本發(fā)明屬于生物工程
技術領域：
，尤其涉及一種快速檢測工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝基因的方法。
背景技術：
：啤酒是一種深受人們喜愛的低酒精含量且營養(yǎng)豐富的飲料。當今全球啤酒市場超過90％是lager類型的啤酒，因此用于釀制lager啤酒的下面啤酒酵母(俗稱“l(fā)ager酵母”)已被最廣泛地應用在啤酒工業(yè)中。lager酵母(saccharomycespastorianus)并不同于1996年已作為模式生物進行全基因組測序的釀酒酵母(s.cerevisiae)，而是一種具有高度染色體倍性、染色體結構組成復雜的異源多倍體菌種，除攜帶一部分釀酒酵母基因外，還攜帶貝氏酵母(s.bayanus)的遺傳信息。因此對于lager酵母中的大部分基因都存在sc-(s.cerevisiae)和sb-(s.bayanus)兩個同源基因。啤酒中至少有45種不同的醇類，最主要的有脂肪醇和芳香醇兩類。其中脂肪醇中異戊醇含量最豐富，大約有25-120mg/l；而芳香醇中的苯乙醇的含量也較高，大約在5-100mg/l。β-苯乙醇是一種具有玫瑰花香的芳香醇，啤酒酵母具有從頭合成和生物轉化l-苯丙氨酸生成β-苯乙醇(即艾氏途徑)的能力。在酵母細胞中，β-苯乙醇合成走哪一條途徑取決于培養(yǎng)基中的氮源。谷氨酸、銨鹽等一般作為優(yōu)質的、較易利用的氮源使用，而氨基酸、尿素等只作為次級氮源使用。但是，只有當l-苯丙氨酸作為唯一氮源時，艾氏途徑才占優(yōu)勢。如果環(huán)境中有其他更容易利用的氮源存在，即使在較高的l-苯丙氨酸濃度條件下，l-苯丙氨酸仍有一部分通過其它途徑被代謝。除此之外，同為芳香醇的酪醇和色醇對于啤酒風味的影響，目前尚未見比較肯定的意見。色醇對上面發(fā)酵啤酒比較重要，而在下面發(fā)酵啤酒中含量很低，這是酵母對色氨酸的代謝差異造成的。目前，熒光定量pcr方法是現(xiàn)在最為常用的定量mrna的方法。但由于該方法通量不高的局限性，因此需要一種快速、準確的技術對lager酵母多個芳香醇代謝相關基因表達同時進行檢測。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種快速檢測工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝基因的方法，尤其是采用gexp多重基因表達定量分析技術檢測工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝相關基因(adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc和aro80-sb)表達的方法，有利于在不同生產(chǎn)條件下，控制發(fā)酵過程中芳香醇代謝及含量，提高啤酒的風味穩(wěn)定性及一致性；并可以通過快速調整啤酒中芳香醇風味，節(jié)省研發(fā)成本，加速新產(chǎn)品的開發(fā)。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種快速檢測工業(yè)巴氏酵母芳香醇，尤其是β-苯乙醇代謝基因的方法，包括總rna的提取、逆轉錄反應制備cdna模板、多重pcr反應、毛細血管電泳、產(chǎn)物片段分析，針對工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝相關基因adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc和aro80-sb，逆轉錄反應制備cdna模板應用引物為seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6、seqidno.8、seqidno.10、seqidno.12、seqidno.14、seqidno.16、seqidno.18、seqidno.20、seqidno.22、seqidno.24、seqidno.26、seqidno.28、seqidno.30，多重pcr反應中應用引物seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.11、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.17、seqidno.19、seqidno.21、seqidno.23、seqidno.25、seqidno.27、seqidno.29。作為優(yōu)選技術方案，還包括作為內參照基因的工業(yè)巴氏酵母β-actin基因act1-sc、act1-sb，逆轉錄反應制備cdna模板應用引物為seqidno.32、seqidno.34；多重pcr反應中應用引物seqidno.31、seqidno.33。具體檢測步驟如下：(1)使用下述多重引物進行工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝關鍵基因的檢測：設計符合gexp多重pcr反應特點的、且能夠檢測工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝相關基因表達的特異性上下游引物，以及作為內參照基因的特異性上下游引物(見表1)：表1工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝相關基因以及內參照基因的特異性上下游引物其中每條引物分別配制成100μm的儲存液，下游引物工作液為500nm，上游引物工作液為200nm；(2)總rna提取與純化：采用通用的rna提取方法和純化方法，從酵母細胞中提取得到純化的酵母總rna；(3)逆轉錄反應制備cdna模板：以酵母總rna為模板合成cdna第一鏈，上述(1)中的多重引物的下游引物為特異性引物，反應體系為20μl；其中，ntc和rt-為陰性對照，具體反應條件見表2、表3。表2逆轉錄反應制備cdna模板的反應條件每管成分ntcrt-標準反應無dna酶/rna酶水8μl4μl3μl5×反轉錄緩沖液4μl4μl4μlkanrrna(1:50稀釋)5μl5μl5μl反轉錄酶1μl01μl下游引物(500nm)2μl2μl2μlrna模板(5-20ng/μl)05μl5μl表3各基因的下游引物濃度基因產(chǎn)物大小下游引物濃度(nm)adh1-sb18762.5adh1-sc244125adh3-sb1657.8125adh3-sc169500adh4-sb4067.8125adh4-sc142500adh5-sb200500adh5-sc146125aro8-sc251500aro9-sb240500aro9-sc38962.5aro10-sb316500aro10-sc219500aro80-sb331500aro80-sc2641500act1-sb2840.5act1-sc362500逆轉錄反應制備cdna模板反應參數(shù)設置如下：48℃1分鐘；42℃60分鐘；95℃5分鐘。(4)多重pcr：以上述合成的逆轉錄反應制備cdna模板為模板，上述(1)中的多重引物的上游引物為特異性引物，進行多重pcr擴增反應，每個樣品設3個平行管，采用beckmancoulte公司的dna聚合酶以及genomelabtmgexp啟動試劑盒進行，具體反應條件見表4。表4多重pcr的反應條件成分體積(μl)25mmmgcl24.0μl5×pcr緩沖液4.0μldna聚合酶0.7μl上游引物(200nm)2μlcdna第一鏈9.3μlrt-pcr擴增參數(shù)設置如下：95℃10分鐘；94℃30秒；56℃30秒；71℃1分鐘(35個循環(huán))。(5)多重pcr產(chǎn)物毛細管電泳：取1μlpcr多重產(chǎn)物加到分裝有39μl的sls+dss混合液的上樣板的孔中，用移液槍混勻后覆蓋一滴石蠟油。另外，在緩沖液板每孔中加入250μl的分離緩沖液。全部準備完后，上機進行毛細管電泳。分離膠、分離緩沖液購自beckmancoulter。(6)產(chǎn)物片段分析：利用gexp系統(tǒng)參數(shù)對毛細管電泳結果進行分析，記錄結果。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果在于：(1)采用本發(fā)明檢測方法能夠靈敏、特異、準確地檢測adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc和aro80-sb基因表達的水平。芳香醇代謝關鍵基因表達量的變化，反應了酵母芳香醇的生成情況，因此可以用于研究工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝調控機理。(2)本發(fā)明采用的gexp多重基因表達定量分析技術與常規(guī)的基因表達定量分析技術(熒光定量pcr)相比具有更強的特異性和靈敏性、自動化程度高等特點，保證了結果的可靠性和可重復性。另外，由于gexp多重基因表達定量分析技術可以同時檢測多達30個基因的表達豐度，大大縮短了實驗時間。(3)本發(fā)明有利于在不同生產(chǎn)條件下，控制發(fā)酵過程中芳香醇代謝及含量，提高啤酒的風味典型性及一致性；并可以通過快速調整啤酒中芳香醇風味，突出產(chǎn)品特色及進行新產(chǎn)品的開發(fā)。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例所提供的利用gexp系統(tǒng)參數(shù)對毛細管電泳結果進行分析的示意圖；圖2為本發(fā)明實施例所提供的a、b兩種工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝關鍵基因的表達量的示意圖。具體實施方式下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例1(1)本實施例提供了一種快速檢測工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝基因的方法，包括總rna的提取、逆轉錄反應制備cdna模板、多重pcr反應、毛細血管電泳、產(chǎn)物片段分析，針對工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝相關基因adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc和aro80-sb，逆轉錄反應制備cdna模板應用引物為seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6、seqidno.8、seqidno.10、seqidno.12、seqidno.14、seqidno.16、seqidno.18、seqidno.20、seqidno.22、seqidno.24、seqidno.26、seqidno.28、seqidno.30，多重pcr反應中應用引物seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.11、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.17、seqidno.19、seqidno.21、seqidno.23、seqidno.25、seqidno.27、seqidno.29。在上述基礎上，還包括作為內參照基因的工業(yè)巴氏酵母β-actin基因act1-sc、act1-sb，逆轉錄反應制備cdna模板應用引物為seqidno.32、seqidno.34；多重pcr反應中應用引物seqidno.31、seqidno.33。根據(jù)adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc，aro80-sb基因以及內參基因act1-sc、act1-sb的全長序列，使用primerpremier5軟件設計符合gexp多重pcr反應特點的、且能夠檢測工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝相關基因表達的特異性上下游引物，以及作為內參照基因的特異性上下游引物，引物序列見下表5：表5工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝相關基因以及內參照基因的特異性上下游引物單一引物毛細管電泳結果顯示擴增后的產(chǎn)物長度與預計產(chǎn)物長度一致，說明設計的引物具有很強的特異性，適合用于gexp檢測。(2)取發(fā)酵條件一致的a、b兩種酵母菌株發(fā)酵罐中的滿罐酵母細胞樣，迅速提取rna(3)總rna的提取與純化(ribopuretm-yeastkit，ambion，產(chǎn)品編號am1926)：1)取750μl氧化鋯珠于1.5ml離心管(帶螺旋蓋)，約2.5cm高處；2)酵母收集管中按順序加入裂解液(480μllysisbuffer+48μl10％sds+480μlphenol：cloroform：iaa)，重懸。渦旋振蕩10-15s；3)將混合液轉移到準備好的750μl氧化鋯小珠離心管中，蓋緊；4)將離心管置于渦旋振蕩器震蕩10min(最大轉速)，裂解細胞；5)16000g室溫離心5min，將上層水相轉移到10ml離心管中；6)加入1.9mlbindingbuffer，混勻；7)加入1.25ml100％乙醇，混勻；8)取700μl混合液到filtercartridge+collectiontube中，12000g離心1min，棄收集液；重復該步驟，至上述混合液全部轉移；9)在filtercartridge上加入700μlwashsolution1，12000g離心1min，棄收集液；10)加入500μlwashsolution2/3，12000g離心1min，棄收集液。重復該步驟；11)12000g離心1min，徹底去除膜上液體，將filtercartridge轉移到新的collectiontube中；12)加入95-100℃預熱的elutionsolution25-50μl到膜中央，12000g離心1min。再加25-50μlelutionsolution到膜中央，12000g離心1min，即獲得rna收集液；13)dnasei處理50-100μlrna樣本+1/10thvol10×dnaseibuffer+4μldnasei，37℃反應30min。加入1/10thvoldnaseinactivationreagent(使用前先渦旋)，渦旋震蕩后混勻，室溫放置5min后，12000g離心2-3min，使dnaseinactivationreagent沉淀，將rna上清液轉移至新管中保存，即可得到純化的總rna。(4)逆轉錄反應制備cdna模板：以上述所述純化的酵母細胞rna為模板，使用beckmancoulter公司的genomelabtmgexp啟動試劑盒，上述表5中的多重引物的下游引物為特異性引物，以酵母細胞的總rna為模板合成cdna第一鏈，反應體系為20μl。genomelabtmgexp啟動試劑盒(產(chǎn)品編號：pna85017)，含有反轉錄反應緩沖液、反轉錄酶、pcr反應緩沖液、kanrrna、無dna酶/rna酶的水、dnamarker(dss-400)、礦物油、gexp上樣緩沖液；dna聚合酶(產(chǎn)品編號：pna85022)；分離膠(產(chǎn)品編號：pna608010)；分離緩沖液(產(chǎn)品編號：pna608012)，均購自beckmancoulter。cdna第一鏈合成反應體系設置見表6和表7，其中ntc和rt-為陰性對照：表6逆轉錄反應制備cdna模板的反應條件每管成分ntcrt-標準反應無dna酶/rna酶水8μl4μl3μl5×反轉錄緩沖液4μl4μl4μlkanrrna(1:50稀釋)5μl5μl5μl反轉錄酶1μl01μl下游引物(500nm)2μl2μl2μlrna模板(5-20ng/μl)05μl5μl表7各基因的下游引物濃度逆轉錄反應制備cdna模板反應參數(shù)設置如下：48℃1分鐘；42℃60分鐘；95℃5分鐘。(5)rt-pcr：采用beckmancoulter公司的dna聚合酶及genomelabtmgexp啟動試劑盒進行。以上述表2中合成的逆轉錄反應制備cdna模板為模板，上述表5中的多重引物的上游引物為特異性引物，進行rt-pcr擴增反應，每個樣品設3個平行管，具體反應條件見表8。表8rt-pcr的反應條件成分體積(μl)25mmmgcl24.0μl5×pcr緩沖液4.0μldna聚合酶0.7μl上游引物(200nm)2μlcdna第一鏈9.3μlrt-pcr擴增參數(shù)設置如下：95℃10分鐘；94℃30秒；56℃30秒；71℃1分鐘(35個循環(huán))。(6)多重pcr產(chǎn)物毛細管電泳：取1μlpcr多重產(chǎn)物加到分裝有39μl的sls+dss混合液的上樣板的孔中，用移液槍混勻后覆蓋一滴石蠟油。另外，在緩沖液板每孔中加入250μl的分離緩沖液。全部準備完后，上機進行毛細管電泳。分離膠、分離緩沖液購自beckmancoulter。(7)產(chǎn)物片段分析：利用gexp系統(tǒng)參數(shù)對毛細管電泳結果進行分析，記錄結果，如圖1所示，每個不同大小的峰均對應其相應的基因，且每個峰的高度對應著基因的表達量。圖2為a、b兩種工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝關鍵基因在發(fā)酵過程中的表達量。從圖2中看出兩株酵母菌株在芳香醇代謝性能上存在差異。具體的，菌株b的芳香醇代謝關鍵基因的表達量均高于菌株a，且在aro8-sc和aro80-sc基因的表達量上存在顯著差異。根據(jù)本發(fā)明提供的方法，可以快速同時檢測工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝關鍵基因(adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc，aro80-sb)表達水平，用于研究lager酵母芳香醇代謝調控機理。本發(fā)明有利于在不同生產(chǎn)條件下，控制發(fā)酵過程中芳香醇代謝及含量，提高啤酒的風味穩(wěn)定性及一致性；并可以通過快速調整啤酒中芳香醇風味，突出產(chǎn)品特色及進行新產(chǎn)品的開發(fā)。序列表<110>青島啤酒股份有限公司<120>一種快速檢測工業(yè)巴氏酵母芳香醇代謝基因的方法<160>34<170>patentinversion3.3<210>1<211>38<212>引物<213>adh1-sc<400>1aggtgacactatagaatactgaatgtgctccagtcttg38<210>2<211>40<212>引物<213>adh1-sc<400>2gtacgactcactatagggacaccaatggatctgaataatt40<210>3<211>37<212>引物<213>adh1-sb<400>3aggtgacactatagaatatgttcaatatgctaaggcg37<210>4<211>38<212>引物<213>adh1-sb<400>4gtacgactcactatagggattggtagccttaacgactg38<210>5<211>36<212>引物<213>adh3-sc<400>5aggtgacactatagaatacaacattgttcaccaggc36<210>6<211>37<212>引物<213>adh3-sc<400>6gtacgactcactatagggatgtaatgcagcttcccct37<210>7<211>42<212>引物<213>adh3-sb<400>7aggtgacactatagaataagtctacttgctagaaatatcctc42<210>8<211>37<212>引物<213>adh3-sb<400>8gtacgactcactatagggatttggttctgggactgga37<210>9<211>36<212>引物<213>adh4-sc<400>9aggtgacactatagaatagggatcacgtatgccgtt36<210>10<211>37<212>引物<213>adh4-sc<400>10gtacgactcactatagggactgcccttttttcctgtt37<210>11<211>35<212>引物<213>adh4-sb<400>11aggtgacactatagaatagcttacaacgacggctct35<210>12<211>38<212>引物<213>adh4-sb<400>12gtacgactcactatagggagttctcagccaagataccg38<210>13<211>36<212>引物<213>adh5-sc<400>13aggtgacactatagaatagccttcgcaagtcattcc36<210>14<211>40<212>引物<213>adh5-sc<400>14gtacgactcactatagggaaatttcgttaggcttaggttc40<210>15<211>35<212>引物<213>adh5-sb<400>15aggtgacactatagaatatcttctcaacccatcccg35<210>16<211>36<212>引物<213>adh5-sb<400>16gtacgactcactatagggacgtgccatgcgtgtaaat36<210>17<211>37<212>引物<213>aro8-sc<400>17aggtgacactatagaatagatgaaaccaatgctcgta37<210>18<211>38<212>引物<213>aro8-sc<400>18gtacgactcactatagggaaatctttgttgacggtgta38<210>19<211>37<212>引物<213>aro9-sc<400>19aggtgacactatagaatacccctgttgattacacttc37<210>20<211>39<212>引物<213>aro9-sc<400>20gtacgactcactatagggacgattaattctggacacaaa39<210>21<211>34<212>引物<213>aro9-sb<400>21aggtgacactatagaatagcgtcatcgagctggc34<210>22<211>37<212>引物<213>aro9-sb<400>22gtacgactcactatagggacggtggcagacctctagt37<210>23<211>37<212>引物<213>aro10-sc<400>23aggtgacactatagaataaatcaagaagaacgacacc37<210>24<211>36<212>引物<213>aro10-sc<400>24gtacgactcactatagggaacccatcttaggccagc36<210>25<211>34<212>引物<213>aro10-sb<400>25aggtgacactatagaataaatgctgcctatgccg34<210>26<211>40<212>引物<213>aro10-sb<400>26gtacgactcactatagggagttatcctgaaccatgtcatg40<210>27<211>35<212>引物<213>aro80-sc<400>27aggtgacactatagaatactacggacgaggggttg35<210>28<211>39<212>引物<213>aro80-sc<400>28gtacgactcactatagggactctatgagttcaatcgcct39<210>29<211>36<212>引物<213>aro80-sb<400>29aggtgacactatagaatatatcgcccagcatgatta36<210>30<211>42<212>引物<213>aro80-sb<400>30gtacgactcactatagggaatgagtgcaaagagtttacatat42<210>31<211>35<212>引物<213>act1-sc<400>31aggtgacactatagaataacgctcctcgtgctgtc35<210>32<211>37<212>引物<213>act1-sc<400>32gtacgactcactatagggatagaaggctggaacgttaa37<210>33<211>35<212>引物<213>act1-sb<400>33aggtgacactatagaataggcatcacaccttttaca35<210>34<211>35<212>引物<213>act1-sb<400>34gtacgactcactatagggaccggcgtagattggga35當前第1頁12