本發(fā)明涉及抗腫瘤化合物及其制備方法與用途，具體而言，該抗腫瘤化合物為嘧啶類化合物，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,ptks)通過控制細胞的信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡等一系列生理生化過程。受體型酪氨酸激酶是一類橫跨細胞膜相對較大的激酶，其具有配體結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和起激酶作用—在磷酸化特定酪氨酸殘基并且由此影響細胞增殖的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一般人類癌癥中(如肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤)已發(fā)現(xiàn)所述激酶的異常表達。蛋白酪氨酸激酶已成為抗腫瘤藥物研究開發(fā)的重要靶點之一。表皮生長因子受體酪氨酸激酶(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinase，egfr)是最早發(fā)現(xiàn)的蛋白酪氨酸激酶之一，egfr的胞內(nèi)區(qū)有atp結(jié)合位點，egfr抑制劑可以競爭性與atp結(jié)合位點相結(jié)合，從而抑制egfr的磷酸化過程，阻斷下游信號的傳導(dǎo)，進而抑制腫瘤細胞的生長、分化和轉(zhuǎn)移(yun,etal.cancercell2007,11,217-227)。egfr作為抗腫瘤靶點的生化過程已被闡明，其晶體結(jié)構(gòu)和活性部位也已比較清楚，以此為靶點的藥物吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)等已經(jīng)應(yīng)用于臨床，且隨著egfr結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系的深入研究，許多效果更佳優(yōu)秀的egfr抑制劑(ep0566226、wo9961428、wo0051587、wo0375947、wo0132651、wo9633980、wo9630347、us7709479、us6716847、us6593333、us6251912、cn201080060451.4、cn201110191525.4等)已被發(fā)現(xiàn)。然而這些藥物不可避免地存在著抗耐藥性差的問題。研究表明：790位點的蘇氨酸到790位點的甲硫氨酸的突變(t790m)是此類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要誘因。有臨床案例數(shù)據(jù)顯示，大約有60％的患者獲得性耐藥都源于t790m位點的突變所致。因此開發(fā)抗耐藥性更強、毒性更小、活性更強的新型egfr抑制劑具有非常重要現(xiàn)實價值。azd9291(osimertinib)是口服不可逆的，t790m突變選擇性egfr抑制劑，在lovo細胞中對外顯子19位缺失的egfrl858r/t790m和egfrwt的ic50分別為11.44和493.8nm，于2015年12被美國fda批準上市(wo2013014448)用于治療egfrt790m耐藥型肺癌。co-1686(rociletinib,avl-301)是另一種不可逆的，突變選擇性egfrt790m抑制劑，在無細胞試驗中作用于egfrt790m和egfrwt的ic50分別為21.5nm和303.3nm，目前處于臨床iii期研究研究(wo2012061299)。其它如hm61713，egf816，pf-06747775，avitinib，asp8273也是進入臨床研究的新型egfr抑制劑(maetal.,j.med.chem.,2016，doi:10.1021/acs.jmedchem.5b00840.)，涉及的專利如：us20120157426、us8563568b2、cn102740847、cn102083800。黏著斑激酶(focaladhesionkinase，fak)是一種細胞內(nèi)的非受體酪氨酸激酶，fak是細胞內(nèi)一種非受體酪氨酸激酶，參與胞內(nèi)多條信號通路的傳導(dǎo)。fak在多種類型的腫瘤細胞中都出現(xiàn)表達量和活性上調(diào)現(xiàn)象，通過激酶依賴和非激酶依賴機制參與腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、生長和抗凋亡等多個過程，是目前研究較多的抗腫瘤靶點之一。鑒于治療癌癥的迫切需要，本領(lǐng)域有必要開發(fā)新型作用機制、且效果更佳良好的抗腫瘤藥物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一個抗腫瘤化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該抗腫瘤化合物具體為含嗎啡啉的嘧啶類化合物，該類化合物具有良好的抗腫瘤活性。本發(fā)明的另一目的在于提供前述抗腫瘤化合物的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供含所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。本發(fā)明的再一目的在于提供所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或所述組合物的用途。為此，一方面，本發(fā)明提供一種抗腫瘤化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該抗腫瘤化合物具有式(i)所示的結(jié)構(gòu)：式(i)所示結(jié)構(gòu)化合物為含嗎啡啉的嘧啶類化合物，命名為dm3001，本發(fā)明抗腫瘤活性篩選顯示，該化合物具有強的抑制非小細胞肺癌(nsclc)細胞增殖能力，顯示出比rociletinib更加優(yōu)良的抗egfrt790m活性，且能夠作用于fak激酶。作為一類結(jié)構(gòu)新穎的分子，本發(fā)明中研究化合物具有開發(fā)成新型高效egfr和fak雙靶點抑制劑的潛力，對治療相關(guān)的腫瘤疾病尤其是非小細胞肺癌、小細胞肺癌有較大的應(yīng)用價值。前述式(i)所示的結(jié)構(gòu)具有如下名稱：(i)n-[1-[[5-氯-2-[[4-[(4-嗎啡啉基)甲基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺。另一方面，本發(fā)明提供前述抗腫瘤化合物的制備方法，該抗腫瘤化合物按如下路線制備：本發(fā)明所述化合物由于它們在藥物中的可能用途，式(i)所示化合物的鹽優(yōu)選藥物可接受的鹽。本發(fā)明的化合物為堿，其中所需鹽形式可以通過本領(lǐng)域已知的合適方法制備，包括用無機酸處理游離堿，所述無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有機酸處理游離堿、所述有機酸例如乙酸、三氟乙酸、馬來酸、琥珀酸、扁桃酸、富馬酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羥基乙酸、水楊酸、吡喃糖苷酸(pyranosidylacid)，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羥基酸，例如檸檬酸或酒石酸，氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。藥學(xué)上可接受的鹽的實施例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙酸鹽(propiolates)、草酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯基乙酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽(phenylbutrates)、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、羥基乙酸鹽、酒石酸鹽、苦杏仁酸鹽和磺酸鹽、例如二甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽和萘-2-磺酸鹽。另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其含有有效劑量的本發(fā)明所述式(i)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，及藥用載體。本發(fā)明的藥物組合物通常含有一種本發(fā)明化合物。然而，在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有超過一種本發(fā)明的化合物。另外，本發(fā)明的藥物組合物還可任選包括一種或多種其它藥學(xué)活性化合物。本發(fā)明所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的載體具有良好的抑制egfr表皮因子受體酪氨酸激酶的活性，因此，本發(fā)明還提供所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的載體，或所述藥物組合物在制備egfr表皮因子受體酪氨酸激酶抑制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的載體具有良好的抑制fak黏著斑激酶的活性，因此，本發(fā)明還提供所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的載體，或所述藥物組合物在制備fak黏著斑激酶抑制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述式(i)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或本發(fā)明所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述腫瘤選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌，進一步優(yōu)選非小細胞肺癌。更優(yōu)選地，所述用途主要通過抑制egfr表皮因子受體蛋白酪氨酸激酶和fak黏著斑激酶實現(xiàn)的。附圖說明圖1為不同處理組h1975，a431細胞dapi染色情況。圖2為不同處理組h1975、a431細胞ao/eb染色情況。圖3為不同處理組h1975、a431細胞劃痕和細胞遷移實驗結(jié)果。圖4為dm3001在h1975(a)和a431(b)兩種細胞中對egfr下游相關(guān)信號蛋白表達的情況。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例進一步描述解釋本發(fā)明，但這些實施例并非意味著限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照原料或商品制造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規(guī)試劑。實施例1目標分子的制備薄層層析硅膠板使用煙臺黃海gf254或青島gf254硅膠板，薄層色譜法(tlc)使用的硅胺板采用的規(guī)格是0.15mm-0.2mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm-0.5mm。本發(fā)明使用的原料主要購自可購買自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化學(xué)試劑有限公司、達瑞化學(xué)品等公司。實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。實施例中無特殊說明，反應(yīng)的溫度為室溫，為20℃-30℃。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：化合物(i)的合成路線.試劑及條件:(a)對硝基苯氨,dipea,1,4-二氧六環(huán),rt,2h,91％；b)4-嗎啡啉基甲基苯胺,dipea,1,4-二氧六環(huán),60℃,2h,49–72％；(c)fe-nh4cl,meoh-h2o,80℃至rt,62–85％；(d)丙烯酰氯,nahco3,丙酮,10min,43–68％。i-b的合成取i-a(23.44mmol)和dipea(4.5g,35.16mmol)于50ml二氧六環(huán)中，慢慢加入4-硝基苯胺(3.8g,23.44mmol)，升溫60℃，反應(yīng)5小時后，反應(yīng)完畢，冷卻，加入400ml水，析出黃白色固體，抽濾，烘干，得黃白色固體，未純化直接下一步反應(yīng)。i-c的合成取i-b(23.44mmol)和三氟乙酸(4.5g,35.16mmol)于2-buoh(50ml)中，慢慢加入4-嗎啡啉基甲基苯胺(23.44mmol)，升溫100℃，反應(yīng)8小時后，反應(yīng)完畢，冷卻，倒入飽和碳酸氫鈉溶液中，析出固體，抽濾，水洗，烘干硅膠柱層析分離，得淺褐色固體。i-d的合成取i-c(1.9g,6.8mmol)和氯化銨(0.73g,13.6mmol)于反應(yīng)瓶，加入meoh(15ml)和水(15ml)，攪拌下加入鐵粉(1.5g,27.2mmol)，升溫60℃反應(yīng)2小時，趁熱抽濾，水相用乙酸乙酯萃取(100ml×3)，合并乙酸乙酯層，飽和食鹽水洗一次，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得黃色半固體i-d。目標物(i)的合成取i-d(2.1g,9.7mmol)溶于20ml乙腈中，加入碳酸氫鈉(1.6g,19.4mmol)，和甲基哌嗪(1.2g,11.64mmol)，升溫60℃反應(yīng)5小時，反應(yīng)完畢后抽干溶劑，加水200ml，未析出固體，水相用乙酸乙酯萃取(100mlx3)，合并乙酸乙酯層，飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得目標分子(i)。根據(jù)以上方法合成了目標分子，所合成目標分子的理化數(shù)據(jù)如下：(i)n-[1-[[5-氯-2-[[4-[(4-嗎啡啉基)甲基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺產(chǎn)率40.8％；黃白色固體。1hnmr(dmso-d6):δ10.20(s,1h),9.32(s,1h),8.96(s,1h),8.15(s,1h),7.91(s,1h),7.56(d,j＝8.4hz,3h),7.31(d,j＝6.0hz,2h),7.04(d,j＝8.4hz,2h),6.48(dd,j＝17.2,10.4hz,1h),6.27(dd,j＝16.8,2.0hz,1h),5.76(dd,j＝10.0,2.0hz,1h),3.55(br,4h),3.32(s,2h),2.29(s,4h).13cnmr(dmso-d6)δ163.6,158.2,156.7,155.3,139.8,139.7,139.6,139.3,132.4,130.6,129.4(2c),129.0,127.3,119.8,119.3(2c),115.8,104.2,66.7(2c),62.6,53.6(2c).hrms(esi)forc24h25cln6o2,[m+h]+理論計算:465.1800,實測:465.1808。目標分子成鹽的方法無機酸鹽的制備方法：取目標分子(1mmol)溶于10ml無水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加無機酸(1mmol)的5ml無水甲醇溶液，滴加完畢，于此溫度下攪拌30分鐘，然后常溫蒸除甲醇，即得目標分子的無機酸鹽。通過該方法制備了化合物i的鹽酸鹽(i-1)、氫溴酸鹽(i-2)、硫酸鹽(i-3)及磷酸鹽(i-4)；有機酸鹽的制備方法：取目標分子(1mmol)溶于10ml無水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加有機酸(1mmol)的5ml干燥乙醚，滴加完畢，于此溫度下攪拌30分鐘，然后常溫蒸除溶劑，即得目標分子的有機酸鹽。通過該方法制備了化合物i的馬來酸鹽(i-5)、琥珀酸鹽(i-6)及富馬酸鹽(i-7)。實施例2目標分子生物活性評價1、體外對受體酪氨酸激酶抑制活性測試方法制備激酶檢測緩沖液①在室溫融解激酶檢測緩沖液(kinasedetectionbuffer)，觀察是否有沉淀。②如果出現(xiàn)沉淀，就在37℃孵育激酶檢測緩沖液(kinasedetectionbuffer)15分鐘并經(jīng)常搖動，溶解沉淀。或者，小心吸走上清，去除沉淀。制備激酶檢測試劑①使用前在室溫平衡激酶檢測緩沖液(kinasedetectionbuffe)和激酶檢測底物(kinasedetectionsubstrate)。②將激酶檢測緩沖液(kinasedetectionbuffer)全部倒進裝有激酶檢測底物(kinasedetectionsubstrate)的棕色瓶中，使凍干粉底物溶解，這樣就制成了激酶檢測試劑。③輕輕震蕩、渦旋或顛倒混勻，成為均質(zhì)溶液，底物應(yīng)在1分鐘內(nèi)溶解。④激酶檢測試劑配好后應(yīng)立即使用，或分裝存于-20℃，配好的試劑經(jīng)過幾次凍融后循環(huán)信號活性都沒有損失。制作atp轉(zhuǎn)化成adp的標準曲線①用1×激酶反應(yīng)緩沖液(kinasereactionbuffer)稀釋試劑盒提供的ultrapureatp和adp，制成900μl50μmatp和500μl50μmadp。②將上一步配好的50μmatp和50μmadp溶液按表1所示在384孔板a1-a12中混合，模擬每個轉(zhuǎn)化百分比的atp和adp的濃度，混合好。表1.制備50μm系列atp+adp標準品③每孔加入5μl的adp-glotm試劑來終止激酶反應(yīng)。在室溫孵育40分鐘。④每孔加入10μl激酶檢測試劑(kinasedetectionreagent)將adp轉(zhuǎn)化成atp，并引進螢光素酶和螢光素來檢測atp。⑤在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標儀測量螢光并記錄螢光值。⑥繪制atp轉(zhuǎn)化成adp的標準曲線。確定激酶抑制物的ic50值①按照promega試劑盒說明書配制1×激酶反應(yīng)緩沖液(kinasereactionbuffer)，2.5×50ng/μl激酶和2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。②在無酶對照孔中加入3μl1×激酶反應(yīng)緩沖液(kinasereactionbuffer)，2μl2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。在陰性對照孔中加入1μl1×激酶反應(yīng)緩沖液(kinasereactionbuffer)，2μl2.5×50ng/μl激酶，2μl2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。在測試孔中加入1μl5×待測藥物，2μl2.5×50ng/μl激酶，2μl2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。③混合好平板，孵育60分鐘。④每孔加入5μl的adp-glotm試劑來終止激酶反應(yīng)。在室溫孵育40分鐘。⑤每孔加入10μl激酶檢測試劑(kinasedetectionreagent)將adp轉(zhuǎn)化成atp，并引進螢光素酶和螢光素來檢測atp。在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標儀測量螢光并記錄螢光值。⑥結(jié)果分析，結(jié)果是表2所示。2、細胞生長實驗(mtt檢測法)細胞接種：收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度,以每孔7x103個細胞,每孔體積100μl接種到96孔板，每組設(shè)4個復(fù)孔(邊緣孔用無菌pbs填充)；細胞培養(yǎng)：細胞貼壁后，0％fbsrpmi-1640饑餓8h,對照組用10％fbsrpmi-1640培養(yǎng),，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(按實驗要求分別培養(yǎng)不同時間)；呈色：三組細胞分別于培養(yǎng)72h后加入10μlmtt溶液(5mg/ml)，4h后終止培養(yǎng)，每孔加入100μl三聯(lián)液，于搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解；比色：在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光度值(od值)，選擇570nm波長，以無細胞的即rpml-1640培養(yǎng)液空白孔調(diào)零，測各孔的吸光度值。實驗重復(fù)三次記錄結(jié)果：細胞生長抑制率＝(對照組吸光度值一實驗組吸光度值)/對照組吸光度值×100％，細胞增殖率＝(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100；繪制細胞生長曲線：以時間為橫坐標，抑制率/增殖率為縱坐標繪制細胞生長曲線。在graphpad軟件中的graphpadprism作圖軟件中針對抑制劑濃度做圖，以便由log[抑制劑]相對于反應(yīng)，可變斜率模型估算出ic50。測試結(jié)果如表3所示，表2及表3顯示所獲得的化合物抗腫瘤細胞增殖中的活性效果a。表2表3a:h1975為egfrt790m突變細胞株，a431egfrwt細胞，hcc827為egfrdele746_a750突變細胞株，hbe為人正常支氣管上皮細胞.b:ic50：半數(shù)有效抑制濃度.3、細胞染色實驗3.1實驗材料和試劑h1975細胞，a431細胞，rapi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基(hyclone公司，cat:sh30022.01b)，fbs胎牛血清(gibco公司，cat:16400-044)，雙抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospeccat:sv30010)，低速離心機(上海貝恩生物科技有限公司，cat:tdz4b-ws)，co2培養(yǎng)箱(上海博訊，cat:bc-j160s)，超凈工作臺(上海博訊型號sw-cj-2fd)，倒置熒光電子顯微鏡(leicadmi3000b)，ao/eb雙染試劑盒，dapi試劑盒(碧云天)。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)：常規(guī)擴大培養(yǎng)a431、h1975細胞，取對數(shù)生長期的細胞以2x105cells/孔的密度接種于6孔板中；3.2.2藥物處理：于次日用不同濃度的藥物(抑制劑)處理貼壁良好的細胞48小時；具體藥物及使用濃度如下表4：表43.2.3dapi染色：棄去培養(yǎng)液，用pbs洗兩次，每孔以1ml4％多聚甲醛固定15min，棄去固定液后再用pbs洗一次；加入1μg/ml的dapi染色液1ml/孔，37℃孵育5min，pbs清洗后用倒置熒光顯微鏡進行觀察、拍照。結(jié)果如圖1所示。ao-eb染色3.2.4細胞培養(yǎng)：常規(guī)擴大培養(yǎng)a431、h1975細胞，取對數(shù)生長期的細胞以2x105cells/孔的密度接種于6孔板中；3.2.5藥物處理：于次日用不同濃度的藥物(抑制劑)處理貼壁良好的細胞48小時；具體藥物及使用濃度如下表5：表53.2.6ao-eb染色：棄去培養(yǎng)液，用pbs洗兩次，每孔以20μlao-eb溶液(1μg/mlao+1μg/mlebinpbs)染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞各期凋亡、死亡等變化，拍照，結(jié)果如圖2所示。4、細胞遷移實驗4.1實驗材料和試劑h1975細胞，a431細胞，rapi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基(hyclone公司，cat:sh30022.01b)，fbs胎牛血清(gibco公司，cat:16400-044)，雙抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospeccat:sv30010)，低速離心機(上海貝恩生物科技有限公司，cat:tdz4b-ws)，co2培養(yǎng)箱(上海博訊，cat:bc-j160s)，超凈工作臺(上海博訊型號sw-cj-2fd)，倒置熒光電子顯微鏡(leicadmi3000b)，直尺，記號筆，基質(zhì)膠(美國bd公司)，甲醇，結(jié)晶紫染液(中國武漢谷歌生物科技公司)4.2實驗方法4.2.1將腫瘤細胞以一定密度接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。4.2.2于單層培養(yǎng)細胞中進行劃痕實驗，用等滲pbs液洗去細胞碎片，再以不同濃度的抑制劑處理細胞48小時，具體藥物及使用濃度如下表6，之后用等滲pbs液洗去死亡細胞，顯微鏡下拍照，圖像分析，結(jié)果如圖3所示。表6transwell實驗檢測細胞的遷移能力4.2.3濾膜預(yù)處理：實驗前將濾膜用60μl的基質(zhì)膠(1：8稀釋)包被，再在小室頂部加入無血清培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱靜置0.5小時，進行再次水化處理；4.2.4細胞培養(yǎng)：a431、h1975細胞采用常規(guī)消化傳代方法，制成細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml；4.2.5于小室的上室加入200μl的上述細胞懸液，每孔細胞量為2×105個；4.2.6給予細胞藥物處理：以不同濃度的藥物(抑制劑)處理細胞24小時，具體藥物及使用濃度如下表7：表74.2.7在小室的下室(即24孔板底部)中加入600-800μl含10％胎牛血清的培養(yǎng)液；4.2.837℃培養(yǎng)箱加藥共孵育處理細胞24小時后，用鑷子小心取出小室，吸干上室液體，移到預(yù)先加有約800μl甲醇(4％多聚甲醛)的孔中，室溫固定10-30分鐘；4.2.9將小室移到預(yù)先加入約800μlgiemsa染液的孔中或2％結(jié)晶紫溶液中，室溫染色15-30分鐘；4.2.10用pbs清洗小室，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞；4.2.11徹底晾干小室后，倒置顯微鏡計數(shù)、拍照，結(jié)果如圖3所示。5、westernblotting5.1實驗材料和試劑h1975,a431細胞，rapi1640,dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基(hyclone公司，cat:sh30022.01b)，fbs胎牛血清(gibco公司，cat:16400-044)，雙抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospeccat:sv30010)，低速離心機(上海貝恩生物科技有限公司，cat:tdz4b-ws)，co2培養(yǎng)箱(上海博訊，cat:bc-j160s)，超凈工作臺(上海博訊型號sw-cj-2fd)egfr一抗(bioworldtechnology),p-egfr一抗(bioworldtechnology),akt(bioworldtechnology),p-akt一抗(bioworldtechnology),erk(bioworldtechnology),p-erk一抗(bioworldtechnology),β-actin(中國杭州華安生物),蛋白裂解液(中國上海碧云天生物技術(shù)公司),bca蛋白濃度測定試劑盒(中國上海碧云天生物技術(shù)公司),脫脂奶粉(中國伊利公司)，beyoeclplus(超敏ecl化學(xué)發(fā)光試劑盒)(中國上海碧云天生物技術(shù)公司)，sds-page蛋白上樣緩沖液(5x)(中國上海碧云天生物技術(shù)公司)，beyocolortm彩色預(yù)染蛋白分子量標準(中國上海碧云天生物技術(shù)公司)，phs-3c型精密ph計(常州市國立試驗設(shè)備研究所),純水機(美國millipore),制冰機(美國forma)，凝膠電泳儀、濕式轉(zhuǎn)膜儀和干燥系統(tǒng)(美國bio-rad)、凝膠成像系統(tǒng)(美國uvp公司),脫色搖床(中國北京卓信偉業(yè)科技有限公司),倒置顯微鏡(日本olympas)。5.2實驗方法5.2.1細胞總蛋白提取1、a431、h1975細胞擴大培養(yǎng)后，分別給予如下表8常規(guī)藥物處理，處理48小時：表82、48小時后pbs洗細胞兩次，加入150ul蛋白裂解液，渦旋儀上渦旋8-10次，冰上裂解35-40min；3、裂解完成后，于4℃下12000rpm離心15min；4、測定蛋白質(zhì)濃度：采用碧云天bradford蛋白濃度測定試劑盒；5、將離心后的上清加入上樣緩沖液，100℃5min，然后放于-80℃保存、備用。5.2.2細胞總蛋白定量(bradford法)1、制作標準曲線(1)從-20℃取出1mg/mlbsa，室溫融化后，備用。(2)取6個1.5ml離心管，分別標記為0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。(3)按下表9在各管中加入各種試劑。表9管別0μg2.5μg5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg1mg/mlbsa－2.5μl5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/lnacl100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl考馬斯亮藍溶液g2501ml1ml1ml1ml1ml1ml(4)混勻后，室溫放置2min。在96孔板中加入以上每組樣品，每孔200ul，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，于酶標儀595nm測定od值，制備標準曲線。2、檢測樣品蛋白含量(1)取足量的1.5ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。(2)取一管考馬斯亮藍加0.15mol/lnacl溶液100μl，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，同上法測定od值，實驗重復(fù)三次，取均值。(3)取一管考馬斯亮藍加95μl0.15mol/lnacl溶液和5μl待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，同上法測定od值，實驗重復(fù)三次，取均值。(4)根據(jù)標準曲線和樣本吸光度換算得到待測樣品蛋白質(zhì)濃度。5.2.3sds－page電泳測定完蛋白含量后，計算含100μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5×sds上樣緩沖液至終濃度為1×。(上樣總體積一般不超過15μl，加樣孔的最大限度可加20μl樣品。)上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性，然后置于冰上，備用。1、灌膠：在灌膠之前首先清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸取洗滌劑輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水反復(fù)沖洗干凈至不掛水，最后用蒸餾水沖洗干凈后站立晾干。(1)玻璃板對齊后放入制膠架中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。(操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。)(2)配制10％分離膠，加入temed后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml移液槍吸取5ml膠沿玻璃以一定速度放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后在膠面上加一層水，液封后的膠凝速度大大提高。(灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，以避免膠中出現(xiàn)氣泡。加水液封時速度要慢，否則分離膠會被沖散、變形。)(3)當水和膠之間出現(xiàn)折射線時，提示分離膠已凝。再等3min使膠充分凝固，傾去膠上層液封水，并用濾紙將水小心吸干，注意不要接觸膠面。(4)配制4％濃縮膠，加入temed后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免產(chǎn)生氣泡。插梳子時要盡量使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊垂直向上輕輕將其拔出。(5)用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。(小玻璃面向內(nèi)，大玻璃面向外。)2、加樣(1)向電泳槽中加入足夠的電泳緩沖液，準備上樣。(電泳液至少要浸沒內(nèi)側(cè)小玻璃上沿。)(2)取出預(yù)處理好的蛋白樣品，用微量進樣器貼壁吸取樣品，注意不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。3、電泳(1)插好電源，注意接頭電極方向(2)設(shè)置恒壓，60v(6v/cm)，當指示染料溴酚藍前沿進入分離膠后，時間約30min，將電壓提高到100－120v(15v/cm)，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約1cm，關(guān)閉電源，終止電泳。5.2.4轉(zhuǎn)膜1、準備工作(1)轉(zhuǎn)一張膜需準備6張7.0-8.3cm的濾紙和1張7.3-8.6cm的pvdf膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，避免手部蛋白污染膜。將切好的pvdf膜做好標記，置于水中浸泡2小時。(用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。(2)將轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻璃棒、濾紙和浸濕的膜放入加有轉(zhuǎn)移緩沖液的搪瓷盤里。(3)將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻璃棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。)在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先疊在一起在墊于墊子上)，一手固定濾紙一手用玻璃棒搟去其中的氣泡。2、取膠(1)于玻璃板兩個邊上輕輕將其撬開，小心取下玻璃板。將濃縮膠輕輕切去(濃縮膠影響操作)，避免把分離膠刮破，在分離膠的左上角切一個斜角作為標記。(2)將分離膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中進行平衡。3、轉(zhuǎn)膜(1)將平衡后的分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻璃棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠(膜蓋下后不可再移動)并除去氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。(轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗空間保持空氣流通。)(2)將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，可以在槽的一邊放置冰塊降溫(100v/100ma)。(3)轉(zhuǎn)膜完畢后將膜用1×麗春紅染液染色5min(于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可觀察膜上的蛋白。將膜晾干備用。5.2.5免疫反應(yīng)1、封閉(1)配制封閉液(5％脫脂牛奶intbst)(2)將膜用tbst從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上緩慢搖動，室溫封閉2小時。2、一抗結(jié)合(1)配制一抗稀釋液：5％bsaintbst，調(diào)整ph為7.4，以保證抗原抗體反應(yīng)于適宜的ph條件下進行)。(2)把膜從封閉液里取出，用tbst沖洗一遍后，浸沒于含一抗(如下表10)的雜交盒里，置于4℃搖床上緩慢搖動，孵育過夜。磷酸化抗體至少孵育12小時。其他抗體也可室溫孵育2-3h。表10一抗名稱來源稀釋倍數(shù)二抗egfr一抗bioworldtechnology1:3001:6000p-egfr一抗bioworldtechnology1:3001:6000aktbioworldtechnology1:3001:6000p-akt一抗bioworldtechnology1:3001:6000erk一抗bioworldtechnology1:3001:6000p-erkbioworldtechnology1:3001:60003、二抗結(jié)合(1)一抗孵育結(jié)束后，回收一抗，并于-20℃保存。將pvdf膜用tbst在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。(2)根據(jù)一抗的來源選擇相應(yīng)的二抗，將二抗用封閉液進行一定比例的稀釋(1:2000-1:5000)，室溫孵育1-2h。4、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影(1)二抗孵育結(jié)束后，可進行二抗的回收再利用，使用兩次后棄去。膜用tbst在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。(2)準備好曝光盒、顯色液及保鮮膜等。(3)將ecl-a和ecl-b兩種試劑在保鮮膜上進行等體積混合；1min后，將pvdf膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去除殘余液體，包裹好，放入x-光片夾中。(4)在暗室中，將1×顯影液和定影液分別倒入塑料盤中；在紅燈下取出x-光片，用切紙刀剪裁適當大小(比膜的長和寬均需大1cm)；打開x-光片夾，把x-光片放在膜上，一旦放上，便不能再移動，關(guān)閉x-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以取得最佳效果；曝光完成后，打開x-光片夾，取出x-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為1-2min(20-25℃)，溫度過低時(低于16℃)需適當延長顯影時間；顯影結(jié)束后，馬上將x-光片浸入定影液中，定影時間一般為5-10min，以膠片呈透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。(注意：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿取膠片的一角，手指甲不要劃傷膠片，否則將會對結(jié)果產(chǎn)生影響。)5、凝膠圖象分析：將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象分析軟件(quantityone)分析目標條帶的分子量和光密度值，所得結(jié)果如圖4所示。以上生物活性結(jié)果表明，本發(fā)明中dm3001的體內(nèi)外作用效果顯著，主要表現(xiàn)在以下幾個方面:(1)dm3001對突變型egfr激酶(egfrl858r/t790m)有強烈抑制作用，ic50僅僅為0.71nm，明顯優(yōu)于參比化合物rociletinib(21.5nm)和吉非替尼(823.3nm)而對于野生型egfr激酶(egfrwild-type)ic50值高達448.7nm。與rociletinib(si＝21.4)比較，dm3001的選擇性指數(shù)(si＝632)高出21倍，結(jié)果預(yù)示著化合物dm3001作用更專一，因此可能的毒副作用會更小，同時，該化合物對fak黏著斑激酶的抑制效果僅為1.71nm，預(yù)示著dm3001可作用于雙靶點發(fā)揮更好的抗腫瘤活性。(2)抗細胞增殖活性結(jié)果揭示，dm3001對于攜帶突變型egfrt790m的h1975細胞有強烈的抑制作用，ic50值僅為0.037μm，而對于攜帶野生型egfrwild-type的細胞株a431的抑制作用很弱，ic50值分別為0.382μm。明顯優(yōu)于參比藥物rociletinib、吉非替尼。對于攜帶敏感突變的hcc827(egfrdele746_a750)，dm3001及參比藥物都有很好的抑制作用。另外，dm3001對人正常支氣管上皮細胞hbe的抑制作用較弱，在其發(fā)揮抑制h1975細胞的有效濃度下，幾乎對正常細胞沒有影響，證明此類化合物的毒性更小。(3)ao/eb熒光雙染法和dapi染色法結(jié)果表明dm3001作用于egfr野生株a431細胞和t790m突變株h1975細胞，均可引起細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。同時dm3001對于h1975的誘導(dǎo)凋亡作用更顯著，證明其作用更專一。(4)細胞的遷移和侵襲實驗表明dm3001能夠強烈抑制h1975細胞和a431細胞。與rociletinib和osimertinib比較，同樣濃度下dm3001對h1975細胞侵襲能力的抑制作用更強，說明dm3001在抑制腫瘤細胞增殖的同時，還強烈抑制細胞的遷移。(5)westernblotting實驗表明，dm3001能夠顯著抑制egfr下游akt信號通路中相關(guān)蛋白的表達，隨著給藥濃度的依次增大，p-egfr、p-akt、p-erk表達水平依次下調(diào)，呈現(xiàn)出劑量依賴性；對h1975細胞的抑制作用優(yōu)于a431細胞，進一步在分子水平驗證了dm3001的選擇性更高。該化合物具有較強的抑制非小細胞肺癌(nsclc)細胞增殖能力，顯示出比rociletinib更加優(yōu)良的抗egfrt790m活性，且能夠作用于fak激酶。作為一類結(jié)構(gòu)新穎的分子，本發(fā)明中研究化合物具有開發(fā)成新型高效egfr和fak雙靶點抑制劑的潛力，對治療相關(guān)的腫瘤疾病尤其是非小細胞肺癌、小細胞肺癌有較大的應(yīng)用價值。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)先實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12