實施例5重組纖維素酶部分性質分析
采用dns法對本發(fā)明的纖維素酶進行活性分析。具體方法如下:在ph5.0,60℃條件下,1ml的反應體系包括l00μl適當?shù)南♂屆敢海?00μl底物,反應l0min,加入1.5mldns終止反應,沸水煮5min。冷卻后540nm測定od值。纖維素酶活性單位定義:在一定條件下,每分鐘分解羧甲基纖維素生成lμmol還原糖所需的酶量為1個活性單位(u)。
(1)纖維素酶cel5x的最適ph及ph穩(wěn)定性
經純化的實施例3表達的纖維素酶cel5x在不同的ph下進行酶促反應以測定其最適ph。所用緩沖液為ph1.0~3.0甘氨酸-鹽酸緩沖液,ph2.2~8.0的檸檬酸一磷酸氫二鈉系列緩沖液。所用底物為cmc-na。純化的cel5x在不同ph的緩沖體系,50℃下測定的ph適性結果(圖2,a)表明:cel5x的最適ph為3.0,呈酸性。
將酶液在不同ph值的緩沖液中于37℃下處理60min,再測定酶活性以研究酶的ph穩(wěn)定性。所用緩沖液為ph1.0~2.0甘氨酸-鹽酸緩沖液,ph3.0~8.0檸檬酸-磷酸氫二鈉系列緩沖液,ph9.0~l2.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。結果表明(圖2,b),分析結果表明ph3.0-ph10.0之間能夠維持60%以上的酶活力,說明該酶具有優(yōu)良的ph穩(wěn)定性。
(2)纖維素酶cel5x反應最適溫度及熱穩(wěn)定性
純化的纖維素酶cel5x在ph3.0條件下,測定不同溫度(30℃-90℃)下的酶活性,分析實驗結果表明顯示,該酶的最適反應溫度為50℃,在30℃時依然具有60%以上的酶活力(圖2,c)。耐溫性測定為纖維素酶在不同溫度下處理不同時間,再在50℃下進行酶活性測定。熱穩(wěn)定性實驗表明:該纖維素酶在50℃下處理60min,剩余酶活在70%以上,即使該酶在60℃下處理10min,依然能夠保持22%的酶活力(圖2,d)。
(3)纖維素酶cel5x對多種底物的比活性
在最適ph與最適溫度下,將該纖維素酶與不同種類的底物反應相同時間,分析實驗結果表明,該酶能夠降解大麥葡聚糖(269u/mg),羧甲基纖維素鈉(166u/mg),地衣多糖(460u/mg),葡甘露聚糖(26u/mg),木聚糖(5.5u/mg)。此外,過夜反應,cel5x還能檢測到角豆膠活性。結果表明,對于纖維素半纖維素類的底物,該酶均可以降解,具有廣泛的底物特異性,這使得cel5x更適合應用于工業(yè)生產。
<110>中國農業(yè)科學院飼料研究所
<120>真菌來源的多結構域酸性纖維素酶及其基因和應用
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