Btrc基因的過(guò)表達(dá)試劑及其制備和應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及BTRC基因的過(guò)表達(dá)試劑及其制備和 應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼻咽癌（化so地aryngealCarcinoma,NPC)是我國(guó)南方地區(qū)常見的頭頸部惡性腫 瘤，由鼻咽粘膜上皮發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而來(lái)，大多數(shù)為低分化鱗狀細(xì)胞癌，惡性程度高且發(fā)病部 位隱蔽，特別是發(fā)生在咽隱窩和鼻咽頂部的患者早期癥狀不明顯，因而難W早期發(fā)現(xiàn)，誤診 誤治率較高；另外鼻咽癌極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，初診患者頸部淋己結(jié)轉(zhuǎn)移率高達(dá)80%。放射治療 是目前鼻咽癌臨床上最常用的治療手段，60~70 %的患者能取得較好的療效，但仍有20~ 30%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是臨床上導(dǎo)致鼻咽癌患者死亡的主要因素之 一，且放化療對(duì)治療鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移效果不理想，因此，篩選新的鼻咽癌早期轉(zhuǎn)移及預(yù) 后判斷的分子標(biāo)記物，對(duì)于鼻咽癌的臨床治療有著重要的指導(dǎo)意義，同時(shí)相比較傳統(tǒng)的放 化療手段，生物治療的方法更適合復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移鼻咽癌的治療，其中基因療法對(duì)防治鼻咽癌 的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有更重要而廣闊的臨床應(yīng)用前景，篩選鼻咽癌基因治療的祀點(diǎn)也同樣意義 重大。
[0003] 我們通過(guò)基因忍片技術(shù)，篩選到了BTRC基因（GenebankGeneID:8945 ;參考序列： NM033637. 3)在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)。迄今為止有關(guān)BTRC與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用的關(guān) 系及其在鼻咽癌病人的早期篩查、輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)等方面均沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。我們通 過(guò)研究表明，BTRC在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，鼻咽 癌組織中BTRC基因表達(dá)水平較低的患者更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因而生存時(shí)間較BTRC基因表 達(dá)水平高的患者更短。表明BTRC基因可W作為鼻咽癌輔助診斷、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷等的 分子標(biāo)記，針對(duì)BTRC設(shè)計(jì)專用巧光實(shí)時(shí)定量PCR引物、原位雜交探針及免疫組織化學(xué)檢測(cè) 試劑盒等，用于檢測(cè)鼻咽癌組織中BTRC的表達(dá)水平有望為臨床上對(duì)鼻咽癌進(jìn)行復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn) 移的預(yù)測(cè)提供參考。
[0004] 此外，我們?cè)诒茄拾┘?xì)胞中轉(zhuǎn)染人工合成的BTRC基因干擾序列（siRNA)W抑制 BTRC基因的表達(dá)，證實(shí)在鼻咽癌細(xì)胞株中下調(diào)BTRC基因的表達(dá)可W促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的 侵襲轉(zhuǎn)移；通過(guò)設(shè)計(jì)并構(gòu)建BTRC基因的過(guò)表達(dá)載體，成功地在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)BTRC基 因，可W有效地抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力；通過(guò)一系列研究，申請(qǐng)人進(jìn)一步證實(shí) 了BTRC基因編碼一個(gè)名為P-TrCP化eta-transducinrepeatcontainingE3ubiquitin proteinligase)的E3 泛素蛋白連接酶巧3ubiquitinproteinligase)，P-TrCP是細(xì) 胞內(nèi)蛋白經(jīng)泛素化途徑降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，可較特異地調(diào)控它的底物P-catenin 和Snail經(jīng)泛素化途徑降解，從而維持P-catenin和Snail運(yùn)兩個(gè)蛋白在細(xì)胞中的含量。 P-catenin、Snail是細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymaltransition,EMT) 過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換又是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的最為關(guān)鍵的第一 步。因此，申請(qǐng)人通過(guò)研究證實(shí)了鼻咽癌細(xì)胞中BTRC表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其編碼的P-TrCP蛋 白量減少，P-TrCP的底物P-catenin和Snail的降解減慢，造成P-catenin和Snail在 細(xì)胞內(nèi)聚集，推動(dòng)了鼻咽癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，使鼻咽癌細(xì)胞具備更強(qiáng)的侵襲與轉(zhuǎn)移 能力，從而表現(xiàn)為鼻咽癌患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致患者死亡。在鼻咽癌細(xì)胞中通過(guò)基因工 程的手段重新表達(dá)BTCR，則可W明顯地抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。因此，BTRC基 因W及其下游包括P-catenin和Snail在內(nèi)的細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)信號(hào)通路又可W 成為鼻咽癌基因治療的潛在祀點(diǎn)，特別是BTRC過(guò)表達(dá)載體在鼻咽癌的基因治療中具有重 要的應(yīng)用前景。將BTRC基因過(guò)表達(dá)載體負(fù)載到多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒上制成納米 基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，多聚賴氨酸修飾的娃納米顆?？杀Ｗo(hù)BTRC基因過(guò)表達(dá)載體免受核酸酶降解， 延長(zhǎng)作用時(shí)間，且有更高的轉(zhuǎn)染效率。進(jìn)而為制備防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的制劑提供新 的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明的目的之一是提供BTRC基因的過(guò)表達(dá)試劑。
[0006] 本發(fā)明的目的之二是提供BTRC基因的過(guò)表達(dá)試劑的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之S是提供BTRC基因的過(guò)表達(dá)試劑的應(yīng)用方法。 陽(yáng)00引 BTRC基因的過(guò)表達(dá)試劑的制備方法，制備能夠表達(dá)BTRC基因的表達(dá)載體。選擇 PCDNA3. 1空白載體構(gòu)建BTRC的過(guò)表達(dá)載體，酶切PCDNA3. 1載體并將BTRC序列插入，得到 用于真核表達(dá)BTRC的載體質(zhì)粒。
[0009] 構(gòu)建PCDNA3. 1 - BTRC真核載體步驟如下：
[0010] 1)W鼻咽癌細(xì)胞H肥2的cDNA為模板，利用TaKaRaLATaq愈酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增 SEQN0 :1所示的全長(zhǎng)BTRC編碼區(qū)序列，BTRC編碼區(qū)序列擴(kuò)增引物如下：
[0011] 上游引物：5 ' -ATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3 '
[0012] 下游引物：5, -TTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3'
[001引在上、下游引物的5'端分別加上限制性內(nèi)切酶化eI和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù) 堿基后，引物序列如下：
[0014] 上游：5'-AGGAGCTAGCATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3' ' 下劃線部分為Mie I識(shí)別位點(diǎn)，
[0015]下游：5' -ATGCGAATTCTTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3'，下劃線部分為EcoRI識(shí) 別位點(diǎn)；
[0016] 2)PCR擴(kuò)增，BTRC編碼區(qū)序列，PCR反應(yīng)條件如下：
[0017] TaKaRaLAT'aq及轉(zhuǎn) lj4 說(shuō)P放上鑛弓I物 0.4軸 lOjim下游引物 0.4叫 cDNA巧板 2.0ul dHaO 巧.2抖1 5x PC民反應(yīng)緩沖液 4.14 Total 雜jil
[0018] PCR反應(yīng)步驟
[0019] :斜巧 5min % '.C 10 sec 62'C 撕洗c 72巧彿s斌
[0020] 返回到第2步，共進(jìn)行39次反應(yīng)循環(huán)； 陽(yáng)02U 如將PCR產(chǎn)物電泳、膠回收目的片段后經(jīng)化eI和EcoRI雙酶切后電泳，再次膠 回收； 陽(yáng)02引 4) PCDNA3. 1質(zhì)粒經(jīng)化e I和EcoR I雙酶切后電泳膠回收目的片段；
[0023] 5) W T4DNA連接酶連接4)和5)步膠回收產(chǎn)物，即可得到可用于真核表達(dá)BTRC的 載體質(zhì)粒。
[0024] 將上述方法制備得到的包含BTRC編碼區(qū)序列的PCDNA3. 1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受 態(tài)大腸桿菌，W擴(kuò)增質(zhì)粒。
[00巧]還能將表達(dá)載體負(fù)載到多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒上制成納米球。
[00%] 多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒是運(yùn)用0P-10、環(huán)己燒、氨水的微乳液自組裝技術(shù)進(jìn) 行娃納米顆粒的合成，并利用娃納米顆粒的表面能和離子靜電作用進(jìn)行多聚賴氨酸表面修 飾，制備得到。
[0027] BTRC基因的過(guò)表達(dá)試劑，是由上述的方法制備得到的。
[0028] 所述的BTRC基因的過(guò)表達(dá)試劑的應(yīng)用方法，用于制備防止鼻咽癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的 制劑。
[0029] 所述的BTRC基因的過(guò)表達(dá)試劑的應(yīng)用方法，用于制備BTRC基因表達(dá)產(chǎn)物P-TrCP 的底物P-catenin和Snail的降解的制劑。具體是用于制備抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換制劑。該 制劑促進(jìn)BTRC基因的表達(dá)能使上皮細(xì)胞的標(biāo)志物Z0-1、E-ca化erin和Claudin-1的表達(dá) 升高，而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物ZEB1、N-ca化erin、Vimentin及Slug的表達(dá)降低。
[0030] 本發(fā)明證實(shí)在鼻咽癌細(xì)胞株中下調(diào)BTRC基因的表達(dá)可W促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲 轉(zhuǎn)移；通過(guò)設(shè)計(jì)并構(gòu)建BTRC基因的過(guò)表達(dá)載體，成功地在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)BTRC基因，可 W有效地抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。進(jìn)而為制備防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的制劑 提供新的途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為利用基因忍片技術(shù)從6例正常鼻咽上皮組織和10例鼻咽癌組織中篩選得 到的差異表達(dá)基因圖譜；
[0032] 共篩選得到差異表達(dá)基因2461個(gè)，其中在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)的基因與1677個(gè)，在 鼻咽癌中下調(diào)的基因有784個(gè)；N代表正常鼻咽上皮組織，T代表鼻咽癌組織。
[0033] 圖2為基因忍片數(shù)據(jù)中BTRC基因在正常鼻咽上皮組織和鼻咽癌組織中的表達(dá)情 況，BTRC基因在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)（P= 0. 001);
[0034] N代表正常鼻咽上皮組織，T代表鼻咽癌組織。
[0035] 圖3為利用巧光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證了BTRC基因在正常鼻咽上皮組織和鼻咽 癌組織中的表達(dá)情況，BTRC基因在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)（P<0. 05); W36] N代表正常鼻咽上皮組織（共9例），T代表鼻咽癌組織（共28例）。
[0037] 圖4為免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達(dá)情況；
[0038]正常鼻咽上皮（Non-tumorNPE；)中BTRC表達(dá)水平較高（positive)，而在106例鼻 咽癌（NPC)中有48例檢測(cè)到BRTC的低表達(dá)化OW)，其余58例為高表達(dá)Oii曲）。
[0039] 圖5為原位雜交檢測(cè)BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達(dá)情況；
[0040] 原位雜交的結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果具有很高的一致性。
[0041] 圖6為鼻咽癌中BTRC的表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系；
[0042] 鼻咽癌中BTRC的表達(dá)與鼻咽癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，BTRC高表達(dá)（化曲）的患 者不論無(wú)病生存時(shí)間值isease化eesurvival,DFS，左）還是總的生存時(shí)間（Overall survival,0S，右）都要明顯長(zhǎng)于BTRC低表達(dá)(X〇w)的患者。
[0043] 圖7為在鼻咽癌細(xì)胞H肥2、5-8F和C666-1中導(dǎo)入BTRC過(guò)表達(dá)載體度TRC0巧和 RNA干擾序列（siBTRC)后，實(shí)時(shí)巧光定量PCR方法檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞中BTRC的表達(dá)情況 (mRNA水平），導(dǎo)入BTRC過(guò)表達(dá)載體后，BTRC基因的表達(dá)顯著升高（左），而導(dǎo)入RNA干擾 序列后，BTRC基因的表達(dá)顯著降低（右），NC為陰性對(duì)照（negativecontrol)。
[0044] 圖8為在鼻咽癌細(xì)胞H肥2、5-8F和C666-1中導(dǎo)入BTRC過(guò)表達(dá)載體度TRC0巧和 RNA干擾序列（siBTRC)后，Westernbloting方法檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞中BTRC的表達(dá)情況 (蛋白水平），導(dǎo)入BTRC過(guò)表達(dá)載體后BTRC基因的表達(dá)顯著升高（左）