專(zhuān)利名稱(chēng)：一種釀酒酵母中Rav2p基因克隆與表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Rav2p的基因克隆與表達(dá)， 屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
V-ATP酶(Vacuolar ATPase)是一種普遍存在于真核生物的內(nèi)膜系統(tǒng)和高級(jí)真核 生物特殊組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜中靠水解ATP來(lái)轉(zhuǎn)移質(zhì)子的多亞基蛋白質(zhì)大分子。以酵母為例，這種酶由兩大結(jié)構(gòu)功能部分共14種亞基組成。一部分是水溶性的 V1,由8種亞基組成，主要功能是水解ATP。另一部分是嵌于膜中的Vtl，由6種亞基組成，主 要功能是轉(zhuǎn)移質(zhì)子。這兩大部分之間形成一種柄狀結(jié)構(gòu)從而使得這兩部分從功能和結(jié)構(gòu)上 成為一個(gè)整體(Biochim Biophys Acta 2008，1777 (7-8) :599-604)。目前研究發(fā)現(xiàn)生物體調(diào)節(jié)V-ATP酶活性的方式主要有三種，其中一種是V-ATP酶 V1和Vtl部分的可逆分解是調(diào)控自身酶活性的有效方式。這一調(diào)控方式可在能量較低的情 況下為胞內(nèi)的基礎(chǔ)代謝保留ATP，是一種由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(葡萄糖)快耗盡時(shí)而產(chǎn)生的一種自 我保護(hù)機(jī)制(Mol Cell Biol 1998,18(12) :7064-7074)。在用高壓二氧化碳?xì)缡称凤嬃?中酵母細(xì)胞的加工過(guò)程中，V-ATP酶對(duì)于維持酵母細(xì)胞的高壓二氧化碳耐受性起到了關(guān)鍵 作用(Int J FoodMicrobiol. 2005，105 :131-137)。RAVE(regulator of the H+-ATPase of vacuolar and endosomal membranes) 包含Skplp、Ravlp和Rav2p三個(gè)亞基，在V-ATP酶的上述活性調(diào)節(jié)方式中起很重要的作用 (Nat Cell Biol. 2001,3(4) :384-391.)。研究發(fā)現(xiàn) RAVE 通過(guò)與 V-ATP 酶 V1 部分的 E 亞基 和 G 亞基作用從而調(diào)節(jié) V-ATP 酶的活性(J Biol Chem 2002,277(16) 13831-13839)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種釀酒酵母Rav2p亞基的基因克隆與表達(dá)的方法。針對(duì)釀 酒酵母中RAVE復(fù)合物的Rav2p亞基的基因(縮寫(xiě)為rav2)設(shè)計(jì)了引物1 5，CGCCATATGAGT GTTGATTTGTTTCC-3，(Nde I)和引物 2 5’ -GAGCGGCCGCCTTATATGTACTTAAC-3’ (Not I)，建立 了釀酒酵母中Rav2p基因克隆的方法、Rav2p基因原核表達(dá)載體構(gòu)建的方法及Rav2p在大 腸桿菌中表達(dá)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案從NCBI上查找釀酒酵母中rav2的基因序列，利用DNAman等 軟件設(shè)計(jì)合適的引物克隆出rav2的基因序列。將PCR產(chǎn)物與T載體相連測(cè)序以驗(yàn)證克隆 序列的正確性。雙酶切PCR產(chǎn)物然后與經(jīng)同樣雙酶切的pET-21c相連。選擇正確的重組子 并將其轉(zhuǎn)入BL21(DE3)實(shí)現(xiàn)rav2的異源表達(dá)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明人的方法，采用菌落PCR的方法以釀酒酵母BY4742 的基因組DNA為模板克隆出rav2的全基因序列，并在基因兩端加入Not I和Nde I限 制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，與經(jīng)同樣內(nèi)切酶消化的pET-21c表達(dá)質(zhì)粒相連并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。
3
利用本發(fā)明人構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)?？梢詫?shí)現(xiàn)Rav2p在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的基因刪 除，方便構(gòu)建高壓二氧化碳低耐受性的酵母菌株，為食品飲料行業(yè)提供新型發(fā)酵菌株。
四

圖 1.質(zhì)粒 PET-21C圖2.重組質(zhì)粒pETR2圖3. Rav2p的誘導(dǎo)表達(dá)。M為Market，1為對(duì)照，2為ImM的IPTG誘導(dǎo)3h的全細(xì) 胞裂解物。圖4. SEQ ID NO :1，釀酒酵母中RAVE復(fù)合物的Rav2p亞基基因(縮寫(xiě)為rav2)的 核苷酸序列圖5. SEQ ID NO :2，Rav2p 的氨基酸序列
五具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 釀酒酵母中Rav2p基因克隆的方法將釀酒酵母BY4742接種于YEPD培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)M小時(shí)左右待平板上長(zhǎng) 出菌落時(shí)放4°C冰箱保存待用。從NCBI網(wǎng)站上查找rav2基因序列(如SEQ ID NO 1所示)，并設(shè)計(jì)引物引物 1. 5，CGCCATATGAGTGTTGATTTGTTTCC-3，(Nde I)引物 2. 5，-GAGCGGCCGCCTTATATGTACTTAAC-3，(Not I)
權(quán)利要求
1.一種釀酒酵母中Rav2p的基因的克隆方法。其特征是(1)針對(duì)釀酒酵母中RAVE復(fù)合物的中Rav2p亞基的基因，設(shè)計(jì)了引物1:5，CGCCATATG AGTGTTGATTTGTTTCC-3，(Nde I)和引物 2 :5’ -GAGCGGCCGCCTTATATGTACTTAAC-3，(Not I)；(2)直接以釀酒酵母BY4742(該菌種在國(guó)內(nèi)外已廣泛用于科研，且已有文獻(xiàn)報(bào)道)菌落 作為PCR反應(yīng)模板。具體操作方法見(jiàn)實(shí)施例1。
2.如權(quán)利要求1所述Rav2p基因的重組原核質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建的方法(具體見(jiàn)實(shí)施例2)。
3.一種釀酒酵母Rav2p在大腸桿菌中表達(dá)的方法(具體操作見(jiàn)實(shí)施例幻，其特征是以 權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒為表達(dá)載體，以大腸桿菌BL21(DE3)(該菌種在國(guó)內(nèi)外已廣泛用于科 研，且已有文獻(xiàn)報(bào)道)為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)Rav2p的高效表達(dá)。
全文摘要
一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Rav2p基因克隆與表達(dá)的方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明設(shè)計(jì)了引物15’CGCCATATGAGTGTTGATTTGTTTCC-3’(Nde I)和引物25’-GAGCGGCCGCCTTATATGTACTTAAC-3’(Not I)，建立了釀酒酵母中Rav2p基因克隆的方法，建立了Rav2p基因原核表達(dá)載體構(gòu)建的方法，建立了Rav2p在大腸桿菌中高效表達(dá)的方法。Rav2p為釀酒酵母中RAVE復(fù)合物的重要組成部分，利用本發(fā)明人構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)?？梢詫?shí)現(xiàn)Rav2p在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的基因刪除，方便構(gòu)建高壓二氧化碳低耐受性的酵母菌株，為食品飲料行業(yè)提供新型發(fā)酵菌株。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102071188SQ20101029788
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者張光明, 張峰, 張震宇 申請(qǐng)人:江南大學(xué)